Summary
Atherosclerosis एक जीर्ण सूजन की प्रक्रिया है. इस पांडुलिपि ताजा मन्या या कोरोनरी धमनी सजीले टुकड़े की जांच के लिए पूर्व vivo मॉडल का उपयोग करने के लिए एक आसान दिखाता है. पूर्व vivo मॉडल विभिन्न तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है मानव atherosclerotic घावों और परिणाम में भड़काऊ परिवेश पर संभावित पदार्थों की जांच के लिए अनुमति देता है.
Abstract
Atherosclerosis वाहिका संरचना के एक जीर्ण सूजन की बीमारी है. Atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिसर अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीके हैं. माउस मॉडल मेदार्बुदजनन में सूजन प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, लेकिन इन मॉडलों murine और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच प्ररूपी और कार्यात्मक अंतर से पीड़ित हैं. इन विट्रो सेल प्रयोगों के लिए विशेष रूप से एक पदार्थ की वजह से सेल प्रकार पर निर्भर परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है ब्याज, लेकिन संस्कृति पर निर्भर विविधताओं और atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिसर के संदर्भ में विशिष्ट अणुओं के प्रभाव का विश्लेषण करने में असमर्थता परिणामों के प्रभाव को सीमित. इसके अलावा, मानव रक्त में ब्याज की एक अणु के स्तर को मापने के लिए आगे अपनी नैदानिक प्रासंगिकता जांच करने के लिए मदद करता है, लेकिन इस प्रणालीगत और स्थानीय नहीं सूजन का प्रतिनिधित्व करता है. इसलिए, हम यहाँ मानव atherosclerotic घाव जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक पट्टिका संस्कृति मॉडल का वर्णनपूर्व vivo. संक्षेप में, ताजा सजीले टुकड़े endarterectomy या कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्टिंग के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं और उपयोग जब तक बर्फ पर RPMI मध्यम में संग्रहीत. नमूनों ऐसे साइटोकिन्स या chemokines अकेले या समय की परिभाषित अवधि के लिए संयोजन के रूप में ब्याज की एक पदार्थ के अलावा RPMI मध्यम युक्त, एक 48 अच्छी तरह से थाली में यादृच्छिक वितरण द्वारा पीछा छोटे टुकड़ों में काट रहे हैं. ऊष्मायन के बाद, पट्टिका टुकड़े झटका, mRNA अलगाव के लिए जमे हुए किया जा सकता है immunohistochemistry धुंधला के लिए आयल या अक्टूबर में एम्बेडेड या तोड़ी और पश्चिमी सोख्ता के लिए lysed. इसके अलावा, कोशिकाओं फ्लो विश्लेषण के लिए पट्टिका से अलग किया जा सकता है. इसके अलावा, supernatants एलिसा द्वारा प्रोटीन माप के लिए एकत्र किया जा सकता है. अंत में, प्रस्तुत पूर्व vivo मॉडल आगे उपन्यास रोग तंत्र और चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान में हो सकता है जो भड़काऊ lesional जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए संभावना को खोलता है.
Introduction
एक जीर्ण सूजन की बीमारी के रूप में Atherosclerosis औद्योगिक देशों 1-2 में मौत के मुख्य कारणों में से एक है. Atherosclerosis, विशेष रूप से तीव्र कोरोनरी सिंड्रोम की जटिलताओं, atherothrombosis और पोत रोड़ा 3, जिससे कमजोर घावों का टूटना से जोड़ा गया है. सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली मेदार्बुदजनन 2,4-5 के सभी चरणों के दौरान शामिल होने लगते हैं. महत्वपूर्ण प्रगति रोधगलन के उपचार, atherosclerosis की प्रभावी रोकथाम और प्रतिकूल हृदय की घटनाओं में किया गया है हालांकि अभी भी अनसुलझे हैं. इस प्रकार, lesional जीव विज्ञान का अध्ययन atherosclerosis के pathophysiology पर हमारे ज्ञान में वृद्धि के लिए आवश्यक है और उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों और उपन्यास के उपचारों के विकास की पहचान की अनुमति के लिए.
