Summary
تصلب الشرايين هو عملية التهابات مزمنة. يوضح هذا المخطوط وسيلة سهلة لاستخدام فيفو السابقين نموذج للتحقيق السباتي جديدة أو لويحات الشريان التاجي. السابقين فيفو النموذج يسمح للتحقيق في المواد المحتملة على الوسط التهابات في الآفات والنتائج تصلب الشرايين الإنسان يمكن تحليلها بطرق مختلفة.
Abstract
تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن في الأوعية الدموية. هناك طرق مختلفة لدراسة التهابات في مجمع آفات تصلب الشرايين. نماذج الماوس هي أداة مهمة للتحقيق في عمليات التهابات في تصلب الشرايين، ولكن هذه النماذج تعاني من الاختلافات المظهرية والوظيفية بين الفئران وجهاز المناعة البشري. في المختبر وتستخدم التجارب خلية لتقييم تحديدا تعتمد على نوع الخلية التغييرات الناجمة عن مادة من الفائدة، ولكن الاختلافات التي تعتمد على الثقافة وعدم القدرة على تحليل تأثير جزيئات محددة في سياق مجمع التهابات في آفات تصلب الشرايين لحد من تأثير النتائج. بالإضافة إلى ذلك، قياس مستويات جزيء من الفائدة في دم الإنسان يساعد على مواصلة التحقيق أهمية سريرية، ولكن هذا يمثل الالتهاب النظامية وليس المحلية. لذلك، نحن هنا تصف نموذجا ثقافة وحة لدراسة الآفة تصلب الشرايين الإنسان البيولوجيافيفو السابقين. باختصار، ويتم الحصول على لويحات جديدة من المرضى الذين يخضعون لاستئصال باطنة الشريان أو الشريان التاجي تطعيم وتخزينها في RPMI المتوسطة على الجليد حتى الاستخدام. يتم قطع العينات إلى قطع صغيرة تليها التوزيع العشوائي في لوحة 48 جيدا، تحتوي على RPMI المتوسطة بالإضافة إلى مادة ذات الأهمية مثل السيتوكينات أو كيموكينات وحدها أو في تركيبة لفترات محددة من الزمن. بعد الحضانة، والقطع البلاك يمكن تجميدها لصدمة مرنا العزلة، جزءا لا يتجزأ من البارافين أو أكتوبر لالمناعية تلطيخ أو حطم و lysed لالنشاف الغربية. علاوة على ذلك، قد تكون خلايا معزولة من لوحة للتحليل التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، supernatants يمكن جمعها لقياس البروتين بواسطة ELISA. في الختام، يفتح فيفو السابقين النموذج المقدم إمكانية مواصلة دراسة البيولوجيا التقرحي التهابات، مما قد يؤدي إلى تحديد آليات المرض الرواية والأهداف العلاجية.
Introduction
تصلب الشرايين ومرض التهابي مزمن هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في الدول الصناعية 1-2. مضاعفات تصلب الشرايين، ومتلازمة الشريان التاجي الحادة وخاصة، وقد تم ربط لتمزق الآفات الضعيفة، مما تسبب انسداد الأوعية atherothrombosis و3. يبدو المناعة الفطرية والتكيفية أن تشارك خلال جميع الخطوات من تصلب الشرايين 2،4-5. على الرغم من إحراز تقدم كبير في علاج احتشاء العضلة القلبية، والوقاية من تصلب الشرايين وفعالة الأحداث القلب والأوعية الدموية الضارة لا تزال دون حل. وبالتالي، ودراسة البيولوجيا التقرحي هو ضروري لزيادة المعرفة لدينا على الفيزيولوجيا المرضية من تصلب الشرايين والسماح تحديد أهداف علاجية جديدة وتطوير علاجات جديدة.
