Summary
アテローム性動脈硬化症は、慢性炎症プロセスです。本稿では、新鮮な頸動脈または冠動脈プラークを調査するためにex vivoでモデルを使用して簡単に示す。 ex vivoでのモデルは、様々な方法で分析することができる人間のアテローム性動脈硬化病変および結果における炎症環境への潜在的な物質の調査を可能にする。
Abstract
アテローム性動脈硬化症は、血管系の慢性炎症性疾患である。アテローム性動脈硬化病変における炎症化合物を研究するために様々な方法があります。マウスモデルは、アテローム発生における炎症過程を調べるための重要なツールであるが、これらのモデルは、マウスおよびヒトの免疫系との間の表現型および機能的な相違に苦しむ。 インビトロ細胞実験は、特異的物質により引き起こされる細胞型依存性変化を評価するために使用される関心が、文化に依存する変動およびアテローム性動脈硬化病変における炎症化合物の文脈で特定の分子の影響を分析することができないことの結果の影響を制限。加えて、ヒト血液中の目的分子のレベルを測定することは、さらに、その臨床的関連性を調査するのに役立つが、これは、全身および局所炎症を表していない。そこで、ここでは、人間のアテローム性動脈硬化病変の生物学を研究するプラーク培養モデルを記述ex vivoで 。要するに、新鮮なプラークは、動脈内膜切除術または冠動脈バイパス移植術を受けた患者から得られ、使用するまで氷上にRPMI培地中に格納される。検体は、例えば、サイトカインまたはケモカイン、単独で、または規定の時間期間の組み合わせのような目的の物質に加えて、RPMI培地を含む48ウェルプレート中にランダムに分布し、続いて小片に切断する。インキュベーション後、プラーク片ショックは、mRNA単離のために凍結することができ、免疫組織化学染色のためにパラフィンや10月に埋め込んだり、強打およびウエスタンブロット法のために溶解させた。さらに、細胞は、フローサイトメトリー分析のためにプラークから単離することができる。さらに、上清をELISAによるタンパク質測定のために収集することができる。結論として、提示のex vivoモデルは、さらに新たな病気のメカニズムや治療標的の同定につながる可能性の炎症性病変生物学を研究する可能性を開く。
Introduction
慢性炎症性疾患などのアテローム性動脈硬化症は、先進国1-2の死亡の主要な原因の一つである。アテローム性動脈硬化症、特に急性冠症候群の合併症には、アテローム血栓症および血管閉塞3を引き起こす脆弱性病変の破裂にリンクされている。自然免疫と獲得免疫は、アテローム2,4-5の全てのステップの間に関与していると思われる。著しい進歩が心筋梗塞の治療においてなされてきたが、アテローム性動脈硬化症および心血管有害事象の効果的な予防は、まだ未解決である。これにより、病変の生物学を研究すること、アテローム性動脈硬化症の病態生理に我々の知識を増加させるために不可欠であり、新規な治療標的とする新規治療法の開発の識別を可能にする。
多くの場合、マウスモデルは、特定の疾患の病態生理を研究するために使用される。しかし、マウスモデルを使用してアテローム発生を研究することであるアコいくつかの制限によりmpanied：（1）通常、アテローム性動脈硬化症のマウスは、高コレステロール食を受ける。これらのモデルにおけるコレステロールレベルが上昇したコレステロールの血清レベル6を有する患者のものと比較することはできません。 （2）マウスおよびヒトの免疫系との間の実質的な差異がある;ヒトT細胞におけるヒトFoxp3発現は、必ずしも調節表現型7を与えないのに対し、このようにしてFOXP3は、マウスの調節T細胞の特異的マーカーである。また、ヒトにおいて定義した通りのTh1/Th2パラダイムは、マウスT細胞を完全に譲渡することはできません。 （3）対、例えばF4/80および古典的（M1）のマーカーとしてのマウス単球およびマクロファージを識別するために使用されるマーカーの数は、代替（M2）活性化パターンがヒト骨髄細胞8には存在しない。 （4）マウスおよびヒト末梢血単核球の遺伝子発現は、9は実質的に異なることが見出されている。
このように、我々の理解を高めるために人間のアテローム性動脈硬化症における慢性炎症のプロセスは、我々はヒト組織、血液や細胞を扱うモデルを活用する必要があります。ここでは、ヒトの炎症性病変の生物学の概念に潜在的新規物質の調査を可能にする人間のプラーク組織培養のモデルを記述。
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Protocol
以下のように1。培地を調製
- 培養液：RPMI培地。
- 10％ウシ胎児血清（FCS）を添加する。
- 100 U / mlのペニシリンG、および100グラム/ mlストレプトマイシンを追加します。
使用するまで、新鮮なプラークシリンダーの2。ストレージ
- 重要な頸動脈狭窄症虚血症状の有無にかかわらず患者の頸動脈内膜剥離操作（脳卒中、一過性脳虚血発作）は、心臓外科医によって冠動脈バイパス術の際に血管外科医や冠動脈内膜切除によって行われます。頚動脈/冠状動脈プラーク5は、先に説明したようにプラークの構造を維持するために一括して除去する必要がある。