कई मामलों में, murine मॉडल विशिष्ट रोगों के pathophysiology जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, माउस मॉडल का उपयोग मेदार्बुदजनन का अध्ययन ACCO हैकई सीमाओं से mpanied: (1) आमतौर पर, atherosclerotic चूहों एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार प्राप्त करते हैं. इन मॉडलों में कोलेस्ट्रॉल के स्तर को ऊंचा कोलेस्ट्रॉल सीरम का स्तर 6 के साथ रोगियों में उन लोगों के साथ तुलना नहीं की जा सकती है. (2) murine और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच काफी मतभेद रहे हैं; मानव टी कोशिकाओं में मानव Foxp3 अभिव्यक्ति जरूरी नहीं कि एक नियामक phenotype 7 प्रदान नहीं करता है, जबकि इस तरह Foxp3, murine विनियामक टी कोशिकाओं की एक विशिष्ट मार्कर है. इसके अलावा, मनुष्य के रूप में परिभाषित Th1/Th2 प्रतिमान murine टी कोशिकाओं को पूरी तरह से हस्तांतरणीय नहीं है. (3) बनाम ऐसे F4/80 और शास्त्रीय (एम 1) के मार्कर के रूप murine monocytes और मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि मार्कर का एक नंबर वैकल्पिक (M2) सक्रियण पैटर्न मानव माइलॉयड कोशिकाओं 8 में मौजूद नहीं है. (4) murine और मानव परिधीय रक्त monocytes के जीन की अभिव्यक्ति 9 काफी अलग होना पाया गया है.
इस प्रकार, हमारी समझ से बढ़ाने के लिएमानव atherosclerosis में जीर्ण सूजन प्रक्रियाओं, हम मानव ऊतकों, रक्त या कोशिकाओं के साथ काम कर मॉडल का उपयोग करने की जरूरत है. यहाँ, हम मानव भड़काऊ lesional जीव विज्ञान की अवधारणा में संभावित उपन्यास पदार्थों की जांच की अनुमति देता है जो मानव पट्टिका टिशू कल्चर, के एक मॉडल का वर्णन.
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Protocol
इस प्रकार के रूप में 1. मध्यम तैयार
- संस्कृति मध्यम: RPMI मध्यम.
- 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) जोड़ें.
- 100 यू / एमएल पेनिसिलिन जी जोड़ें, और 100 छ / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन.
उपयोग करें जब तक ताजा पट्टिका सिलेंडर की 2. संग्रहण
- एक महत्वपूर्ण मन्या धमनी प्रकार का रोग के साथ (स्ट्रोक, क्षणभंगुर इस्कीमिक हमले) के साथ या इस्कीमिक लक्षण के बिना रोगियों की मन्या endarterectomy ऑपरेशन हार्ट सर्जन द्वारा कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्टिंग के दौरान संवहनी सर्जन और कोरोनरी धमनी endarterectomy द्वारा किया जाएगा. मन्या / कोरोनरी सजीले टुकड़े पहले 5 के रूप में वर्णित पट्टिका संरचना की रक्षा करने के लिए पूर्ण रूप से हटा दिया जाना चाहिए.
- पट्टिका तबाही रखने के बाद एक मध्यम भरा ट्यूब में नमूना और उपयोग करें जब तक (पट्टिका पूरी तरह से मध्यम के साथ कवर किया जाना चाहिए) बर्फ पर दुकान.
3. फलक प्रोसेसिंग
- एक पर्याप्त सेल संस्कृति पकवान (जैसे 60 मिमी) का प्रयोग करेंऔर 5 एमएल RPMI मध्यम जोड़ें.
- संस्कृति डिश (पट्टिका पूरी तरह से मध्यम के साथ कवर किया जाना चाहिए) में पट्टिका ऊतक रखें.