في كثير من الحالات، يتم استخدام نماذج الفئران للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لأمراض معينة. ومع ذلك، ودراسة تصلب الشرايين باستخدام نماذج الماوس ACCOmpanied من قبل العديد من القيود: (1) عادة، يحصل تصلب الشرايين الفئران حمية عالية الكوليسترول. لا يمكن مقارنة مستويات الكولسترول في هذه النماذج مع تلك الموجودة في المرضى الذين يعانون من ارتفاع مستويات الكولسترول في الدم 6. (2) هناك اختلافات جوهرية بين الفئران ونظام المناعة البشري؛ وبالتالي foxp3 هو علامة معينة من الخلايا التائية التنظيمية الفئران، في حين أن التعبير foxp3 الإنسان في خلايا T الإنسان لا تضفي بالضرورة النمط الظاهري التنظيمية 7. أيضا، نموذج Th1/Th2 على النحو المحدد في البشر ليست قابلة للتحويل بشكل كامل لخلايا T الفئران. (3) وهناك عدد من العلامات التي تستخدم لتحديد حيدات الفئران والضامة مثل F4/80 وعلامات الكلاسيكية (M1) مقابل البديلة (M2) أنماط التنشيط غير موجود في خلايا الدم النخاعي الإنسان 8. (4) تم العثور على التعبير الجيني من الفئران والإنسان وحيدات الدم المحيطي أن تكون مختلفة إلى حد كبير 9.
وبالتالي، من أجل زيادة فهمنا للعمليات التهابات مزمنة في تصلب الشرايين البشرية، ونحن بحاجة إلى الاستفادة من نماذج العمل مع الأنسجة البشرية، والدم أو الخلايا. هنا، نحن تصف نموذجا للزراعة الأنسجة البلاك الإنسان، والذي يسمح التحقيق المواد الرواية المحتملة في مفهوم الإنسان البيولوجيا التقرحي التهابات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المتوسطة على النحو التالي
- الثقافة المتوسطة: RPMI المتوسطة.
- إضافة 10٪ مصل العجل الجنين (FCS).
- إضافة 100 U / مل البنسلين G، و 100 جم / مل الستربتوميسين.
2. تخزين اسطوانة وحة جديدة حتى الاستخدام
- وسوف يتم استئصال باطنة الشريان السباتي العملية من المرضى الذين يعانون من أعراض نقص تروية أو بدون (السكتة الدماغية والنوبات الدماغية العابرة) مع كبير السباتي الشريان تضيق الأوعية الدموية من قبل الجراحين والشريان التاجي استئصال باطنة الشريان التاجي خلال تطعيم الشريان الالتفافية من قبل جراحي القلب. تحتاج السباتي / ويحات الشريان التاجي المراد إزالتها ككل للحفاظ على بنية اللوحة كما هو موضح سابقا 5.
- بعد مكان استئصال البلاك العينة في أنبوب المتوسطة شغل وتخزينها على الجليد (البلاك تحتاج إلى تغطيتها تماما مع متوسطة) حتى الاستخدام.
3. تجهيز اللوحة
- استخدام طبق كافية زراعة الخلايا (على سبيل المثال 60 ملم)وإضافة 5 مل RPMI المتوسطة.
- وضع الأنسجة لوحة في طبق الثقافة (اللوحة يجب أن تكون مغطاة بالكامل مع متوسطة).
- عقد الأنسجة البلاك بعناية على حواف الأنسجة باستخدام ملقط معقم.
- تقطع حواف العينة اللوحة باستخدام مشرط معقم.
- تقسيم الأنسجة لوحة في النصف.
- تقييم التشكل الآفة ظاهريا (متكلسة، الدهون الغنية، تمزق، خثرة، والتليف).
- تحليل مورفولوجيا البلاك بالضبط بعد التجربة المجراة سابقا من قبل المناعية. استخدام تصنيف AHA 10.
- تجاهل لويحات مع تكلس شديد أو التليف.
- قطع الأنسجة البلاك الى قطع صغيرة مثلي (3 × 3 × 3 مم).
- صدمة تجميد قطعتين البلاك وتخزينها في النيتروجين السائل للقيم الأساسية للآفة حتى الاستخدام.
