Summary
Ateroskleros är en kronisk inflammatorisk process. Detta manuskript illustrerar en lättanvänd ex vivo-modell för att undersöka färsk carotid eller kranskärls plack. Den ex vivo modell möjliggör undersökning av potentiella ämnen på inflammatorisk miljö i humana aterosklerotiska lesioner och resultat kan analyseras med olika förfaranden.
Abstract
Ateroskleros är en kronisk inflammatorisk sjukdom i vaskulaturen. Det finns olika metoder för att studera den inflammatoriska föreningen i aterosklerotiska lesioner. Mus modeller är ett viktigt verktyg för att undersöka inflammatoriska processer i aterogenes, men dessa modeller lider av de fenotypiska och funktionella skillnader mellan mus och människans immunförsvar. In vitro cellförsök används för att specifikt utvärdera celltyp beroende förändringar orsakade av en substans intresse, men kulturberoende variationer och oförmågan att analysera påverkan av specifika molekyler i samband med den inflammatoriska föreningen i aterosklerotiska lesioner begränsa påverkan av resultaten. Dessutom att mäta nivåerna av en molekyl av intresse i humant blod hjälper till att ytterligare undersöka dess kliniska relevans, men detta representerar systemiska och inte lokal inflammation. Därför, här beskriver vi en plakett kulturmodell för att studera människans aterosklerotisk skada biologiex vivo. Kort sagt, färska plack som erhållits från patienter som genomgår endarterectomy eller koronar bypass-kirurgi och lagras i RPMI medium på is tills användning. De provbitar skärs i små bitar följt av slumpmässig fördelning i en 48-brunnar, innehållande RPMI medium i tillägg till en substans av intresse, såsom cytokiner och kemokiner ensamma eller i kombination för angivna tidsperioder. Efter inkubation, kan plack styckena chock frysas för mRNA-isolering, inbäddad i paraffin eller oktober för immunohistokemi färgning eller krossade och lyseras för Western blotting. Vidare kan celler isoleras från plack för flödescytometrianalys. Dessutom kan supernatanter samlas upp för proteinmätning genom ELISA. Sammanfattningsvis öppnar presenterade ex vivo-modell möjlighet att ytterligare studera inflammatoriska lesional biologi, vilket kan leda till identifiering av mekanismer nya sjukdoms och terapeutiska mål.
Introduction
Ateroskleros som en kronisk inflammatorisk sjukdom som är en av huvudorsakerna till dödsfall i industriländerna 1-2. Komplikationer av åderförkalkning, speciellt akuta koronara syndrom, har kopplats till bristningar i utsatta lesioner, vilket orsakar aterotrombos och kärlocklusion 3. Medfödd och adaptiv immunitet verkar vara inblandade under alla faser av aterogenes 2,4-5. Även om betydande framsteg har gjorts i behandlingen av hjärtinfarkt, effektivt förebyggande av åderförkalkning och negativa kardiovaskulära händelser är fortfarande olöst. Således studerar lesional biologi är viktigt för att öka vår kunskap om patofysiologin vid åderförkalkning och att möjliggöra identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av nya behandlingsmetoder.
I många fall används murina modeller använts för att undersöka patofysiologin för specifika sjukdomar. Men studerar aterogenes använda musmodeller är accompanied av flera begränsningar: (1) Vanligtvis aterosklerotiska möss får en hög kolesterol diet. De kolesterolnivåer i dessa modeller kan inte jämföras med dem hos patienter med förhöjda kolesterolserumnivåer 6. (2) Det finns betydande skillnader mellan murina och humana immunsystemet; alltså foxp3 är en specifik markör för murina regulatoriska T-celler, medan mänsklig foxp3 uttryck i humana T-celler inte nödvändigtvis ger en reglerande fenotyp 7. Dessutom är Th1/Th2 paradigm såsom definierats i människor inte helt överföras till murina T-celler. (3) Ett antal markörer som används för att identifiera murina monocyter och makrofager såsom F4/80 och markörer för klassisk (M1) vs alternativ (M2) aktiveringsmönster finns inte i humana myeloida celler 8. (4) Gene expression av murina och humana perifera blodmonocyter har befunnits vara väsentligen annorlunda 9.
Således, för att öka förståelsen förkroniska inflammatoriska processer i mänsklig åderförkalkning, vi måste använda modeller som arbetar med mänskliga vävnader, blod och celler. Här beskriver vi en modell av mänsklig plack vävnadskultur, vilket möjliggör undersökning av potentiella nya ämnen i begreppet mänsklig inflammatorisk lesional biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered medel enligt följande
- Odlingsmedium: RPMI-medium.