- बाँझ संदंश का उपयोग करके ऊतक के किनारों पर ध्यान से पट्टिका ऊतक पकड़ो.
- एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके पट्टिका नमूना के किनारों से काट दिया.
- आधे में पट्टिका ऊतक फूट डालो.
- (Calcified, लिपिड समृद्ध, उठी, thrombus, फाइब्रोसिस) macroscopically घाव आकारिकी का आकलन करें.
- Immunohistochemistry द्वारा पूर्व vivo प्रयोग के बाद सटीक पट्टिका आकारिकी का विश्लेषण करें. अहा वर्गीकरण 10 का प्रयोग करें.
- गंभीर कड़ा हो जाना या फाइब्रोसिस के साथ सजीले टुकड़े त्यागें.
- मुताबिक़ छोटे टुकड़ों (3 एक्स 3 एक्स 3 मिमी) में पट्टिका ऊतक में कटौती.
- दो पट्टिका टुकड़े फ्रीज सदमे और घाव के बुनियादी मूल्यों के लिए तरल नाइट्रोजन में उन्हें स्टोर उपयोग करें जब तक.
- एक 48 अच्छी तरह से थाली तैयार है.
- अच्छी तरह से प्रयोग के लिए इस्तेमाल करने के लिए प्रत्येक 500 μl RPMI मध्यम जोड़ें.
- कृपया का उपयोग एकप्रत्येक समूह के लिए टी कम से कम दो पट्टिका टुकड़े.
- ब्याज (जैसे विशिष्ट साइटोकिन्स और chemokines) के पदार्थ जोड़ें.
- नियंत्रण के रूप में unstimulated पट्टिका टुकड़े का उपयोग करें.
- बेतरतीब ढंग से कुओं में पट्टिका टुकड़े की विनियोजित संख्या संयंत्र.
- संकेत समय अंक के लिए संस्कृति पट्टिका टुकड़े.
- (LPS) lipopolysaccharide साथ पट्टिका ऊतक उत्तेजना प्रयोग के लिए
- 3 घंटा, 8 घंटा और 24 घंटे: निम्नलिखित समय अंकों का प्रयोग करें.
- क्रमशः हर समय बिंदु के लिए unstimulated समूह के लिए 2 पट्टिका LPS के लिए टुकड़े और दो का प्रयोग करें.
- Lipopolysaccharide की 1 ग्राम / मिलीलीटर जोड़ें.
- ऊष्मायन के दौरान, 5% सीओ 2 युक्त humidified हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 अच्छी तरह से थाली बनाए रखें.
4. के बाद बताए गए समय फसल पट्टिका ऊतक टुकड़े
- विस्तृत आद्य जानकारी देखने के लिए (mRNA अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण के लिए पट्टिका टुकड़े फ्रीज शॉककर्नल धारा 5).
- सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एलिसा विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
- पश्चिमी सोख्ता के लिए, गरज और पट्टिका ऊतक lyse. एक 0.65 मीटर और 0.1 मीटर केन्द्रापसारक फिल्टर डिवाइस के माध्यम से lysate तक.
- Immunohistochemistry stainings के लिए ऊतक टीईसी या तेल में पट्टिका ऊतक शामिल करें.
सुसंस्कृत पट्टिका टुकड़े से 5. शाही सेना निकासी
- Homogenization के लिए एक TissueLyser का प्रयोग करें.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार किट (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग करके शाही सेना को अलग.
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ नमूने की शाही सेना मात्रा और गुणवत्ता का निर्धारण.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स प्रतिलेखन के लिए Boehringer सीडीएनए किट का प्रयोग करें.
- मात्रात्मक पीसीआर के लिए, उदाहरण के लिए SYBR ग्रीन के साथ रॉश वास्तविक समय पीसीआर किट का उपयोग करें.