- إعداد لوحة 48 جيدا.
- إضافة 500 ميكرولتر RPMI المتوسطة إلى كل ما استخدمت بشكل جيد للتجربة.
- يرجى استخداماثنين من قطعة لوحة ر الأقل لكل مجموعة.
- إضافة مادة ذات الاهتمام (مثل السيتوكينات وكيموكينات محددة).
- استخدام قطعة البلاك unstimulated والضوابط.
- زرع عشوائيا عدد من القطع المخصصة لوحة في الآبار.
- الثقافة القطع وحة للحصول على نقاط الوقت المشار إليه.
- لوحة الأنسجة تجربة التحفيز مع عديد السكاريد الشحمي (LPS)
- استخدام نقاط الزمني التالي: 3 ساعة، 8 ساعة و 24 ساعة.
- استخدام 2 قطعة لوحة LPS واثنين للمجموعة unstimulated عن كل نقطة زمنية على التوالي.
- إضافة 1 ميكروغرام / مل من عديد السكاريد الشحمي.
- أثناء الحضانة، والحفاظ على لوحة 48 جيدا عند 37 درجة مئوية في الهواء مرطب يحتوي على 5٪ CO 2.
4. الحصاد الوقت قطعة نسيج لوحة بعد مبين
- صدمة تجميد القطع البلاك لعزل مرنا والتوليف [كدنا] (لمعلومات مفصلة نرى بروتوالقسم عمود 5).
- جمع طاف وتخزينها في -20 درجة مئوية لتحليل ELISA.
- لالنشاف الغربية وتحطيم وليز الأنسجة البلاك. تحديد المحللة من خلال 0.65 ميكرون و 0.1 ميكرون تصفية جهاز الطرد المركزي.
- تضمين الأنسجة الترسبات في الأنسجة تك أو البارافين لstainings المناعية.
5. استخراج الحمض النووي الريبي من قطع وحة مثقف
- استخدام TissueLyser عن التجانس.
- عزل الحمض النووي الريبي باستخدام عدة (انظر الجدول مواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحديد كمية ونوعية الحمض النووي الريبي من العينات مع معمل.
- استخدام عدة بورنغير [كدنا] لالنسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- لPCR الكمي، استخدم على سبيل المثال روش في الوقت الحقيقي PCR عدة مع SYBR الأخضر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا تقديم عدد من الشخصيات التي تظهر نتائج فيفو السابقين البلاك زراعة. لتقييم التغيرات في الوسط التهابات ردا على وكيل مصلحة في فيفو السابقين نموذج التجربة، نقيس الجزيئات المختلفة التي من المعروف أن تشارك في المقام الأول في تصلب الشرايين. كما السيتوكينات الموالية تصلب الشرايين ممثل نختار TNFa، IL6 وIFNg 2،11. بالإضافة إلى ذلك، نستخدم عامل فون ويلبراند والعامل النسيجي لتقييم التغييرات الموالية للالخثاري. وعلاوة على ذلك، لمعالجة وضع من عدم الاستقرار الناجم عن الترسبات وكيلا للاهتمام، مصفوفة metallopeptidase 9 (MMP9) سيتم تحليل المستويات. Chemoattractance هو أيضا خطوة هامة في تطور البلاك والانحدار 11، وبالتالي، فإننا تحقيق مستويات CCL2، كما يشار إلى الوحيدات الكيميائي البروتين 1 (MCP-1)، جاذب كيميائي لمبدأ حيدات / الضامة. بعد جذب الخلية المتداول الخلية والتصاق هي الخطوات التالية.بسبب أن نختار ICAM-1. بمزيد من تحليل مسارات الإشارات يتأثر مضمون الفائدة التي نستخدمها التنظيم خارج الخلية إشارة-تحركات (ERK1 / 2)، وأعرب على نطاق واسع وتفعيلها من خلال العديد من المحفزات المختلفة مثل السيتوكينات، موت الخلايا المبرمج، والتمايز، وعدوى فيروس بروابط للبروتين G heterotrimeric مستقبلات جانب 12.
