Summary
Atherosklerose er en kronisk inflammatorisk proces. Dette håndskrift illustrerer en nem at bruge ex vivo model for at undersøge frisk carotis eller koronar plaques. Den ex vivo model giver mulighed for undersøgelse af potentielle stoffer på det inflammatoriske miljø i humane aterosklerotiske læsioner og resultaterne kan analyseres ved forskellige metoder.
Abstract
Atherosklerose er en kronisk inflammatorisk sygdom i karrene. Der er forskellige metoder til at studere inflammatorisk forbindelse i atherosklerotiske læsioner. Musemodeller er et vigtigt redskab til at undersøge inflammatoriske processer i atherogenese, men disse modeller lider af fænotypiske og funktionelle forskelle mellem murine og humane immunsystem. In vitro celle eksperimenter anvendes til specifikt at evaluere celletypeafhængig ændringer forårsaget af et stof, interesse, men kultur-afhængige variationer og den manglende evne til at analysere indflydelsen af specifikke molekyler i forbindelse med den inflammatoriske forbindelse i atherosklerotiske læsioner begrænse virkningerne af resultaterne. Desuden at måle niveauet af et molekyle af interesse i humant blod bidrager til yderligere at undersøge den kliniske relevans, men dette repræsenterer systemisk og ikke lokal inflammation. Derfor har vi her beskrive en mindeplade kultur model til at studere menneskelig ateroskleroselæsion biologiex vivo. Kort sagt, friske plaques indhentet fra patienter, der gennemgår endarterectomy eller koronar arterie bypass transplantation og opbevares i RPMI medium på is indtil brug. Prøverne skæres i små stykker efterfulgt af tilfældig fordeling i en 48-brønds plade, der indeholder RPMI medium i tillæg til en substans af interesse, såsom cytokiner eller kemokiner alene eller i kombination for definerede perioder. Efter inkubation kan plak stykker blive chok frosset til mRNA isolation, indlejret i paraffin eller OLT for immunhistokemisk farvning eller smadret og lyseres for western blotting. Endvidere kan celler isoleret fra plaque til flowcytometri-analyse. Desuden kan supernatanter opsamles til protein måling ved ELISA. Som konklusion åbner den præsenterede ex vivo-model muligheden for yderligere at undersøge inflammatoriske lesional biologi, hvilket kan resultere i identifikation af hidtil ukendte sygdomsmekanismer og terapeutiske mål.
Introduction
Aterosklerose som en kronisk inflammatorisk sygdom er en af de vigtigste dødsårsager i industrialiserede nationer 1-2. Komplikationer af åreforkalkning, især akut koronar syndrom, har været knyttet til sprængning af sårbare læsioner, der forårsager aterotrombose og karokklusion 3. Medfødte og adaptiv immunitet synes at være involveret i alle trin af atherogenese 2,4-5. Selv om der er gjort betydelige fremskridt i behandlingen af myokardieinfarkt, effektiv forebyggelse af åreforkalkning og uønskede kardiovaskulære hændelser er stadig uløste. Således studerer lesional biologi er vigtig for at øge vores viden om patofysiologien af åreforkalkning og for at muliggøre identifikation af nye terapeutiske mål og udvikling af nye behandlingsformer.
I mange tilfælde er murine modeller anvendt til at undersøge patofysiologien af specifikke sygdomme. Men studerer atherogenese hjælp musemodeller er accompanied af flere begrænsninger: (1) Normalt atherosklerotiske mus modtager en diæt med højt cholesterolindhold. Kolesterol i disse modeller ikke kan sammenlignes med dem i patienter med forhøjede kolesteroltal serumniveauer 6. (2) Der er væsentlige forskelle mellem murine og humane immunsystem; således foxp3 er en specifik markør af murine regulatoriske T-celler, hvorimod menneskelig foxp3 ekspression i humane T-celler ikke nødvendigvis giver en regulerende fænotype 7. Også den Th1/Th2 paradigme, som defineret i mennesker er ikke fuldt ud overføres til murine T-celler. (3) En række markører, der anvendes til at identificere murine monocytter og makrofager såsom F4/80 og markører for klassisk (M1) vs alternativ (M2) aktiveringsmønstre findes ikke i humane myeloide celler 8. (4) Genekspression af murine og humane monocytter fra perifert blod er blevet fundet at være væsentligt forskellige 9.