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Representative Results
यहाँ हम पूर्व vivo पट्टिका संवर्धन का परिणाम दिखाना है कि आंकड़े की एक संख्या मौजूद है. पूर्व vivo मॉडल प्रयोग में रुचि के एजेंट के जवाब में भड़काऊ परिवेश में परिवर्तन का आकलन करने के लिए, हम मेदार्बुदजनन में मुख्य रूप से शामिल होने के लिए जाना जाता है जो अलग अणुओं को मापने. प्रतिनिधि समर्थक मेदार्बुदजनक साइटोकिन्स के रूप में हम TNFa, IL6 और IFNg 2,11 चुनें. इसके अलावा, हम समर्थक thrombotic परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए वॉन Willebrand कारक और ऊतक कारक का उपयोग करें. इसके अलावा, ब्याज के एक एजेंट से प्रेरित पट्टिका अस्थिरता, मैट्रिक्स metallopeptidase 9 (MMP9) के स्तर का विश्लेषण किया जाएगा के विकास को संबोधित करने के लिए. Chemoattractance इस प्रकार, हम भी monocytes / मैक्रोफेज के लिए एककेंद्रकश्वेतकोशिका chemotactic प्रोटीन -1 (MCP-1), सिद्धांत chemoattractant के रूप में भेजा CCL2 के स्तर की जांच, यह भी पट्टिका प्रगति और प्रतिगमन 11 में एक महत्वपूर्ण कदम है. सेल आकर्षण सेल रोलिंग और आसंजन निम्नलिखित कदम उठाए हैं के बाद.इस कारण से हम ICAM-1 का चयन करें. आगे ब्याज के पदार्थ से प्रभावित संकेत दे रास्ते का विश्लेषण करके हम बाह्य संकेत विनियमित kinases (ERK1 / 2), व्यापक रूप से व्यक्त की है और इस तरह के साइटोकिन्स, apoptosis, भेदभाव, वायरस के संक्रमण और heterotrimeric जी प्रोटीन के लिए ligands के रूप में कई अलग अलग उत्तेजनाओं से सक्रिय उपयोग रिसेप्टर्स 12 युग्मित.
सबसे पहले, हम मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT-पीसीआर) (चित्रा 1) द्वारा विश्लेषण unstimulated सुसंस्कृत atherosclerotic घावों की भड़काऊ परिसर के समय निर्भर परिवर्तन, दिखा. पट्टिका संवर्धन के दौरान भड़काऊ lesional परिवेश की गतिविधि की वृद्धि मनाया जा सकता है. कोई फर्क नहीं संस्कृति (नहीं दिखाया डेटा) बनाम 3 घंटा के बाद पाया गया था. पट्टिका संस्कृति के 8 घंटे के बाद, हम 24 घंटे के बाद, एक upregulation वहां गया था जबकि, लेकिन नहीं TNF एक और IFN जी की, इस तरह के IL6 के रूप में कुछ अणुओं का केवल एक मामूली upregulation पायाऐसे TNF एक, IL6 और IFN ग्राम के रूप में विभिन्न अणुओं की. उल्लेखनीय है कि लंबे समय तक पट्टिका संस्कृति के समय उच्च अणु अभिव्यक्ति की विभिन्नता हैं.
