Summary
I denne videoen vil vi demonstrere modifisering teknikker for porøse metalliske implantater for å forbedre funksjonaliteten og for å kontrollere celle migrasjon. Teknikker inkluderer utvikling av pore gradienter for å kontrollere celle bevegelse i 3D og produksjon av basalmembran etterligner å kontrollere celle bevegelse i 2-D. Dessuten er en HPLC-basert fremgangsmåte for å monitorere implantat integrering in vivo via analyse av blod-proteiner beskrevet.
Abstract
Metalliske implantater, spesielt titan implantater, er mye brukt i kliniske applikasjoner. Vev-vekst og integrasjon til disse implantatene i vev er viktige parametere for vellykkede kliniske resultater. For å forbedre vev integrasjon, har porøse metalliske implantater under utvikling. Åpen porøsitet av metallisk skum er meget fordelaktig, siden pore områdene kan bli funksjonalisert uten å svekke de mekaniske egenskapene til hele strukturen. Her beskriver vi slike endringer ved hjelp av porøse titanimplantater basert på titan microbeads. Ved hjelp av iboende fysikalske egenskaper slik som hydrofobisitet av titan, er det mulig å få hydrofobe pore gradienter innenfor microbead baserte metalliske implantater og på samme tid å ha en basalmembran etterligner basert på hydrofile, naturlige polymerer. 3D pore gradienter er dannet av syntetiske polymerer slik som poly-L-melkesyre (PLLA) med fryse-ekstraksjonsmetoden. 2D nanofibrillar suroverflater er dannet ved hjelp av kollagen / alginat etterfulgt av en fornetning trinn med en naturlig tverrbinder (genipin). Dette nanofibrillar filmen ble bygget opp av lag på lag (LBL) deponering metode av de to motsatt ladede molekyler, kollagen og alginat. Til slutt, et implantat hvor ulike områder kan imøtekomme ulike celletyper, da dette er nødvendig for mange flercellede vev, kan fås. Av, denne måte cellulær bevegelse i forskjellige retninger ved forskjellige celletyper bli kontrollert. Et slikt system er beskrevet for det spesielle tilfellet at luftrøret regenerering, men den kan modifiseres for andre målorganer. Analyse av celle migrasjon og mulige metoder for å skape ulike pore gradienter utdypes. Det neste trinnet i analysen av slike implantater er deres karakterisering etter implantasjon. Imidlertid er histologisk analyse av metalliske implantater en lang og besværlig prosess, og dermed for overvåking vert reaksjon på metalliske implantater in vivo en enlternative metode basert på overvåking CGA og forskjellige blodproteiner er også beskrevet. Disse metodene kan brukes for å utvikle in vitro skreddersydde migrering og kolonisering tester og også benyttes for analyse av funksjonaliserte metalliske implantater in vivo uten histologi.
Introduction
For tiden tilgjengelige metalliske implantater er egnet for belastninger, men deres ikke-nedbrytbarhet nødvendiggjør design som sikrer et sterkt grensesnitt med vevet som omgir dem en. Ved å gi strukturer som letter cellulær-innvekst og kolonisering in vivo, kan levetiden av metalliske implantater bli forlenget 2. Åpenlyst porøse metalliske implantater er lovende materialer for vev-grensesnitt engineering og også for å sikre god kolonisering av implantater. De har vært aktivt brukt som ortopediske implantater og også som luftrør implantater 3-5. Det er imidlertid fremdeles problemer som må løses for eksempel nøyaktig kontroll over cellebevegelse i pore områder. Unnlatelse av å styre denne prosess kan føre til ufullstendig kolonisering i en ende og restenose i den andre. Også videre funksjonalisering av disse implantatene er nødvendig for å oppnå høyere funksjoner som for eksempel, levering av vekstfaktorer,rettet vascularization og samtidig bevegelse av ulike celletyper 6-8. For tracheal implantater, er dette særlig viktig ettersom kolonisering av implantatet med en vaskularisert vev er ønskelig. Imidlertid er ukontrollert vev-innvekst til lumen av luftrøret uønsket fordi den reduserer implantatet åpenhet.