- プラーク摘出場所後、培地充填管中の検体とは、使用するまで（プラークが完全に培地に覆われる必要がある）氷の上に保管します。
3。プラーク処理
- 十分な細胞培養ディッシュ（ 例えば 60ミリメートル）を使用と5ミリリットルRPMI培地を追加します。
- 培養皿（プラークを完全培地でカバーされるべきである）にプラーク組織を置きます。
- 滅菌ピンセットを使って、組織の端に慎重にプラーク組織を保持します。
- 滅菌メスを使用してプラークサンプルの縁を切り落とした。
- 半分にプラーク組織を分割する。
- （石灰化、脂質豊富、破裂、血栓、線維症）、肉眼病変形態を評価する。
- 免疫組織化学によるex vivoでの実験後に正確なプラーク形態を分析します。 AHA分類10を使用してください。
- 重度の石灰化や線維症のプラークを捨てる。
- 相同小片（3×3×3ミリメートル）にプラーク組織を切断。
- ショックは2プラーク部分を凍結し、使用するまで、病変の基本的な価値観のために液体窒素中で保管してください。
- 48ウェルプレートを準備します。
- よく実験に用いた各500μlのRPMI培地を追加します。
- ご利用下さい各グループのT少なくとも2プラーク枚。
- 目的の物質（ 例えば 、特定のサイトカインおよびケモカイン）を追加します。
- コントロールとして未刺激のプラークの部分を使用してください。
- ランダムにウェルにプラーク片の充当数を植える。
- 示された時点培養プラーク片。
- リポ多糖（LPS）によるプラーク組織刺激実験のために
- 3時間、8時間および24時間：以下の時点を使用してください。
- それぞれ各時点で刺激していないグループのLPS及び2のための2プラーク片を使用してください。
- リポ多糖の1μg/ mlのを追加します。
- インキュベーション中、5％CO 2を含む加湿空気中、37℃で48ウェルプレートを維持する。
4。後示された時間の収穫プラーク組織片
- ショックは、詳細な情報を参照原用（mRNA単離とcDNA合成のためのプラーク片を凍結するCOLセクション5）。
- 上清を回収し、ELISA分析のために-20℃でそれを格納し。
- ウェスタンブロッティングのために、プラーク組織を粉砕し、溶解する。 0.65ミクロンと0.1ミクロン遠心濾過装置を通して溶解液をフィルタリングします。
- 免疫組織化学染色のための組織-TECまたはパラフィンにプラーク組織を埋め込む。
培養されたプラーク片から5。RNA抽出
- 均質化のためにはTissueLyserを使用してください。
- 製造業者の説明書に従ってキット（材料の表を参照）を用いてRNAを単離する。
- 分光光度計を用いて、サンプルのRNAの量と質を決定します。
- 製造者の指示に従って逆転写のためのcDNAベーリンガーキットを使用する。
- 定量的PCRのために、例えばSYBR Greenを持つロシュリアルタイムPCRキットを使用しています。
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Representative Results
ここでは、ex vivoでのプラーク培養の結果を証明する図形の数を提示する。 ex vivoでのモデル実験における関心対象の薬剤に応答した炎症性環境の変化を評価するために、我々は、アテローム発生における主に関与することが知られている異なる分子を測定する。代表アテローム発生促進性のサイトカインとして、我々はのTNFα、IL6およびIFNgの2,11]を選択します。加えて、我々はプロ血栓性変化を評価するフォンビルブランド因子と組織因子を用いる。更に、目的の作用物質により誘導される不安定プラークの発達に対処するために、マトリックスメタロペプチダーゼ9（MMP9）のレベルが分析される。 Chemoattractanceはまた、プラークの進行および退行11の重要なステップであり、従って、我々はCCL2のレベルを調査し、また単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、単球/マクロファージ化学誘引物質のための原理と呼ぶ。セル吸引細胞ローリングおよび接着後、次のステップである。そのため我々は、ICAM-1を選択します。さらに、目的の物質の影響を受けるシグナル伝達経路を解析することにより、我々は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK1 / 2）、広く発現し、サイトカイン、アポトーシス、分化、ウイルス感染、およびヘテロ三量体Gタンパク質のリガンドのような多くの異なる刺激によって活性化を使用共役受容体12。
まず、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）（ 図1）によって分析し、非刺激培養アテローム硬化性病変の炎症化合物の経時変化を示す。プラーク培養中、炎症性病変環境の活性の増加を観察することができる。差異は無い培養（データは示さず）対3時間後に見られなかった。 24時間後に、アップレギュレーションがあったのに対し、プラーク培養8時間後、我々は、IL6のようないくつかの分子のではなく、TNFのAおよびIFN gのわずかなアップレギュレーションを発見このようなTNF A、IL6およびIFNグラムなど、様々な分子の。注目すべきは、プラークの文化の時間が長いほど、より高い分子発現の変化がある。