दूसरा, atherosclerotic घावों में भड़काऊ वातावरण को प्रभावित करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, हम QRT-पीसीआर द्वारा मापा 3 घंटे के लिए 1 ग्राम / मिलीलीटर LPS, चित्रा (2) के साथ incubated पट्टिका टुकड़े का परिणाम प्रस्तुत करते हैं. Unstimulated पट्टिका टुकड़े एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा . हम LPS atherosclerotic घावों के अंदर सूजन परिसर के सक्रियण के ग्रेड के एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रेरित पाया. विभिन्न साइटोकिन्स (IL6, TNF एक आदि, चित्रा 2A बी), chemokines (CCL2 आदि) नहीं दिखाया, आसंजन (ICAM1, दिखाया गया है), पट्टिका अस्थिर (मैट्रिक्स MMP9 (9 metallopeptidase),) नहीं दिखाया और समर्थक thrombotic अणुओं (वॉन Willebrand कारक, चित्रा -2, तीसरा, प्रोटीन बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए, सुसंस्कृत घावों की supernatants एलिसा द्वारा विश्लेषण किया और पश्चिमी (चित्रा 3 डी) सोख्ता द्वारा पट्टिका ऊतकों तोड़ी गया. चित्रा 3 ए सी में, हम IFN जी की एलिसा विश्लेषण, LPS या 8 घंटे के लिए नियंत्रण के साथ incubated सुसंस्कृत नमूनों की सतह पर तैरनेवाला में MCP-1 और TNF-एक शो. इसके अलावा, (phosphorylated) ERK 1 / तोड़ी और lysated पट्टिका ऊतकों की 2, या तो LPS या नियंत्रण के साथ प्रेरित के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, चित्रा 3 डी में प्रदर्शन किया है. 
चित्रा 1. समय के साथ भड़काऊ lesional परिसर पर पट्टिका संवर्धन का प्रभाव. Atherosclerotic पट्टिका टुकड़े तुरंत सदमे से 8 के लिए जमे हुए या सुसंस्कृतया संकेत साइटोकिन्स IL6 (ए), IFN जी (बी) और TNF एक (सी) के 24 घंटे और अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया था. यह परिणाम पांच स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रत्येक समूह के लिए पांच atherosclerotic घाव टुकड़े संकेत समय बिंदु के लिए इस्तेमाल किया गया. मान बी actin के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं और सीडीएनए प्रतियां / 1000 बी actin प्रतियां के रूप में व्यक्त किया. परिणाम बॉक्स मतलब प्रदर्शित भूखंडों और 25 वें और बक्से और 10 वें और मूंछ के रूप में 90 वें प्रतिशतक के रूप में 75 वें प्रतिशतक के रूप में दिखाया गया है. *: पी <0.01. 
विभिन्न भड़काऊ अणुओं की वृद्धि प्रेरित सुसंस्कृत पट्टिका टुकड़े का चित्रा 2. LPS उत्तेजना. फलक टुकड़े 1 ग्राम / मिलीलीटर LPS के साथ incubated रहे थेया 3 घंटे के लिए unstimulated और QRT-पीसीआर से विश्लेषण किया. यह परिणाम पांच स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रत्येक समूह के लिए दो टुकड़े इस्तेमाल किया गया. मान बी actin के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं और सीडीएनए प्रतियां / 1000 बी actin प्रतियां के रूप में व्यक्त किया. परिणाम बॉक्स मतलब प्रदर्शित भूखंडों और 25 वें और बक्से और 10 वें और मूंछ के रूप में 90 वें प्रतिशतक के रूप में 75 वें प्रतिशतक के रूप में दिखाया गया है. *: पी <0.01. 
सुसंस्कृत पट्टिका की सतह पर तैरनेवाला में चित्रा 3. प्रोटीन अभिव्यक्ति. साइटोकिन्स के प्रतिनिधि एलिसा माप IFN-G (ए), TNF-A (बी) और 8 के लिए LPS के साथ या unstimulated इलाज पट्टिका टुकड़े की सतह पर तैरनेवाला में MCP-1 (सी) घंटा दिखाया गया है. यह परिणाम पांच स्वतंत्र experimen का औसत प्रतिनिधित्वटीएस. परिणाम बॉक्स मतलब प्रदर्शित भूखंडों और 25 वें और बक्से और 10 वें और मूंछ के रूप में 90 वें प्रतिशतक के रूप में 75 वें प्रतिशतक के रूप में दिखाया गया है. इसके अलावा, LPS की (phosphorylated) ERK 1/2 के लिए प्रतिनिधि पश्चिमी सोख्ता उत्तेजित या 3 घंटा चित्रा 3 डी में प्रदर्शित किया जाता है के बाद सुसंस्कृत atherosclerotic घावों नियंत्रित करते हैं. मूंछ के रूप में मतलब + SEM प्रदर्शित स्तंभ बार रेखांकन पांच स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. *: पी <0.01.