الأولى، وتبين لنا الوقت التغييرات تعتمد المجمع التهابات الآفات تصلب الشرايين مثقف unstimulated وتحليلها من قبل الكمية الحقيقية الوقت البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) (الشكل 1). خلال زراعة لوحة، يمكن ملاحظة زيادة في نشاط الوسط التقرحي التهابات. لم يتم العثور على الفرق بعد 3 ساعة مقابل أية ثقافة (لا تظهر البيانات). بعد 8 ساعات من الثقافة وحة، وجدنا فقط upregulation طفيف لبعض الجزيئات مثل IL6، ولكن ليس من TNF a و الإنترفيرون ز، في حين بعد 24 ساعة، كان هناك upregulationمن الجزيئات المختلفة مثل TNF، IL6 والإنترفيرون ز. وخاصة، ويعد الوقت للثقافة وحة وارتفاع الاختلاف من التعبير جزيء هي.
الثانية، لإثبات جدوى التأثير على الوسط التهابات في آفات تصلب الشرايين، فإننا نقدم نتائج قطع وحة حضنت مع 1 ميكروغرام / مل LPS لمدة 3 ساعة، يقاس QRT-PCR (الشكل 2). خدم قطعة البلاك Unstimulated كعنصر تحكم السلبية . وجدنا أن LPS الناجم عن زيادة ملحوظة في درجة من تفعيل المجمع التهابات داخل آفات تصلب الشرايين. السيتوكينات المختلفة (IL6، TNF وغيرها، الشكل 2A-B)، كيموكينات (CCL2 وما إلى ذلك، لا يظهر)، التصاق (ICAM1، لا تظهر)، لزعزعة الاستقرار وحة (ماتريكس metallopeptidase 9 (MMP9)، لا تظهر) والمؤيدة لل جزيئات الخثاري (عامل فون ويلبراند، الشكل 2C، الثالثة، لتقييم وفرة البروتين، تم تحليل supernatants من الآفات التي كتبها مثقف ELISA وحطموا الأنسجة البلاك بنسبة الغربي النشاف (الشكل 3D). في الشكل 3A-C، وتبين لنا من تحليل ELISA الإنترفيرون ز، MCP-1 و TNF-a في طاف من العينات مثقف حضنت مع LPS أو السيطرة لمدة 8 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، تحليل لطخة غربية ل(فسفرته) إرك 1/2 من أنسجة وحة حطموا وlysated، إما حفز مع LPS أو سيطرتها، ويتجلى في الشكل 3D. 
الشكل 1. تأثير زراعة وحة على مجمع التقرحي التهاب مع مرور الوقت. قطع وحة تصلب الشرايين وصدمة الفور المجمدة أو مستنبت لمدة 8أو تم تحليل 24 ساعة والتعبير عن السيتوكينات أشارت IL6 (A)، الإنترفيرون ز (B) وTNF ل(C) من خلال QRT-PCR. أظهرت النتائج تمثل متوسط خمس تجارب مستقلة. استخدمت خمس قطع الآفة تصلب الشرايين لكل مجموعة لنقطة زمنية المشار إليه. القيم هي تطبيع لب الأكتين وأعرب عن نسخ كدنا] / 1،000 نسخة ب الأكتين. وتظهر النتائج على النحو المؤامرات مربع عرض متوسط و 25 و 75 ال المئوية عشر من المربعات وال 10 و 90 ال المئوية كما شعيرات. *: ع <0.01. 
الشكل 2. التحفيز LPS من القطع وحة مثقف يسببها بزيادة قدرها مختلف الجزيئات الالتهابية. وحضنت قطع اللوحة مع 1 ميكروغرام / مل LPSأو unstimulated لمدة 3 ساعة وتحليلها بواسطة QRT-PCR. أظهرت النتائج تمثل متوسط خمس تجارب مستقلة. واستخدمت قطعتين لكل مجموعة. القيم هي تطبيع لب الأكتين وأعرب عن نسخ كدنا] / 1،000 نسخة ب الأكتين. وتظهر النتائج على النحو المؤامرات مربع عرض متوسط و 25 و 75 ال المئوية عشر من المربعات وال 10 و 90 ال المئوية كما شعيرات. *: ع <0.01. 