En mulighet til å kontrollere celle bevegelse er størrelsen eksklusjon. Ved å kjenne størrelsen av målcellene og deres evne til å interagere med en gitt syntetisk polymer er det mulig å utvikle gradienter av porer som effektivt kan bestemme dybden av cellebevegelse. For eksempel ved å lage en pore arkitektur som er stort nok for oppføringen av bindevev-celler slik som fibroblaster extraluminally, men tilstrekkelig små (mindre enn 10 mikrometer) for å hindre deres bevegelse intraluminally en effektiv kontroll over kolonisering av en rørformet implantat kan oppnås.
Fra tilgjengelige pore opprettelse metoder som fryse-tørking ong, partikkel utvasking, gass skummende 9,10; lettest å tilpasse metoden for rask dannelse av pore gradienter med minimal mengde av nødvendig utstyr er fryse-ekstraksjon 11. I denne metoden blir en polymerløsning frosset i en binær blanding av et organisk løsningsmiddel og vann. Deretter blir oppløsningsmidlet utveksles via ekstraksjon av en blandbar pre-kjølt væske så som etanol. Frysing og ekstraksjonsbetingelsene bestemmer formen og størrelsen av porene, og hvis uttak er gjort på en måte hvor bevegelsen av ekstraheringsoppløsning som kan kontrolleres, kan pore-størrelse og form være retningsborede modulert.
Andre trinn for flercellede vev er dannelsen av porøse barrierer mellom ulike celletyper å kontrollere deres interaksjon. Dette er også nødvendig for tilgjengeligheten av ulike microenvironments for ulike celletyper avhengig av deres behov 12,13. Luftrøret er et rørformet organ som forbinder strupehodet med bronchjeg. Den har en indre pseudostratified ciliarepitelet fôr med interdispersed beger celler som produserer slim. 3D-strukturen og stabiliteten av trachea blir vedlikeholdt av brusk i form av C-ringer. Således, i en kunstig luftrøret bør det være en definert overgang mellom bindevev og Ciliary epitellaget. Mens en 3D-struktur er nødvendig for bindevev del, krever migrering av epitelceller en basalmembran-lignende overflate for å oppnå retningsbestemt bevegelse og lukking av såret. Polyelektrolytt flerlags filmer (PEM) er en mulig alternativ for å skaffe basalmembran etterligner. Lag-for-lag-metoden (LBL) er en allsidig fremgangsmåte for oppnåelse av tynne og funksjonelt overflatebelegg. Den er basert på elektrostatiske interaksjoner av to motsatt ladde polyelektrolytter, og deres varmeutvikling i en sekvensiell måte for å oppnå nanoskala overflatebelegg hvis egenskaper kan varieres ved ganske enkelt å endre variabler som polyelektrolytt arter, pH,lag nummer, tillegg av en tildekking lag, tverrbindende etc. En av de viktigste fordelene med LbL metoden er dens evne til å samsvare med topografien i underliggende substrat. Således, under kontrollerte betingelser av denne metoden kan også benyttes for å fremskaffe overflatedekning av porøse strukturer. Hvis kollagen blir brukt som en av de polyelektrolytter er det mulig å oppnå nanofibrillar strukturer som kan etterligne overflaten av basalmembran. Hydrofobisiteten av titan muliggjør utvikling av slike strukturer og fibrillarity kan bli bevart i tykke lag 14. På denne måten feste og bevegelse av celle på overflaten kan også bli kontrollert. Ved å benytte fryse-ekstraksjon og LbL filmbelegg sekvensielt, kan en struktur hvor celle bevegelse kan styres sideveis i lengderetningen og omkretsretningen fås 15.
Her beskriver vi to nye modifikasjon metoder for titan implantater ved å bruke deres hydrofobe atferd som kan væreutvidet til modifisering av forskjellige porøse implantater: i) dannelse av gradienter av mikroporer i de makroporøse titanimplantater med hydrofobe, syntetiske polymerer ii) dannelse av et tykt polymerisk film-sjikt på overflaten på implantatet som støtter cellevekst og foring dannelse av polyelektrolytt multilayers. Disse metoder kan benyttes sekvensielt eller separat. De gir strukturer som sikrer kontrollert migrasjon og romlig organisering av ulike celletyper i flercellede vev 16,17. For det konkrete tilfellet av luftrøret, ville det ønskede resultatet for implantatet være kolonisering av fibrovascular vev i Micropore gradienter uten restenose og dannelsen av den indre foring av ciliated epitelceller på polyelektrolytt multilayers.