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Discussion
यहाँ हम atherosclerotic घाव जीव विज्ञान पर संभावित प्रासंगिक पदार्थों के प्रभाव की जांच के लिए एक पूर्व vivo पट्टिका संस्कृति मॉडल प्रस्तुत करते हैं. इस पूर्व vivo विधि का बड़ा लाभ यह भड़काऊ कोशिकाओं और उनके सेलुलर परस्पर क्रिया के साथ ही भड़काऊ रास्ते और मानव atherosclerotic घावों के भीतर Cascades पर संकेत पदार्थों के प्रभाव का मूल्यांकन करने की क्षमता है. कई प्रयोग करने योग्य तरीकों (जैसे RT-पीसीआर, पश्चिमी धब्बा, immunohistochemistry, प्रवाह cytometry, एलिसा) atherosclerotic घाव सूजन पर ब्याज के पदार्थ के प्रभाव के लिए एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करने के लिए मदद करते हैं.
murine atherosclerosis में सूजन प्रक्रियाओं पर अच्छी तरह से व्यक्त ब्याज 11 के कुछ जीनों या कमी माउस मॉडल के लिए धन्यवाद भी, समझ रहे हैं. हालांकि, निष्कर्ष हमेशा निकट मानव 6-9,13 के अनुरूप नहीं है. Atherosclerotic चूहों आमतौर पर एक वैकृत उच्च चोल प्राप्तआहार 6 esterol. इसके अलावा, यह मनुष्यों और चूहों के बीच प्रतिरक्षा प्रणाली काफी मतभेद 7-9 चलता है कि जाना जाता है. यहाँ, हम Niessner एट अल. 14 के रूप में दिखाया मानव atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिसर पर ब्याज की एक पदार्थ के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है जो एक पूर्व vivo पट्टिका संस्कृति मॉडल, प्रस्तुत करते हैं. इसके अलावा, विभिन्न अतिरिक्त तरीकों murine पढ़ाई करने के लिए तुलनीय एक पट्टिका संस्कृति प्रयोग के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, पूर्व vivo मॉडल कुछ मामलों में vivo अध्ययन में murine बदलने के लिए संभावना को खोलता है और मानव जीव विज्ञान के लिए murine प्रणाली और अनुवाद में अणु को बढ़ावा देने के एक ख्यात atherosclerosis के बीच एक उत्कृष्ट ब्रिजिंग विधि का प्रतिनिधित्व कर सकते.
atherosclerosis के लिए मानव पूर्व vivo मॉडल में इन विट्रो सेल प्रयोगों के साथ तुलनीय नहीं है. सेल लाइनों को आसानी से संग्रहीत और सुसंस्कृत हैं, लेकिन हो सकता है phenotypically और फूप्राथमिक कोशिकाओं को nctionally समान नहीं. ताजा कोशिकाओं नियमित रूप से रक्त ड्रॉ के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह उन्हें कभी कभी संस्कृति के लिए बहुत मुश्किल है और संस्कृति कई कारकों के अधीन है. इसके अलावा, इन विट्रो सेल संस्कृति प्रयोगों में उपयोग करके, यह atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिसर पर विशिष्ट अणुओं के प्रभाव की जांच करना संभव नहीं है. इस प्रकार, इन विट्रो प्रयोगों में मानव जीव विज्ञान की जांच के लिए प्रारंभिक (translational) कदम के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन आगे मानव atherosclerosis, atherosclerotic घावों के भीतर भड़काऊ cascades और मार्ग पर विशेष रूप से सेलुलर परस्पर क्रिया और प्रभाव की अवधारणा में ब्याज की अणु की भूमिका का विश्लेषण करने में विफल .