الرقم 3. التعبير البروتين في طاف البلاك مثقف. القياسات الممثل ELISA السيتوكينات الإنترفيرون ز (A)، TNF-A (B) وMCP-1 (C) في طاف من القطع وحة تعامل مع LPS أو unstimulated لمدة 8 وتظهر ساعة. أظهرت النتائج تمثل متوسط خمسة التجربه مستقلةنهاية الخبر. وتظهر النتائج على النحو المؤامرات مربع عرض متوسط و 25 و 75 ال المئوية عشر من المربعات وال 10 و 90 ال المئوية كما شعيرات. بالإضافة إلى ذلك، النشاف الغربية للممثل (فسفرته) إرك 1/2 من LPS حفز أو السيطرة على الآفات تصلب الشرايين مثقف بعد تظاهر 3 ساعة في الشكل 3D. الرسوم البيانية شريط عمود عرض متوسط + SEM كما شعيرات تمثل متوسط خمس تجارب مستقلة. *: ع <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا لتقديم فيفو السابقين البلاك نموذج الثقافة لدراسة تأثير المواد ذات الصلة المحتملة على تصلب الشرايين الآفة علم الأحياء. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب فيفو السابقين هو القدرة على تقييم تأثير المواد المشار إليها على الخلايا الالتهابية وتفاعلها الخلوية وكذلك مسارات التهابات وتقرحات داخل شلالات تصلب الشرايين الإنسان. العديد من الطرق التي يمكن استخدامها (على سبيل المثال RT-PCR، لطخة غربية، المناعية، التدفق الخلوي، ELISA) تساعد في توفير تحليل شامل لتأثير مضمون الفائدة على تصلب الشرايين التهاب الآفة.
مفهومة جيدا عمليات التهابات في الفئران تصلب الشرايين، وأيضا بفضل نماذج الماوس الإفراط في التعبير عن الجينات أو تفتقر إلى بعض من الفائدة 11. ومع ذلك، فإن النتائج لا تتوافق دائما ارتباطا وثيقا البشر 6-9،13. الفئران تصلب الشرايين عادة ما يحصل على تشول عالية مرضيةesterol النظام الغذائي 6. بالإضافة إلى ذلك، من المعروف أن الجهاز المناعي بين البشر والفئران تظهر اختلافات كبيرة 7-9. هنا، فإننا نقدم لوحة فيفو السابقين نموذج الثقافة، والذي يسمح بدراسة تأثير مادة من الفائدة على مجمع التهابات في آفات تصلب الشرايين الإنسان كما يتضح من Niessner وآخرون 14. علاوة على ذلك، طرق إضافية مختلفة يمكن استخدامها لتحليل نتائج تجربة الثقافة وحة، مماثلة لدراسات الفئران. لذلك، يفتح نموذج الجسم الحي السابقين إمكانية استبدال الفئران في الدراسات المجراة في بعض الحالات وربما تمثل وسيلة ممتازة سد بين تصلب الشرايين المفترضة تعزيز جزيء في النظام الفئران والترجمة لعلم الأحياء البشري.
وفيفو السابقين نموذج الإنسان لتصلب الشرايين ليست قابلة للمقارنة مع التجارب في المختبر الخلية. خطوط الخلايا يمكن تخزينها بسهولة ومثقف، ولكن ظاهريا وفوnctionally يست مطابقة للخلايا الأولية. خلايا جديدة يمكن الحصول عليها عن طريق الدم العادية تلفت، ولكن من الصعب جدا في بعض الأحيان إلى ثقافة لهم وتخضع الثقافة لعوامل كثيرة. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام التجارب في المختبر زراعة الخلايا، فإنه ليس من الممكن للتحقيق في تأثير جزيئات محددة في مجمع التهابات في آفات تصلب الشرايين. وبالتالي، في التجارب المختبرية مهمة للعسل (متعدية) خطوة للتحقيقات البيولوجيا البشرية، لكنه يفشل في مواصلة تحليل دور جزيء من الفائدة في مفهوم تصلب الشرايين الإنسان، وخاصة التفاعل الخلوية وتأثير على مسار الشلالات التهابات وتقرحات داخل تصلب الشرايين .