- Lägg 10% fetalt kalvserum (FCS).
- Addera 100 U / ml penicillin G, och 100 g / ml streptomycin.
2. Förvaring av färsk plack cylinder fram till användning
- Den halspulsådern endarterectomy operation av patienter med eller utan ischemiska symtom (stroke, övergående ischemisk attack) med en betydande halspulsådern stenos kommer att utföras av kärlkirurger och kranskärls endarterectomyen under koronar bypass-kirurgi av hjärtkirurger. Carotid / koronara plack måste avlägsnas en bloc att bevara plack struktur såsom beskrivits tidigare 5.
- Efter plack extirpation plats förlagan i ett medium fyllt rör och lagra den på is (plack måste vara helt täckt med medium) fram till användning.
3. Plack bearbetning
- Använd ett lämpligt cellodlingsskål (t.ex. 60 mm)och tillsätt 5 ml RPMI medel.
- Placera plackvävnaden i odlingsskålen (plack bör vara helt täckt med medium).
- Håll plackvävnaden försiktigt vid kanterna av vävnaden med hjälp av steril pincett.
- Skär av kanterna på den plackprov genom användning av en steril skalpell.
- Dela plackvävnad i hälften.
- Bedöm lesion morfologi makroskopiskt (förkalkade, lipid rik, brusten, trombos, fibros).
- Analysera exakt plackmorfologi efter ex vivo experiment med immunohistokemi. Använd AHA klassificering 10.
- Släng plack med svår förkalkning eller fibros.
- Skär plackvävnad i homologa små bitar (3 x 3 x 3 mm).
- Shock frysa två platta bitar och förvara dem i flytande kväve för grundläggande värderingar lesionen fram till användning.
- Bered en 48-brunnsplatta.
- Tillsätt 500 | il RPMI-medium till varje brunn, användes för experimentet.
- Använd ent minst två plack stycken för varje grupp.
- Lägg till innehållet i ränte (t.ex. specifika cytokiner och kemokiner).
- Använd ostimulerade plack bitar som kontroller.
- Slumpmässigt plantera disponeras antalet plack bitar i brunnarna.
- Kultur plack stycken för angivna tidpunkter.
- För plackvävnaden stimulering experimentera med lipopolysackarid (LPS)
- Använd följande tidpunkter: 3 tim, 8 tim och 24 tim.
- Använd 2 plack stycken för LPS och två för ostimulerade gruppen för varje tidpunkt respektive.
- Lägg 1 pg / ml lipopolysackarid.
- Under inkuberingen, bibehålla 48-brunnsplatta vid 37 ° C i fuktad luft innehållande 5% CO2.
4. Efter angivna tids skörd plack vävnadsbitar
- Shock frysa plack stycken för mRNA-isolering och cDNA-syntes (för detaljerad information-se protocol avsnitt 5).
- Samla upp supernatanten och lagrades den vid -20 ° C i ELISA-analys.
- För western blotting, krossa och lysera plackvävnad. Filtrera lysatet genom ett 0,65 | im och 0,1 fim centrifugal filterenhet.
- Bädda plackvävnad i vävnad-tec eller paraffin för immunohistokemi färgningar.
5. RNA-extraktion från odlade plack bitar
- Använd en TissueLyser för homogenisering.
- Isolera RNA genom användning av kit (se material tabell) enligt tillverkarens instruktioner.
- Bestäm RNA kvantitet och kvalitet av proverna med spektrofotometer.
- Använd Boehringer cDNA kit för omvänd transkription enligt tillverkarens anvisningar.