मोनाको एट अल. मानव atherosclerotic ऊतक 15 से पृथक कक्षों की एक महत्वपूर्ण अल्पकालिक संस्कृति प्रणाली की स्थापना की. वे collagenase, इलास्टेज और DNase के एक enzymatic मिश्रण का इस्तेमाल किया है. इस विधि की अनुमति देता है Lesi की जांचमार्ग विश्लेषण और adenoviral वैक्टर के साथ जीन स्थानांतरण पढ़ाई संकेत onal सेल सेल प्रयोगों. लेकिन यह एंजाइमी मिश्रण कोशिकाओं को प्रभावित करती है कि कैसे सक्रियण की यानी स्नातक अनजान बनी हुई है, इसके अलावा आदि सतह मार्कर अभिव्यक्ति, यह इन प्रयोगों के परिणामों atherosclerotic घावों के अंदर असली प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित सवाल है कि क्या किया जा सकता है. इसके अलावा, कोशिकाओं के मूल स्थान एंजाइमी मिश्रण से नष्ट हो जाएगा और अल्पकालिक संस्कृति प्रणाली में इन विट्रो सेल प्रयोगों के रूप में ही सीमाएं हैं.
एक atherosclerotic घाव के अंदर विशेष सेल या कोशिका जनसंख्या अध्ययन के लिए, यह लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदन विधि का उपयोग करना संभव है. ब्याज की सेल या कोशिका यौगिक एक अवरक्त या यूवी लेजर और शाही सेना डीएनए या प्रोटीन विश्लेषण किया जा सकता का उपयोग करके ऊतक से बाहर कटौती की जाएगी. लेजर कब्जा सूक्ष्म विच्छेदन, कोशिका की सतह रिसेप्टर expre कोशिकाओं को नुकसान होता दिखाई नहीं देताssion आदि विधि का लाभ एक atherosclerotic घाव अंदर एक सेल या ब्याज की एक स्थान का विश्लेषण है. लेकिन यह आगे ऐसे में इन विट्रो अध्ययन के रूप में कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए संभव नहीं है.
पूर्व vivo मॉडल निष्कर्षों को मापने और विश्लेषण करने के संभावित तरीकों की एक विस्तृत श्रृंखला implicates. वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन Niessner एट अल. 14 के रूप में दिखाया जीन अभिव्यक्ति के स्तर की जांच के लिए शाही सेना अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण के बाद किया जा सकता है. Immunohistochemistry atherosclerotic घावों के अंदर प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेलुलर मूल साबित करने के क्रम में प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए एक स्थापित उपकरण है. पश्चिमी सोख्ता संकेत रास्ते का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, एक एंजाइम समाधान में पाचन द्वारा सेल अलगाव आगे उदाहरण सेल प्रकार, सेलुलर उपप्रकार और सक्रियण के ग्रेड के लिए विश्लेषण करने के लिए प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन करने का अवसर को खोलता है. इसके अलावा, के बाद सेल अलगावspectratyping आगे टी सेल रिसेप्टर परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छा तरीका का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, पाचन चुंबकीय सेल अलगाव के बाद आगे की इन विट्रो अध्ययन या माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए विशिष्ट सेलुलर उपप्रकार की सेल जुदाई के एक सिद्ध उच्च गुणवत्ता विधि है. पर पिछले, supernatants एलिसा द्वारा प्रोटीन माप के लिए एकत्र किया जा सकता है. अंत में, पूर्व vivo मॉडल मानव atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिवेश में सटीक परिवर्तन की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है.
पूर्व vivo मॉडल endarterectomy नमूनों पर आधारित है. विभिन्न व्यक्तियों से प्राप्त atherosclerotic सजीले टुकड़े का उपयोग कर एक अंतर सेलुलर संरचना का अधिक से अधिक डिग्री और ब्याज की जीन / प्रोटीन के स्तर की इस प्रकार अधिक भिन्नता हो सकती है. भड़काऊ प्रतिक्रिया fibrosclerotic lesio में स्पष्ट रूप से कम है क्योंकि इस प्रकार, यह, बल्कि fibrosclerotic घावों 10 से लिपिड अमीर या जटिल पट्टिका नमूने का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैएनएस. इसलिए, यह पट्टिका संस्कृति प्रयोगों के परिणामों का विश्लेषण करने से पहले पट्टिका आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए महान ब्याज की है.