موناكو وآخرون. إنشاء نظام المهم الثقافة على المدى القصير من خلايا معزولة عن الأنسجة تصلب الشرايين الإنسان 15. وقد استخدمت أنها خليط من كولاجيناز الأنزيمية، والإيلاستاز الدناز. يسمح هذا الأسلوب التحقيق في منظمة خبراء التراخيص الدوليةاونال التجارب خلية خلية، مما يشير تحليل المسارات والدراسات نقل الجينات مع ناقلات الفيروسة الغدانية. ولكنه لا يزال غير معروف كيف الخليط الأنزيمية يؤثر على الخلايا، أي غراد التنشيط، سطح علامة التعبير الخ وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن التشكيك ما إذا كانت نتائج هذه التجارب تعكس العمليات الحقيقية داخل آفات تصلب الشرايين. علاوة على ذلك، سيتم تدمير الموقع الأصلي من الخلايا عن طريق خليط الأنزيمية ونظام الثقافة على المدى القصير لديه نفس القيود كما في التجارب المختبرية الخلية.
للدراسات الخلية أو السكان خلية معينة داخل الآفة تصلب الشرايين، فمن الممكن استخدام الليزر التقاط طريقة تشريح الصغرى. وسيتم خفض مجمع خلية أو خلية من الفائدة من الأنسجة باستخدام الأشعة تحت الحمراء أو فوق البنفسجية والليزر RNA، DNA أو تحليل البروتين يمكن أن يؤديها. لا يبدو تشريح الصغرى التقاط الليزر لتدمير الخلايا، وسطح الخلية مستقبلات expression الخ وميزة هذه الطريقة تحليل خلية أو موقع ذات الاهتمام داخل الآفة تصلب الشرايين. ولكن ليس من الممكن مواصلة تقييم الخلايا كما هو الحال في الدراسات المختبرية.
وفيفو السابقين نموذج تورط مجموعة واسعة من الطرق الممكنة لقياس وتحليل النتائج. في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل لا يمكن أن يؤديها بعد عزل الحمض النووي الريبي والتوليف [كدنا] للتحقيق في مستوى التعبير الجيني كما هو مبين من قبل Niessner وآخرون 14. المناعية هو أداة أنشئت لتقييم مستوى البروتين من أجل إثبات تعبير البروتين وأصل الخلوية داخل آفات تصلب الشرايين. النشاف الغربية يمكن استخدامها لتحليل مسارات الإشارات. بالإضافة إلى ذلك، عزل الخلية عن طريق الهضم في محلول أنزيم يفتح الفرصة لإجراء تحليل التدفق الخلوي لمزيد من التحليل لنوع من الخلايا المثال، الأنواع الفرعية الخلوية ودرجة من التنشيط. وعلاوة على ذلك، وبعد العزلة الخليةspectratyping تمثل وسيلة جيدة لزيادة تحليل التباين تي مستقبلات الخلية. علاوة على ذلك، بعد العزلة الخلية المغناطيسي الهضم هو طريقة عالية الجودة ثبت من فصل الخلايا من الأنواع الفرعية الخلوية محددة لإجراء مزيد من الدراسات في المختبر أو تحليل ميكروأري. في الماضي، supernatants يمكن جمعها لقياس البروتين بواسطة ELISA. في الختام، فإن نموذج الجسم الحي السابقين هو أداة قيمة للتحقيق في التغييرات الدقيقة في الوسط التهابات في آفات تصلب الشرايين الإنسان.