- För kvantitativ PCR, använd exempelvis Roche realtids-PCR-kit med SYBR Green.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi ett antal figurer som visar resultaten av ex vivo plack odling. För att bedöma förändringar i den inflammatoriska miljön som svar på agenten av intresse för ex vivo-modell experiment mäter vi olika molekyler som är kända för att vara primärt involverad i aterogenes. Som representativa pro-atherogenic cytokiner vi väljer TNFa, IL6 och IFNg 2,11. Dessutom använder vi von Willebrand-faktor och vävnadsfaktor för att utvärdera pro-trombotiska ändringar. Dessutom, för att ta itu med utvecklingen av plack instabilitet framkallad av en agent av intresse, matris metallopeptidas 9 (MMP9) nivåerna kommer att analyseras. Chemoattractance är också ett viktigt steg i plack progression och regression 11, alltså, vi undersöker halterna av CCL2, även kallat monocytkemotaktiskt protein-1 (MCP-1), principen chemoattractant för monocyter / makrofager. Efter cell attraktion cell rullning och vidhäftning är följande steg.På grund av att vi väljer ICAM-1. Genom att ytterligare analysera de signalvägar som påverkas av innehållet i ränta använder vi cellulära signalreglerade kinaser (ERK1 / 2), allmänt uttryckt och aktiveras av många olika stimuli såsom cytokiner, apoptos, differentiering, virusinfektion och ligander för heterotrimera G-protein kopplade receptorer 12.
Först visar vi beroende tidsförändringar av den inflammatoriska föreningen ostimulerade odlade aterosklerotiska lesioner, analyseras av kvantitativa realtid-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) (Figur 1). Under plack odling, kan observeras en ökning av aktiviteten i den inflammatoriska lesionella miljö. Ingen skillnad hittades efter 3 h vs ingen kultur (data ej visade). Efter 8 h av plackkulturen, fann vi endast en svag uppreglering av vissa molekyler såsom IL6, men inte av TNF-a och IFN-g, under det att efter 24 timmar, fanns det en uppregleringav olika molekyler såsom TNF a, IL6 och IFN g. Noterbart är, desto längre tid av plackkulturen ju högre variation av molekyl uttryck är.
För det andra, för att visa på möjligheterna att påverka den inflammatoriska miljön i aterosklerotiska lesioner, presenterar vi resultatet av plack stycken inkuberade med 1 mikrogram / ml LPS för 3 timmar, mätt med QRT-PCR (Figur 2). Ostimulerade plack bitar tjänade som en negativ kontroll . Vi fann att LPS inducerade en markant ökning av graden av aktivering av inflammatoriska förening inuti aterosklerotiska lesioner. Olika cytokiner (IL6, TNF-a etc., figur 2A-B), kemokiner (CCL2 etc., visas ej), friktion (ICAM1, visas ej), plack destabiliserande (Matrix metallopeptidas 9 (MMP9), visas ej) och pro- trombotiska molekyler (von Willebrands faktor, fig. 2C, För det tredje, för att utvärdera protein överflöd, var supernatanter av odlade lesioner analyseras med ELISA och krossade plackvävnad genom western blotting (Figur 3D). I fig. 3A-C visar vi ELISA-analys av IFN-g, MCP-1 och TNF-a i supernatanten av odlade prover inkuberade med LPS eller kontroll efter 8 timmar. Dessutom, western blot-analys för (fosforylerat) ERK 1/2 av krossade och lyserplackvävnad, antingen stimulerade med LPS eller kontroll, visas i figur 3D. 
Figur 1. Effekt av plack odling på den inflammatoriska lesionella förening med tiden. Aterosklerotiska plack bitar omedelbart chock frysta eller odlade för 8eller 24 h och expression av angivna cytokinerna IL6 (A), IFN-g (B) och TNF-a (C) analyserades med QRT-PCR. De visade resultaten representerar medelvärdet av fem oberoende experiment. Fem aterosklerotiska lesioner stycken för varje grupp användes för angiven tidpunkt. Värdena är normaliserade till b-aktin och uttryckt som cDNA-kopior / 1000 b-aktin kopior. Resultaten visas som lådagram visar medelvärde och 25: e och 75: e percentilerna som lådor och 10: e och 90: e percentilen som morrhår. *: P <0,01. 
Figur 2. LPS-stimulering av odlade plackbitar inducerade en ökning av olika inflammatoriska molekyler. Plack bitar inkuberades med 1 | ig / ml LPSeller icke-stimulerade under 3 timmar och analyserades med QRT-PCR. De visade resultaten representerar medelvärdet av fem oberoende experiment. Två stycken för varje grupp användes. Värdena är normaliserade till b-aktin och uttryckt som cDNA-kopior / 1000 b-aktin kopior. Resultaten visas som lådagram visar medelvärde och 25: e och 75: e percentilerna som lådor och 10: e och 90: e percentilen som morrhår. *: P <0,01. 