En måte å kontrollere integrering av implantater er å gjøre små kirurgiske inngrep i løpet av deres integrering med verten in situ. For å være i stand to bestemme timing av tiltakene, er det viktig å ha informasjon om de systemiske effekter av implantatet. C-reaktivt protein (CRP) er blitt brukt til overvåkning av infeksjon og inflammatoriske respons i kliniske omgivelser. Kromogranin A (CGA) kan også benyttes på en lignende måte, og kan gi mer nøyaktige resultater for å observere graden av betennelse 18.. Som en mulig måte å observere metallisk implantat integrering in vivo, presenteres en fremgangsmåte for kontinuerlig overvåkning implantat systemiske virkninger etter karakterisering av dyreblod prøver med høytrykks-væskekromatografi (HPLC) og påfølgende protein-sekvensering. Nærmere beskrivelse av denne metode kan benyttes til å unngå vanlig ende-punkt histologisk analyse. Histologisk skjæring av metalliske implantater er en lang, tungvint og kostbar prosess og kan bare foretas på bestemte tidspunkter. På grunn av denne grunn, godt utformet blodprøver gi robuste informasjon om helse implantatet villevære mulige ruter for å redusere dyreforsøk som mandat av de siste EU-regler om dyreforsøk.
Metodene som presenteres her, kan brukes for å forbedre ytelsen til metalliske implantater via funksjonalisering, eller å ha en alternativ måte å overvåke de eksisterende implantater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Micropore overgangar i macroporous Metallic implantater
- Rens implantater (slik som implantater laget av medisinsk kvalitet titan-perler med en størrelse i området 400-500 um, Neyco SAS, Frankrike) med etanol og deretter sonicate i aceton i 15 min.
- Utvikling og produksjon Teflon støpeformer i henhold til implantatet størrelse og form (For standard forsøk, er sylindriske støpeformer av 1,5 cm diameter med en høyde på 2 cm brukes). Stanseverktøy bør være modulær, slik at de enkelte deler kan fjernes mens ekstraksjonen. En slik form utforming sikrer kontroll over gjenvinningen ved å tvinge bevegelsen av ekstraksjon fluid i en rettet måte.
- For rørformede implantater som skal erstatte luftrøret, bør konstruksjonen være sammensatt av tre deler: i) en nedre del for å bestemme størrelsen av implantatet, ii) en dor, og iii) en ytre kjerne som er avtagbar. På denne måten kan porestørrelsen gradient dannes fra utsiden mot innsiden. <li> Klargjør syntetisk polymer (PLLA) løsning: For fryse / utvinning PLLA løsning må være forberedt på en binær blanding av dioxane og vann (87:13%, v: v).
- Varm blandingen til 60 ° C for å oppnå en homogen løsning. 60 ° C velges som det er jo høyere grensen for temperaturen motstand for presisjon sprøyter av glass som må brukes for innføring av oppløsningen inn i nevnte implantater.
- Ved høy konsentrasjon (≥ 6%), høymolekylære PLLA løsninger brukes, innfører oppløsningen inn i implantatet etter oppvarming umiddelbart. Ellers gelering av løsningen skjer uten full neddykking.
- Beregn volumet av nødvendig polymer løsning med hensyn til porøsiteten til implantatet, kan for nøyaktighet endring i volumet av den frosne løsning tas i betraktning.
- Innføre løsningen i implantater med presisjon glass sprøyter med 0,1 mL nøyaktighet. Den nedre grense for polymerkonsentrasjonen er3% for reproduserbar pore gradient formasjon mens det blir vanskelig å oppnå homogen fordeling i de tykke sampler over 6%. Men for spesielle anvendelser andre konsentrasjoner kan brukes.
- Fryse prøvene enten direkte ved -80 ° C eller med tidligere inkubasjonsperiode på 30 min ved romtemperatur. Frysing forhold avgjør delvis poredannelse, og dermed for forholdene kan justeres i henhold til porøsitet rettet. Hold prøvene over natten ved -80 ° C.
- Utvinning: Fordyp implantater i 80% pre-kjølt EtOH. Utføre ekstraksjonen ved -20 ° C over natten. For å få porøsitet gradienter, fjerne alle mold deler bortsett fra stammen for de rørformede implantater og alle deler bortsett fra den nederste delen for disk formet implantater. Bruk en pre-kjølt skalpell for enklere deling av formen.