इसके अलावा, प्रत्येक नमूना नमूना फैटी धारियाँ और उठी सजीले टुकड़े करने के लिए एक परिगलित कोर के विकास की दिशा में प्रारंभिक endothelial रोग और लिपिड संचय कदम से atherosclerotic घाव विकास / प्रगति, के विभिन्न चरणों में हैं. इस प्रकार, पट्टिका ऊतक की विविधता को कम करने के क्रम में, यह आम तौर पर मेदार्बुदजनन के प्रारंभिक चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो किनारों में कटौती करने के लिए आवश्यक है.
इसे काटने ऊतक चोट की प्रतिक्रियाएं लाती है अपवर्जित नहीं किया जा सकता. लेकिन हमारे पट्टिका टिशू कल्चर प्रयोगों गैर सुसंस्कृत पट्टिका ऊतकों को सुसंस्कृत पट्टिका ऊतकों की तुलना जीन अभिव्यक्ति के स्तर से पता चला है. इस प्रकार, यह वर्तमान विधि atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिवेश की जांच के लिए एक अच्छा उपकरण है कि रेखांकित करता है.
की संस्कृतिपट्टिका टुकड़े करने के लिए एक दिन का समय अवधि तक ही सीमित है. पट्टिका ऊतक एक दिन से भी अधिक सुसंस्कृत है, तो नाटकीय रूप से परिणाम बढ़ जाती है की भिन्नता. इसके अलावा, 3 दिनों के बाद पट्टिका रचना और आकारिकी गिर.
इस मॉडल को लागू करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि सीमाएं हैं. पूर्व vivo मॉडल atherosclerotic घावों में भड़काऊ परिवेश का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा तरीका है. फिर भी, प्रमुख घटक इस संदर्भ में याद कर रहे हैं. कोई hemodynamic सुविधाओं लागू कर रहे हैं और प्रणालीगत प्रभावों को पूरी तरह से लापता हैं. इसके अलावा, इस विधि के साथ यह अल्पकालिक परिवर्तन की जांच करने के लिए ही संभव है, लेकिन क्योंकि पट्टिका आकृति विज्ञान के पतन की एक लंबी अवधि के विश्लेषण का अभाव है.
अंत में, हम यहाँ मानव atherosclerotic घाव सूजन पर संभावित नए अणुओं की जांच में रुचि रखते हैं, जो शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा कि एक विधि प्रस्तुत करते हैं. पूर्व vivo पट्टिका गulture मॉडल murine और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच मतभेद से पीड़ित है, लेकिन यह हमारे atherosclerotic घावों के संदर्भ में सेलुलर परस्पर क्रिया का विश्लेषण और स्थानीय lesional भड़काऊ cascades और रास्ते की जांच करने के लिए अवसर का प्रतिनिधित्व करने की क्षमता देता है. यहाँ वर्णित पूर्व vivo पट्टिका संस्कृति विधि का उपयोग करने के लिए आसान है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और उपन्यास रोग तंत्र और चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और मान्य करने के लिए मदद मिल सकती है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए किसी भी संघर्ष नहीं है.
Acknowledgments
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए नादिन Wambsganss धन्यवाद. इस काम में जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) ईआर 682/2-1 और सी. Erbel को कार्डियोलॉजी जर्मन सोसायटी की ओर से एक अनुसंधान वजीफा के रूप में अच्छी तरह से एल झाओ को जर्मन शैक्षणिक सेवा हीडलबर्ग से एक अनुसंधान वजीफा द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