Således, for at øge forståelsen afkroniske inflammatoriske processer i menneskelig åreforkalkning, er vi nødt til at gøre brug af modeller, der arbejder med humant væv, blod eller celler. Her beskriver vi en model af den menneskelige plak vævskultur, hvilket giver undersøgelsen af mulige nye stoffer i begrebet menneskelig inflammatoriske lesional biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forbered medium som følger
- Culture Medium: RPMI-medium.
- Tilsæt 10% føtalt kalveserum (FCS).
- Tilsæt 100 U / ml penicillin G og 100 g / ml streptomycin.
2.. Opbevaring af frisk plak cylinder indtil anvendelse
- Carotis endarterectomy operation af patienter med eller uden iskæmiske symptomer (slagtilfælde, forbigående iskæmiske anfald) med en betydelig halspulsåren stenose vil ske ved karkirurger og kranspulsåren endarterectomy under koronar bypass transplantation af hjerte kirurger. Carotis / koronar plaques skal fjernes en bloc at bevare plak struktur som beskrevet tidligere 5.
- Efter plak udryddelse sted modellen i et medium fyldt rør og gemme det på is (plak skal være helt dækket med medium), indtil brug.
3.. Plaque behandling
- Brug en passende celledyrkningsskål (fx 60 mm)og der tilsættes 5 ml RPMI medium.
- Placer plak væv i dyrkningsskålen (plak bør helt dækket med medium).
- Hold plak væv omhyggeligt ved kanterne af vævet ved hjælp af sterile pincetter.
- Skær kanterne af plak prøve ved anvendelse af en steril skalpel.
- Divider plak væv i halve.
- Vurdere læsion morfologi makroskopisk (forkalkede, lipid rige, bristede, blodprop, fibrose).
- Analyser den nøjagtige plak morfologi efter ex vivo eksperiment ved immunhistokemi. Brug AHA klassifikationen 10.
- Kassér plaques med svær forkalkning eller fibrose.
- Skær plak væv i homologe små stykker (3 x 3 x 3 mm).
- Shock fryse to plak stykker og gemme dem i flydende nitrogen i grundlæggende værdier læsion indtil brug.
- Der fremstilles en 48-brønds plade.
- Tilsæt 500 pi RPMI-medium til hver brønd anvendt til eksperimentet.
- Brug venligst ett mindst to plak stykker til hver gruppe.
- Tilsæt indholdet af interesse (f.eks specifikke cytokiner og kemokiner).
- Brug stimulerede plak stykker som kontroller.
- Tilfældigt plante tilegnet antal plaque stykker i brøndene.
- Kultur plak stykker for angivne tidspunkter.
- For plak væv stimulation eksperimentere med lipopolysaccharid (LPS)
- Brug følgende tidspunkter: 3 timer, 8 timer og 24 timer.
- Brug 2 plak stykker for LPS og to for-stimulerede gruppe for hvert tidspunkt hhv.
- Tilsæt 1 mg / ml af Lipopolysaccharide.
- Under inkubationen opretholde 48-brønds plade ved 37 ° C i befugtet luft indeholdende 5% CO2.
4.. Efter angivne tid høst plak vævsstykkerne
- Shock fryse plak stykker for mRNA isolation og cDNA syntese (for nærmere oplysninger, se protocol afsnit 5).
- Opsaml supernatanten og opbevaret det ved -20 ° C til ELISA analyse.
- For western blotting, smadre og lysere plak væv. Foretage lysatet gennem et 0,65 um og 0,1 um centrifugalfilterenhed enhed.
- Integrer plak væv i væv-tec eller paraffin for immunhistokemi farvninger.
5.. RNA-ekstraktion fra dyrkede plaque stykker
- Brug en TissueLyser for homogenisering.
- Isoler RNA ved anvendelse af kittet (se materialer tabel) ifølge producentens anvisninger.
- Bestem RNA mængden og kvaliteten af prøverne med spektrofotometer.
- Brug Boehringer cDNA kit til revers transkription i henhold til producentens anvisninger.