- Etter ekstraksjon ved -20 ° C over natten 19, fjerner du det gjenværende mold deler og lufttørke implantater. For karakterisering avden samlede porøsiteten av strukturen kvikksølv porosimeter analyse er nødvendig. Kvikksølv Porosimeter målinger viste tydelige topper som svarer til porene på begge sider av implantatet og de mindre interdispersed porene. Men de mer viktige data er forskjellen mellom de porøsiteter av intraluminale og extraluminal flater, som kan analyseres av Image J for porestørrelsesfordeling med et scanning elektronmikroskop (SEM) 20. For verifisering av pore gradient, fryse-fraktur prøvene og observere tverrsnitt med SEM.
- På grunn av den åpne porøse natur av implantater som brukes, og den lysreflekterende kapasiteten av titan, er det mulig å gjøre z-stabler av merkede celler i løpet av de porøse implantater. Merke celler med PKH26 eller Calcein-AM og visualisere implantater med confocal laser mikroskopi.
2. Surface Coating av Porøse Metallic implantater med kollagen / Alginat multilayers
- For oppbyggingav multilayers, er høyeste reproduserbarhet oppnås med dyppe roboter. Men hvis en dyppe robot er ikke tilgjengelig i disse trinnene kan gjøres manuelt.
- Bruk medisinsk karakter kollagen type I og natrium alginat. De optimaliserte konsentrasjonene er 0,5 g / l for hver i 150 mM NaCl i citratbuffer ved pH 3,8.
- Oppløs den kollagen-løsning over natten for å sikre homogeniteten av oppløsningen. Sure pH på 3,8 er nødvendig for stabil oppbygging av sjiktene som strukturen er ustabil før tverrbinding i nøytral pH.
- Deponere lag av en dyppe robot system ved å dyppe implantater inn kollagen og alginat løsninger alternativt. Nedfall tid er 15 min for hver påfølgende lag. Skyll strukturen i mellom avsetning trinn med 150 mM NaCl ved pH 3,8 i 5 min.
- Design spesifikk holder for utnyttelse av implantater med dyppe roboter brukes i polyelektrolytt flerlags produksjon. Avsette lagene på overflaten av enten titan bare implants eller implantater endret som beskrevet i punkt 1.
- Stabilisering av basalmembran etterligne med genipin: Fremstill tverrbindingen oppløsning i en Dimetylsulfoksid (DMSO) / citrat-buffer (150 mM NaCl, pH 3,8) ved 01:04 V: V-forhold. Et bredt spekter av konsentrasjoner kan anvendes og 100 mm er tilstrekkelig for tverrbinding. Oppløse genipin først i DMSO komponent og tilsett vannet komponenten senere for å unngå klumper.
- Crosslink prøvene ved nedsenking i tverrbindende løsning mellom 12-24 hr. Deretter skylles med rikelige mengder citrat-buffer (pH 3,8).
- Etter vasketrinnene, sterilisere prøvene enten med UV-behandling (30 min) eller et antibiotisk / antimykotisk bad (Penicillin / Streptomycin, Fungizone).
- De viktigste parametrene som bestemmer kvaliteten av basalmembranen etterligne er dens tykkelse og diameteren av fibrene. Beregn fiberdiametre hjelp atomic force mikroskopi (AFM) bilder innhentet i kontakt modus. Tørk prøvene med ennitrogen flyt før bildebehandling. Tallfeste tykkelse på minst 10 fibre pr bildet for å bestemme den gjennomsnittlige tykkelse fibril med Image J programvare.
- Tykkelsen av filmene kan bestemmes ved scratch tester ved hjelp av AFM. Tørt (COL / ALG) 24 / COL flerlags filmer. Bruk en sprøyte nål for å lage riper i filmen. Etter lokalisering av scratch med et lysmikroskop, ta bilder med AFM på 10 x 10 mikrometer to flater på grensen av scratch. Beregn høydene fra profilene oppnådd med AFM programvare, som gir tykkelsen av filmlaget.
3. Indirekte Overvåking av Implant Integrasjon In vivo ved analyse av blodplasma
- Alle nødvendige komité godkjenninger bør tas for dyreforsøk i henhold til de styrende regler for hvert land 21. I vårt tilfelle Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (National Research Council, 2010) blir fulgt og the godkjenning av Universitetet i Strasbourg etikk komité oppnås.
- Gjennomføre implantasjon på målet stedet. Blodet overvåking protokollen gitt her ble brukt for tracheal utskifting i New Zealand hvite kaniner av en 15 mm tracheal reseksjon.