Figur 3. Protein uttryck i supernatanten av odlade plack. Representant ELISA-mätningar av cytokiner IFN-g (A), TNF-a (B) och MCP-1 (C) i supernatanten av plack bitar som behandlats med LPS eller ostimulerade för 8 hr visas. De visade resultaten representerar medelvärdet av fem oberoende experiments. Resultaten visas som lådagram visar medelvärde och 25: e och 75: e percentilerna som lådor och 10: e och 90: e percentilen som morrhår. Dessutom representativ western blotting för (fosforylerade) ERK 1/2 av LPS-stimulerade eller kontrollera odlade aterosklerotiska lesioner efter 3 tim visas i fig. 3D. De kolumn stapeldiagram visar medelvärdet + SEM som whiskers representerar ett genomsnitt av fem oberoende försök. *: P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett ex vivo plack kultur modell för att undersöka påverkan av potentiellt relevanta ämnen på aterosklerotisk skada biologi. Den stora fördelen med denna ex vivo-metoden är förmågan att utvärdera inverkan av angivna substanser på inflammatoriska celler och deras cellulära samspel samt inflammatoriska vägar och kaskader i humana aterosklerotiska lesioner. Flera användbara metoder (t.ex. RT-PCR, western blot, immunhistokemi, flödescytometri, ELISA) bidrar till att ge en heltäckande analys av effekterna av substansen av ränta på aterosklerotisk skada inflammation.
De inflammatoriska processer i murina ateroskleros är väl förstått, även tack vare musmodeller överuttryck eller saknar vissa gener av intresse 11. Men resultaten inte alltid nära motsvara människor 6-9,13. Aterosklerotiska möss får oftast en patologisk hög Cholesterol diet 6. Dessutom är det känt att immunförsvaren mellan människor och möss visar väsentliga skillnader 7-9. Här presenterar vi ett ex vivo plack kultur-modell, vilket gör det möjligt att studera påverkan av ett ämne av intresse för den inflammatoriska förening i humana aterosklerotiska lesioner som visas av Niessner et al. 14. Dessutom kan olika kompletterande metoder användas för att analysera resultaten av en plakett kulturexperiment, jämförbar med murina studier. Därför öppnar ex vivo-modell möjligheten att ersätta mus in vivo studier i vissa fall och kan utgöra en utmärkt bryggmetod mellan en förmodad åderförkalkning främjar molekyl i murina systemet och översättning till människans biologi.
Den ex vivo-modell mänsklig för åderförkalkning är inte jämförbart med in vitro cellförsök. Cellinjer kan lätt lagras och odlas, men är fenotypiskt och functionally inte identiska med primära celler. Färska celler kan erhållas genom regelbunden bloddragningar, men det är ibland mycket svårt att odla dem och kulturen utsätts för många faktorer. Dessutom, genom att använda i cellodlings vitro-experiment, är det inte möjligt att undersöka inverkan av specifika molekyler på den inflammatoriska föreningen i aterosklerotiska lesioner. Således, in vitro-försök är viktiga för initial (translationell) steg för mänsklig biologi undersökningar, men misslyckas med att ytterligare analysera rollen av molekylen av intresse i begreppet mänsklig åderförkalkning, speciellt cell samspel och påverkan på inflammatoriska kaskader och väg inom aterosklerotiska lesioner .
Monaco et al. Etablerat en viktig kortfristig kultur system av celler som isolerats från human aterosklerotisk vävnad 15. De har använt en enzymatisk blandning av kollagenas, elastas och DNas. Denna metod tillåter undersökning av Lesional cell-cellförsök, signalvägen analys och genöverföring studier med adenovirusvektorer. Men det är fortfarande okänt hur den enzymatiska blandningen påverkar cellerna, dvs grad av aktivering, ytmarkör uttryck etc. Dessutom kan det ifrågasättas om resultaten av dessa experiment återspeglar de verkliga processer inuti aterosklerotiska lesioner. Dessutom kommer den ursprungliga placeringen av cellerna förstöras av den enzymatiska blandningen och den kortsiktiga kultur-systemet har samma begränsningar som de vitro cellförsök i.
För specifika cell eller cellpopulationsstudier inuti en aterosklerotisk skada, är det möjligt att använda laser fånga mikro dissektion metod. Cellen eller cell föreningen av intresse kommer att klippas ut ur vävnaden genom användning av en infraröd-eller UV-laser och RNA, DNA eller proteinanalys kan utföras. Lasern capture micro dissektion verkar inte skada cellerna, cellytereceptorn expression etc. Fördelen med metoden är att analysera en cell eller en placering av intresse inuti en aterosklerotisk lesion. Men det är inte möjligt att ytterligare utvärdera cellerna såsom in vitro-studier.