- For kvantitativ PCR, bruger for eksempel Roche real-time PCR-kit med SYBR Green.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi en række figurer, der viser resultaterne af ex vivo plak dyrkning. At vurdere ændringer i det inflammatoriske miljø i respons til agenten af interesse i ex vivo model eksperiment måler vi forskellige molekyler, der er kendt for at være primært involveret i atherogenese. Som repræsentative pro-atherogene cytokiner vi vælger TNFa, IL6 og IFNg 2,11. Derudover bruger vi von Willebrand faktor og vævsfaktor at evaluere pro-thrombotiske ændringer. Desuden til at tage udviklingen af plakustabilitet fremkaldt af en agent af interesse, matrix metallopeptidase 9 (MMP9) niveauer vil blive analyseret. Chemoattractance er også et vigtigt skridt i plak progression og regression 11, således, at vi undersøger niveauet af CCL2, også kaldet monocytkemotaktisk protein-1 (MCP-1), princippet kemoattraktant for monocytter / makrofager. Efter celle attraktion celle rullende og vedhæftning er følgende trin.På grund af, at vi vælger ICAM-1. Ved yderligere analyse af signalveje påvirkes af stoffet af interesse vi bruger ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK1 / 2), i vid udstrækning udtrykt og aktiveres af mange forskellige stimuli, såsom cytokiner, apoptose, differentiering, virusinfektion og ligander for heterotrimere G-protein koblede receptorer 12.
Først viser vi tidsafhængige ændringer af inflammatoriske forbindelse stimulerede dyrkede atherosklerotiske læsioner analyseret ved kvantitativ realtids-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) (figur 1). Under plak dyrkning kan der observeres en stigning i aktiviteten af inflammatoriske lesional miljø. Ingen forskel blev fundet efter 3 timer vs ingen kultur (data ikke vist). Efter 8 timers af plak kultur, fandt vi kun en svag opregulering af visse molekyler såsom IL6, men ikke af TNF a og IFN g, hvorimod efter 24 timer, var der en opreguleringaf forskellige molekyler, såsom TNF-a, IL6 og IFN g. Især, jo længere tid af plak kultur højere variation af molekylet udtryk er.
For det andet at demonstrere muligheden for at påvirke den inflammatoriske miljø i ateroskleroselæsioner præsenterer vi resultaterne af plak stykker inkuberet med 1 mg / ml LPS til 3 timer, målt ved QRT-PCR (figur 2). Ustimulerede plak stykker tjente som en negativ kontrol . Vi fandt, at LPS inducerede en markant stigning i graden af aktivering af den inflammatoriske forbindelse inde atherosklerotiske læsioner. Forskellige cytokiner (IL6, TNF a osv., figur 2A-B), chemokiner (CCL2 osv., ikke vist), friktion (ICAM1 ikke vist), plaque destabiliserende (Matrix metallopeptidase 9 (MMP9), ikke vist), og pro- trombotiske molekyler (von Willebrand faktor, figur 2C, For det tredje, for at evaluere proteinet overflod, supernatanter fra dyrkede læsioner blev analyseret ved ELISA og smadret plak væv ved western-blotting (figur 3D). 3A-C, viser vi ELISA-analyse af IFN-g, MCP-1 og TNF-a i supernatanten af dyrkede prøver inkuberet med LPS eller kontrol i 8 timer. Hertil kommer, western blot analyse for (phosphoryleres) ERK 1/2 smadret og lyseredes plak væv, enten stimuleres med LPS eller kontrol, er demonstreret i figur 3D. 
Fig. 1. Effekt af plak dyrkning på inflammatoriske lesional forbindelse over tid. Aterosklerotiske plaque stykker blev straks chok frosne eller dyrket i 8eller 24 timer, og ekspressionen af angivne cytokiner IL6 (A), IFN g (B) og TNF a (C) blev analyseret ved QRT-PCR. De viste resultater repræsenterer gennemsnittet af fem uafhængige forsøg. Fem atherosklerotiske læsioner stykker for hver gruppe blev anvendt til angivne tidspunkt. Værdier er normaliseret til b-actin og udtrykt som cDNA kopier / 1.000 b-actin kopier. Resultaterne er vist som kassediagrammer viser middelværdi og 25 th og 75 th percentiler som kasser og 10 th og 90 th percentiler som knurhår. *: P <0,01. 
Figur 2. LPS-stimulering af dyrkede plaque stykker inducerede en forøgelse af forskellige inflammatoriske molekyler. Plaque stykker blev inkuberet med 1 ug / ml LPSeller ustimulerede i 3 timer og analyseret ved QRT-PCR. De viste resultater repræsenterer gennemsnittet af fem uafhængige forsøg. To stykker for hver gruppe blev anvendt. Værdier er normaliseret til b-actin og udtrykt som cDNA kopier / 1.000 b-actin kopier. Resultaterne er vist som kassediagrammer viser middelværdi og 25 th og 75 th percentiler som kasser og 10 th og 90 th percentiler som knurhår. *: P <0,01. 