- Etter implantasjon en daglig oppfølging er nødvendig slik som montioring den generelle trivsel for dyrene (healing rundt de kirurgiske områder, frekvensen av pusting) og innspilling av deres vekt.
- Å validere blodprøve, bruk en veletablert metode som ELISA tester for blod CRP nivåer. CRP tester for mange dyr er tilgjengelig og spesifikk test som brukes for kaniner er oppført i tabell 1. Tilsvarende bruker western blotting for bestemmelse av CGA nivåer. Monoklonale anti-CGA antistoffer (anti-CGA 47-68) ble brukt i denne protokollen.
- For plasma karakterisering, innhente blodprøver fra auricular årer av kaninene. Sentrifuger ved 5000 rpm i 20 min ved 4 °; C. Bruk supernatanten oppnådd for analyse. I prosedyren vår, er disse testene gjøres på en ukentlig basis, men hyppigere tester er også mulig.
- Revers fase HPLC-rensing på plasma proteininnhold: Pakk den kanin plasma med 0,1% trifluoreddiksyre (01:01, v: v). Rens det ekstrakten ved hjelp av en Dionex HPLC-system (ultimate 3000, Sunnyvale, CA USA) på en Nucleosil revers-fase 300-5C18-kolonne (4 x 250 mm, partikkelstørrelse 5 um, porøsitet, 300 Å).
- Ta opp absorbansen ved 214 og 280 nm. Oppløsningsmidlet som benyttes er i) Oppløsningsmiddel A: 0,1% (v / v) trifluoreddiksyre (TFA) i vann og ii) Oppløsningsmiddel B: 0,09% (volum / volum) TFA i 70% (v / v) acetonitril-vann.
- Bruk en strømningshastighet på 700 mL / min ved hjelp av gradienter for elueringer. Samle Toppfraksjonene. Konsentrer fraksjonene ved fordampning av speed-vakuum søknad. Det er viktig å stoppe hastigheten-vakuum før fullstendig tørrhet.
- Korrelerer toppene innhentet på ulike tidspunkter over coUrse av implantasjon perioden. Bruk de rensede peptider som viser konsistente trender i løpet av implantasjon for identifikasjon ved automatisk Edman-sekvensering.
- Automatisk Edman-sekvensering av peptidene: bestemme den N-terminale sekvens av de rensede peptider, med automatisk Edman-degradering ved hjelp av en Procise microsequencer. Laste prøven til polybrene-behandlede glass-fiber filtre. Neste trinn er å identifisere Phenylthiohydantoin-aminosyrene (PTH-Xaa) ved kromatografi på en C-18 kolonne (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Etter at sekvensen er oppnådd, kan det bli identifisert ved hjelp av programvare Blast Swiss-Prot-databasen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dannelse av pore gradienter
Ved å forandre konsentrasjonen av PLLA-løsning, er det mulig å kontrollere størrelsen av porene på extraluminal side av implantater. Porestørrelse og formen ble signifikant påvirket av tilstedeværelsen av titanimplantater (figurene 1a og 1b). Porestørrelser varierte 40-100 mikrometer og utnyttelse av lavere konsentrasjoner resulterte i mindre porer. Mens, i den intraluminale side porestørrelse ble styrt av den begrensede ekstraksjon og var rundt 9 mikrometer 23, mindre enn den gjennomsnittlige størrelsen på fibroblaster. Ved tilsetning av et inkubasjonstrinn ved romtemperatur en dobbel porøs struktur, hvor pore veggene av de større porer har sin egen porøsitet kan oppnås. Denne funksjonen er viktig for tykke implantater, som det ville lette gass-og næringsstoff bevegelse (figur 1c).
Nanofibrillar basalmembran-etterligne dannelse
(figur 2). Denne filmsjiktet er stabil på toppen av PLLA skum, og det kan også bli opprettholdt på overflaten i fravær av skum (figurene 3A og 3B). Nanoskala kollagenfibre dannes som filmen laget vokser (Figur 3c). Veksten av filmen er eksponensiell, og dermed en tykk film av flere hundre nanometer kan oppnås (figur 3d).
Analyse av blodplasma med HPLC og påfølgende sekvensering etter implantering
Porøse titanimplantater integreres med vertsvev og er helt fylt mellom 4-6 uker in vivo (figur 4). Imidlertid kan fortsettelse av denne prosess fører til restenose og i nærvær av pore gradient på grunn av PLLA struktur, ble det ikke observert en fibroblast nærværfter seks uker etter implantasjon 20. I løpet av denne perioden HPLC-analyse viste tydelige topper som svinger i løpet av tidsforløpet for implantasjon. Toppfraksjonene av interesse er sekvensert og fast bestemt på å være alfa og beta hemoglobin ½ kjeder (figur 5), som hadde vist en lignende trend med CRP målinger.