Den ex vivo-modell blandar in ett brett spektrum av möjliga metoder för att mäta och analysera resultaten. Realtidspolymeraskedjereaktion kan utföras efter RNA-isolering och cDNA-syntes för att undersöka genuttryck nivå såsom visas genom Niessner et al. 14. Immunohistokemi är ett etablerat verktyg för att utvärdera proteinnivå för att bevisa proteinuttryck och cellulära ursprung inuti aterosklerotiska lesioner. Western blotting kan användas för att analysera signalvägar. Dessutom cellisolering genom rötning i en enzymlösning öppnar möjligheten att utföra flödescytometri analys för att ytterligare analysera till exempel celltyp, cellulära subtyper och grad av aktivering. Vidare, efter att cellisoleringspectratyping utgör en bra metod för att ytterligare analysera T-cellsreceptor variabilitet. Dessutom, efter rötning magnetisk cellisolering är en beprövad högkvalitativ metod för cellseparation av specifika cellulära subtyper för ytterligare in vitro studier eller microarray analys. Äntligen kan supernatanter samlas för proteinmätning med ELISA. Sammanfattningsvis är det ex vivo-modell ett värdefullt verktyg för att undersöka de exakta förändringarna i den inflammatoriska miljön i humana aterosklerotiska lesioner.
Den ex vivo modell bygger på endarterectomyen prover. Användning av aterosklerotisk plack som erhållits från olika individer kan resultera i en högre grad av differentiell cellulära sammansättning och därmed högre variation av halterna av gener / proteiner av intresse. Således är det viktigt att använda de fettrika eller komplicerade plackprover stället fibrosclerotic lesioner 10, eftersom det inflammatoriska svaret är markant lägre i fibrosclerotic lesions. Därför är det av stort intresse att utvärdera plackmorfologi innan analysera resultaten av plackkulturexperiment.
Dessutom, varje exemplar prov omfattar olika stadier av aterosklerotisk skada utveckling / progression, från den initiala endoteldysfunktion och lipidackumulering steg, mot fettstrimmor och utveckling av en nekrotisk kärna till brustna plack. Således, för att minimera det heterogena plack-vävnad är det nödvändigt att skära kanterna, som i allmänhet representerar tidiga stegen av aterogenes.
Det kan inte uteslutas att skär framkallar vävnadssvar skada. Men våra plack vävnadsodlingsexperiment visade jämförbara genuttryck nivåer av de odlade plack vävnader till icke-odlade plack vävnader. Därmed understryker detta att den nuvarande metoden är ett bra verktyg för att undersöka den inflammatoriska miljön i aterosklerotiska lesioner.
Kulturen avplack bitar är begränsad till en tidsperiod på upp till ett dygn. Om plack vävnad odlas mer än en dag, variationen av de resultat ökar dramatiskt. Dessutom, efter tre dagar plack sammansättning och morfologi kollapsar.
Det finns begränsningar som måste hållas i åtanke vid tillämpningen av denna modell. Den ex vivo-modell är en bra metod för att studera inflammatorisk miljö i aterosklerotiska lesioner. Ändå är huvudkomponenter saknas i detta sammanhang. Inga hemodynamiska funktioner är tillämpliga och systemiska influenser är helt saknas. Dessutom är det med denna metod endast möjligt att undersöka kortsiktiga förändringar, men saknar en långsiktig analys på grund av kollapsen av plack morfologi.
Avslutningsvis presenterar vi här en metod som kommer att vara till nytta för forskare som är intresserade av att undersöka potentiella nya molekyler på människors aterosklerotisk skada inflammation. Den ex vivo plack cKULTUR-modellen gör lider av skillnader mellan mus och människans immunsystem, men det ger oss möjlighet att analysera den cellulära samspelet inom ramen för aterosklerotiska lesioner och representerar en möjlighet att undersöka lokala lesionell inflammatoriska kaskader och vägar. Den ex vivo plack kultur metod som beskrivs här är lätt att använda och är reproducerbar och kan bidra till att identifiera och validera mekanismer nya sjukdoms och terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inte några konflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Nadine Wambsganss för utmärkt tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av den tyska Research Foundation (DFG) ER 682/2-1 och en forsknings stipendium från tyska Society of Cardiology till C. Erbel samt en forsknings stipendium från tyska Academic Tjänst Heidelberg till L. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