يستند فيفو السابقين نموذج على عينات استئصال باطنة الشريان. باستخدام ويحات تصلب الشرايين تم الحصول عليها من مختلف الأفراد قد يؤدي إلى درجة أكبر من تركيبة الخلوية التفاضلية وبالتالي تباين أعلى من مستويات الجينات / البروتينات المثيرة للاهتمام. وبالتالي، فمن المهم استخدام الدهون عينات وحة غنية أو معقدة بدلا من الآفات fibrosclerotic 10، وذلك لأن الاستجابة الالتهابية أقل بشكل ملحوظ في lesio fibroscleroticنانوثانية. وبالتالي، فمن ذات أهمية كبيرة لتقييم التشكل البلاك قبل تحليل نتائج تجارب زراعة البلاك.
بالإضافة إلى ذلك، يتضمن كل عينة العينة مراحل مختلفة من تصلب الشرايين الآفة التنمية / التقدم، من اختلال وظيفي البطانية الأولي والدهون تراكم خطوة، نحو الشرائط الدهنية وتطوير نواة نخرية لويحات تمزق. وبالتالي، من أجل تقليل عدم تجانس الأنسجة لوحة، فمن الضروري لخفض الحواف، والتي تمثل بشكل عام خطوات مبكرة من تصلب الشرايين.
فإنه لا يمكن استبعاد أن يدفع القطع الردود إصابة الأنسجة. ولكن لدينا لوحة نسيج الثقافة التجارب أظهرت مستويات التعبير الجيني للمقارنة من الأنسجة إلى الأنسجة مثقف وحة لوحة غير مثقف. وهكذا، وهذا يؤكد أن الطريقة الحالية هي أداة جيدة للتحقيق في الوسط التهابات في آفات تصلب الشرايين.
ثقافةقطع وحة يقتصر على فترة زمنية من اليوم تصل إلى واحد. إذا تم تربيتها الأنسجة البلاك أكثر من يوم واحد، والاختلاف من الزيادات النتائج بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك، بعد 3 أيام تكوين البلاك والتشكل ينهار.
هناك قيود التي تحتاج إلى أن يوضع في الاعتبار عند تطبيق هذا النموذج. السابقين فيفو النموذج هو طريقة جيدة لدراسة التهابات في الوسط الآفات تصلب الشرايين. ومع ذلك، المكونات الرئيسية في عداد المفقودين في هذا السياق. أي ميزات الدورة الدموية قابلة للتطبيق والتأثيرات الجهازية هي مفقودة تماما. بالإضافة إلى ذلك، مع هذا الأسلوب هو الوحيد الممكن لتحقيق التغييرات على المدى القصير، لكنه يفتقر الى التحليل على المدى الطويل بسبب انهيار التشكل البلاك.
في الختام، فإننا نقدم هنا طريقة من شأنها أن تكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في التحقيق في الجزيئات الجديدة المحتملة على الإنسان تصلب الشرايين التهاب الآفة. وفيفو السابقين البلاك جulture نموذج لا يعانون من الاختلافات بين الفئران وجهاز المناعة البشري، ولكنه يعطينا القدرة على تحليل التفاعل الخلوية في سياق الآفات تصلب الشرايين وتمثل فرصة لتحقيق شلالات التهابات التقرحي المحلية والممرات. وفيفو السابقين البلاك الأسلوب الثقافة الموصوفة هنا هي سهلة الاستخدام وقابلة للتكرار ويمكن أن تساعد على تحديد والتحقق من صحة الرواية وآليات المرض الأهداف العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب لم يكن لديك أي تضارب في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر نادين Wambsganss للحصول على المساعدة الفنية ممتازة. وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الألمانية للبحوث (DFG) ER 682/2-1 وراتبا البحوث من الجمعية الألمانية لأمراض القلب لC. اربل وكذلك راتبا من البحوث الأكاديمية الألمانية لخدمة هايدلبرغ L. تشاو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