Figur 1. Metode for pore gradient formasjon. Utarbeidelse av porøse PLLA skum via fryse-utvinning metoden. SEM mikrografer (A) uten makroporøse titan implantater (ytre) (B) med makroporøse titan implantater (ytre) (C) med makroporøse titan implantater (indre). Tilstedeværelse av implantater forandret den pore morfologi. (C, D) Samme prosess kan være Appl IED til rørformede strukturer for å få pore gradienter i rørformede implantater. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Reaksjonsskjema av den multifunksjonelle implantatet utvikling. Start fra microbead baserte porøse implantater, ved tilsetning av en syntetisk polymer basert skum en porestørrelse gradient kan oppnås. Formen på gradienten er pore delvis kontrollert av strukturen i formene. På toppen av denne strukturen en basalmembran-lignende struktur kan tilsettes, som ville gi en egnet overflate for cellebinding og foring formasjon i 2D.
pload/50533/50533fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50533/50533fig3.jpg "/>
Figur 3. Nanofibrillar Multilayer formasjon på titan implantater som en basalmembran mimick. Tykke Kollagen / Alginat multilayers kan dannes spesifikt på overflaten av (a) Titanium bare implantater (med en gjennomsnittlig perle størrelse på 400-500 um) (b) Titan / PLLA skum hybrider. Denne overflaten (~ 1 mikrometer tykke) gir et substrat for feste og proliferasjon av endotelceller (C) nanofibrillar arten av de multilayers er karakterisert ved AFM-analyse (Scan-området: 30 um x 30 um) (D) tykkelse multilayers bestemmes av scratch test. Klikk her for å se større figur .
jpg "/>
Figur 4. Integrering av porøse titan implantater i-vivo i kaniner. Haemotoxylin & eosin farging av eksplantert implantat-tverrsnitt (A) De porøse områder kan fylles fullstendig innen en periode på 4-6 uker in vivo (B) Et vev i porene er en modent bindevev med en god grad av vaskularisering .
Figur 5. Overvåking av proteininnholdet i plasma i løpet av en implantasjon ved HPLC og påfølgende sekvensering. De representative HPLC-kurvene viser toppene oppnådd fra blodprøver av dyrene etter 3, 4 og 6 uker etter implantasjon henholdsvis (øverst til venstre, øverst til høyre, nederst til venstre ). Hver topp tilsvarer en bestemt protein. Forskjellenei toppen korresponderer til relative overflod av et gitt protein, som kan bestemmes ved sekvensering (f.eks α og ß-hemoglobin ½ kjeder). klikk her for å vise større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pore gradienter er viktige verktøy i grensesnittet tissue engineering og systemet som beskrives her kan brukes alene eller sammen med metalliske implantater for å danne pore gradient å studere celle migrasjon. Systemet ikke nødvendiggjøre noen ekstra innstilling eller ekstra utstyr bortsett fra et avtrekksskap å håndtere organiske løsemidler, slik at det kan brukes i biologi laboratorier. Lignende polymerer slik som poly (glykolsyre) (PGA), poly (melkesyre-ko-glykol) syre (PLGA) og poly (kaprolakton) (PCL) kan anvendes med små modifikasjoner. Andre makroporøse strukturer som ikke ville løses opp i organiske oppløsningsmidler kan også benyttes. For å oppnå mindre porestørrelser (på nanoskala) på en overflate, er en ekstra tynn nanoporøse filmsjikt formasjon også mulig. Dette kan oppnås ved først å sette en fortynnet oppløsning (1%) av polymeren på toppen av strukturen i et meget flyktig løsningsmiddel (slik som kloroform) og deretter umiddelbart å forårsake faseseparasjon ved nedsenking i apure etanol løsning. På denne måten en ko-kultur-system som er basert bare ett materiale kan oppnås.