Figur 3.. Proteinekspression i supernatanten af dyrkede plak. Repræsentant ELISA målinger af cytokiner IFN-g (A), TNF-a (B) og MCP-1 (C) i supernatanten af plak stykker behandlet med LPS eller ustimuleret for 8 hr vises. De viste resultater repræsenterer gennemsnittet af fem uafhængige eksperits. Resultaterne er vist som kassediagrammer viser middelværdi og 25 th og 75 th percentiler som kasser og 10 th og 90 th percentiler som knurhår. Desuden repræsenterer western blotting for (phosphoryleret) ERK 1/2 af LPS-stimulerede eller kontrollere dyrkede atherosklerotiske læsioner efter 3 timer er demonstreret i figur 3D. Kolonnen søjlegrafer viser middelværdi + SEM som knurhår repræsenterer gennemsnittet af fem uafhængige forsøg. *: P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en ex vivo plak kultur model til at undersøge indflydelsen af potentielt relevante stoffer på ateroskleroselæsion biologi. Den største fordel ved denne ex vivo-fremgangsmåde er evnen til at vurdere indflydelsen af angivne stoffer inflammatoriske celler og deres cellulære samspil samt inflammatoriske veje og kaskader i humane atherosklerotiske læsioner. Adskillige brugbare metoder (fx RT-PCR, western blot, immunhistokemi, flowcytometri, ELISA) hjælp til at give en samlet analyse af virkningerne af stoffet af interesse på ateroskleroselæsion inflammation.
De inflammatoriske processer i murine åreforkalkning er godt forstået, også takket være musemodeller over-udtrykker eller mangler visse gener af interesse 11. Men resultaterne ikke altid nøje svare til mennesker 6-9,13. Atherosclerotiske mus modtager normalt en patologisk høj Cholesterol kost 6. Desuden er det kendt, at immunforsvar mellem mennesker og mus viser væsentlige forskelle 7-9. Her præsenterer vi en ex vivo plak kultur model, som gør det muligt at studere indflydelse af et stof af interesse på den inflammatoriske stof i humane ateroskleroselæsioner som vist ved Niessner et al. 14.. Desuden kan forskellige supplerende metoder anvendes til at analysere resultaterne af en plaque kultur eksperiment sammenlignelig med murine undersøgelser. Derfor åbner ex vivo-model kan erstatte murine in vivo-undersøgelser i nogle tilfælde og kan repræsentere en fremragende brodannende fremgangsmåde mellem en formodet aterosklerose fremme molekyle i det murine system, og oversættelse til human biologi.
Den menneskelige ex vivo model for åreforkalkning kan ikke sammenlignes med in vitro celle eksperimenter. Cellelinjer kan nemt gemmes og dyrkes, men er fænotypisk og functionally ikke identisk med primære celler. Friske celler kan opnås ved regelmæssig blodprøver, men det er undertiden meget vanskelige at dyrke dem, og kulturen underkastes mange faktorer. Desuden, ved anvendelse af in vitro cellekultur eksperimenter, er det ikke muligt at undersøge indflydelsen af specifikke molekyler på inflammatorisk forbindelse i atherosklerotiske læsioner. Således in vitro forsøg er vigtige for initial (translationel) skridt for den menneskelige biologi undersøgelser, men undlader at analysere den rolle, som molekylet af interesse i begrebet menneskelig åreforkalkning, især cellulære samspil og indflydelse på inflammatoriske kaskader og sti inden ateroskleroselæsioner .
Monaco et al. Etableret en vigtig kortsigtet kultur system celler isoleret fra humant aterosklerosevæv 15. De har brugt en enzymatisk blanding af kollagenase, elastase og DNase. Denne metode gør det muligt undersøgelse af LesiOnal celle-celle eksperimenter, signalvejen analyse og genoverførsel studier med adenovirusvektorer. Men det er stadig uvist, hvor den enzymatiske blanding påvirker cellerne, dvs grad af aktivering, overflade markør ekspression osv. Desuden kan man spørge, om resultaterne af disse forsøg afspejler de virkelige processer i atherosklerotiske læsioner. Endvidere vil den oprindelige placering af cellerne blive ødelagt ved den enzymatiske blanding og kortvarig dyrkningssystem har de samme begrænsninger som in vitro-celle-forsøg.
For specifikke celle eller cellepopulation undersøgelser inden en atherosclerotisk læsion, er det muligt at anvende laser capture micro dissektionsmetoden. Den celle eller forbindelse af interesse vil blive skåret ud af vævet ved hjælp af en infrarød-eller UV-laser og RNA, DNA eller protein-analyse kan udføres. Laseren capture micro dissektion synes ikke at beskadige celler, celleoverfladereceptoren EXPREssion osv. Fordelen ved denne metode er en analyse af en celle eller et sted af interesse inde i en atherosklerotisk læsion. Men det er ikke muligt for yderligere at evaluere de celler, såsom in vitro-undersøgelser.