Den Teflon mugg design er avgjørende for kontroll av den porestørrelse som bevegelsen av ekstraksjonsrøret fluidet bestemmes av dette. Bevegelsen av ekstraksjon væske og kursen mellom ekstraksjon væske og løsningsmiddelet påvirke dannelsen av porer. Kontrollen kan ytterligere forbedres ved anvendelse av laminær strøm av ekstraksjonsrøret fluid gjennom implantatet. Mengden av væske ekstraksjon er en viktig parameter, og det bør være slik anordnet i forhold til mengden av polymer som anvendes, og også med hensyn til størrelsen av implantatet. For sylindriske implantater med 2 mm tykkelse og 11 mm diameter dannet av 500 mikrometer medisinsk kvalitet titan perler en ekstraksjon bad på 200 ml er nødvendig. For å studere celle migrasjon, er PKH26 et bedre alternativ for langsiktige migrasjon studier mens Calcein-AM gir en bedre observasjon av cellemorfologi. Quantification av celle bevegelse i Z-retningen er en indirekte in vitro måling av kontroll over cellulær bevegelse. Også dette system kan brukes sammen med endotelceller for kvantifisering av in vitro-vaskularisering av implantater, enten ved direkte såing, eller ved bruk av standard angiogenese-analyser ved hjelp av gel innkapsling 24..
Det er flere tilgjengelige nanofiber dannelse metoder som elektrospinning eller faseseparasjon, men electrospinning av kollagen er generelt ansett å denaturere kollagen fibriller. Utnyttelse av en polyelektrolytt basert struktur sikrer forhindring av denaturering samtidig som den gir den nødvendige fibrillær struktur med høy grad av presisjon. Også LBL metoder er lettere å tilpasse seg for komplekse implantat former. Folielag på porøse strukturer er enkle metoder for å utvikle Transwell-lignende analyser med mer kontroll over samspillet mellom de cellulære komponenter. Det er mulig å observere med confocal mikroskopi det øverste laget på implantatet. Dette kan brukes til å observere interaksjonen av aktuelle primære celler med multilayers som er i kontakt med implantatet slik som epitelceller, eller endotelceller. Den ene metoden 25 eller kommersielt tilgjengelige celler kan brukes. Denne filmen laget gir en overflate der et indre fôr for en rørformet organ kan utvikles. For eksempel, i dette spesielle tilfelle var målet å utvikle en kunstig membran for luftrøret, og denne struktur er vist å være egnet for respiratorisk epitel 23..
Tykkelsen av laget er satt på et nivå hvor filmen er tykk nok til å fungere som en barriere (24 bi-lag). Både titan og titan bare / PLLA implantater, på grunn av hydrofobisiteten til substratet en forholdsvis flat film kan dannes på implantater, hvor porene bidra til stabiliteten av grensesnittet mellom strukturen og den nydannede filmlaget. Blant de tilgjengelige tverrbindingen megdikk, er genipin fornetning mest egnet for dyr eksperimenter. Andre tverrbindende metoder slik som glutaraldehyd, kan EDC / NHS også brukes, men de vanligvis resultere i mindre celleadhesjon. En annen mulighet er å bruke photocrosslinkable kollagen 26.
Proteinsekvensering er en lovende metode for implantat overvåking, da det kan gi mer dyptgående forståelse. I henhold til arten av de proteinene som ble oppnådd, er det mulig å utlede de systemiske virkningene av implantasjon og også nøye overvåke mulige infeksjoner som er spesielt viktig for de tilfeller hvor implantatet ikke er i et forseglet område, for eksempel i tilfelle av tracheal implantater . Tidlig påvisning av infeksjoner kan føre til forebygging av smitte-relaterte komplikasjoner på en riktig måte. HPLC-profilen kan gi mer informasjon i forhold til enkelt karakterisering av et gitt protein som CRP CGA eller som flere topper med flere proteiner av interesse kan være oppnåed hjelp av denne metoden. For eksempel har alfa-og beta hemoglobin ½ kjeder for kaniner med luftrør implantater vist lignende tendenser med CRP målinger i vår fulle tracheal erstatning modell. Slik allsidighet ville gi en arena for fastsettelse av minutt systemisk effekt med stor nøyaktighet med forbedring av teknikkene som beskrives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NE Vrana er ansatt i Protip SAS.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Andre Walder og Nicolas Perrin for produksjon titan implantater, K. Benmlih for oppbyggingen av Teflon muggsopp og Dr. G. Prevost for hans hjelp med dyreforsøk. Vi erkjenner også at regionen Alsace og PMNA (Pole Materiaux et Nanosciences d'Alsace) for økonomisk bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization - Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid - liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