Den ex vivo model implicerer en bred vifte af mulige metoder til at måle og analysere resultaterne. Realtids polymerasekædereaktion kan udføres efter RNA-isolering og cDNA-syntese for at undersøge genekspression som det fremgår af Niessner et al. 14.. Immunhistokemi er en etableret værktøj til at vurdere protein niveau med henblik på at bevise det protein udtryk og den cellulære oprindelse indersiden aterosklerotiske læsioner. Western blotting kan anvendes til at analysere signalveje. Desuden celleisolering ved spaltning i en enzymopløsning åbner mulighed for at udføre flowcytometrianalyse at analysere for eksempel celletype celleundertyper og kvalitet af aktivering. Endvidere efter celleisoleringspectratyping repræsenterer en god metode at analysere T-celle receptor variabilitet. Desuden efter fordøjelse magnetisk celleisolering er en dokumenteret høj kvalitet metode til celle separation af specifikke cellulære undertyper til yderligere in vitro-undersøgelser eller microarray analyse. Omsider kan supernatanter indsamles til protein måling ved ELISA. Konklusionen er, at ex vivo model er et værdifuldt redskab til at undersøge de nøjagtige ændringer i den inflammatoriske miljø i humane aterosklerotiske læsioner.
Den ex vivo model er baseret på endarterektomi prøver. Brug af atherosklerotiske plaques opnået fra forskellige individer kan resultere i en større grad af differential cellulær sammensætning og dermed større variation af niveauerne af gener / proteiner af interesse. Derfor er det vigtigt at anvende lipidrige eller komplicerede plaque prøver snarere end fibrosclerotic læsioner 10, fordi det inflammatoriske respons er markant lavere i fibrosclerotic lesions. Det er derfor af stor interesse at evaluere plak morfologi før analyse af resultaterne af plaque-kultur eksperimenter.
Derudover hver prøve prøve omfatter forskellige stadier af ateroskleroselæsion udvikling / progression, fra den indledende endotel dysfunktion og lipid ophobning skridt i retning fedtstriber samt udvikling af en nekrotisk kerne til bristede plaques. Således, for at minimere uensartethed plak væv, er det nødvendigt at skære de kanter, som generelt udgør tidlige trin i atherogenese.
Det kan ikke udelukkes, at den skærende inducerer vævsskade svar. Men vore plaque vævskulturplader forsøg viste sammenlignelige genekspressionsniveauer af de dyrkede plak væv til ikke-dyrkede plak væv. Derfor er dette understreger, at den nuværende metode er et godt redskab til at undersøge den inflammatoriske miljø i aterosklerotiske læsioner.
Den kultur afplak stykker er begrænset til en periode på op til en dag. Hvis plak væv dyrkes mere end en dag, variationen af resultaterne stiger dramatisk. Hertil kommer, efter 3 dage plak sammensætning og morfologi kollapser.
Der er begrænsninger, der skal holdes for øje, når de anvender denne model. Den ex vivo model er en god metode til at studere den inflammatoriske miljø i aterosklerotiske læsioner. Ikke desto mindre er vigtige komponenter mangler i denne sammenhæng. Ingen hæmodynamiske funktioner er relevant og systemiske påvirkninger er helt mangler. Hertil kommer, med denne metode er det kun muligt at undersøge ændringer på kort sigt, men mangler en langsigtet analyse på grund af kollaps af plak morfologi.
Afslutningsvis præsenterer vi her en metode, der vil være nyttige for forskere, der er interesseret i undersøgelsen af mulige nye molekyler på menneskers ateroskleroselæsion inflammation. Den ex vivo plak cULTUR model gør lider forskelle mellem murine og humane immunsystem, men det giver os evnen til at analysere den cellulære samspil i forbindelse med ateroskleroselæsioner og repræsentere mulighed for at undersøge de lokale lesional inflammatoriske kaskader og veje. Den ex vivo plak kultur her beskrevne metode er nem at bruge og er reproducerbar og kan hjælpe med at identificere og validere nye sygdomsmekanismer og terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke nogen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Nadine Wambsganss for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af den tyske Research Foundation (DFG) ER 682/2-1 og et forsknings-stipendium fra den tyske Society of Cardiology til C. Erbel samt et forsknings-stipendium fra den tyske Academic service Heidelberg til L. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