第二に、アテローム硬化性病変において炎症環境に影響を与える可能性を実証するために、我々は、定量RT-PCRにより測定し3時間、1μg/ mlのLPS（ 図2）とともにインキュベートし、プラーク片の結果を示す。刺激されていないプラーク片は、陰性対照とした。私たちは、LPSがアテローム性動脈硬化病変の内側の炎症化合物の活性化の程度の著しい増加を誘導することを見出した。種々のサイトカイン（IL6、TNF A等、 図2A-B）、ケモカイン（CCL2など、図示せず）、接着（ICAM1、図示せず）、プラーク不安定化（マトリックスは示さず、図9（MMP9）のメタロペ）およびプロ血栓性分子（ フォン·ヴィレブランド因子、 図2C、 第三に、タンパク質の存在量を評価するために、培養された病変の上清をELISAにより分析し、ウェスタンブロット（ 図3D）によってプラーク組織を壊した。 図3A〜Cでは、LPSまたは8時間の制御とインキュベートし、培養標本の上清中のIFN-G、MCP-1およびTNF-αのELISA分析を示している。また、（リン酸化）ERK 1 /強打及びリーシスプラーク組織の2、LPSまたは対照のいずれかで刺激するためのウェスタンブロット分析を、 図3Dに示されている。 
図1。時間をかけて炎症性病変化合物上の歯垢培養の効果動脈硬化性プラーク片はすぐにショックをされた8のために凍結または培養または示されたサイトカインIL6（A）、IFN gの （B）及びTNF（C）の24時間および発現は、定量RT-PCRによって分析した。示した結果は、5つの独立した実験の平均を表す。各群の5アテローム硬化性病変片は、示された時点について使用した。値は、B-アクチンに正規化され、cDNAコピー/ 1,000 B-アクチンのコピーとして表現。結果は、平均して25 番目と75 番目のパーセンタイルボックスなどのウィスカとして10 番目と90 番目のパーセンタイルを表示するボックスプロットとして表示されます。 *：P <0.01。 
図2。種々の炎症性分子の増加を誘導し、培養プラーク片のLPS刺激。プラーク片を1μg/ mlのLPSで培養したまたは3時間刺激されていないと定量RT-PCRにより分析した。示した結果は、5つの独立した実験の平均を表す。各グループの二枚を使用した。値は、B-アクチンに正規化され、cDNAコピー/ 1,000 B-アクチンのコピーとして表現。結果は、平均して25 番目と75 番目のパーセンタイルボックスなどのウィスカとして10 番目と90 番目のパーセンタイルを表示するボックスプロットとして表示されます。 *：P <0.01。 
図3培養上清中のプラークのタンパク質発現。8 LPS刺激されていないかで処理されたプラーク片の上清中のサイトカインIFN-gの（A）、TNF-（B）およびMCP-1（C）の代表的なELISA測定時間が示されている。示した結果は、5つの独立したexperimenの平均を表すTS。結果は、平均して25 番目と75 番目のパーセンタイルボックスなどのウィスカとして10 番目と90 番目のパーセンタイルを表示するボックスプロットとして表示されます。 3時間後に、図3Dに実証された後に加えて、LPSの（リン酸化）ERK 1/2のための代表的なウエスタンブロット法は、培養されたアテローム性動脈硬化病変を刺激したり制御します。ウィスカーのような平均+ SEMを表示する列の棒グラフは、5つの独立した実験の平均を表す。 *：P <0.01。
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Discussion
ここでは、アテローム性動脈硬化病変生物学に関連する可能性の物質の影響を調査するためにex vivoでのプラーク培養モデルを提示する。このex vivo法の主な利点は、炎症性細胞およびそれらの細胞の相互作用だけでなく、人間のアテローム性動脈硬化症の病変内炎症経路およびカスケードに記載されている物質の影響を評価する能力である。いくつかの利用可能な方法（ 例えば 、RT-PCR、ウェスタンブロット、免疫組織化学は、フローサイトメトリー、ELISA）アテローム性動脈硬化病変炎症に対する関心物質の影響を総合的に分析を提供するのに役立ちます。
マウスアテローム性動脈硬化症における炎症過程はよく過剰発現関心11の特定の遺伝子を欠いているか、マウスモデルのおかげでも、理解されている。しかし、調査結果は常に密接に人間6-9,13に対応していません。アテローム性動脈硬化症のマウスには、通常、病理学的に高いチョルを受け取るダイエット6エステロール。加えて、ヒトとマウスとの間の免疫系は実質的な差異7-9を示すことが知られている。ここでは、Niessner らによって示されるように、人間のアテローム性動脈硬化病変における炎症化合物に関心のある物質の影響を研究することができex vivoでのプラーク培養モデルを提示。14。さらに、種々の追加の方法は、マウスの研究に匹敵するプラーク培養実験の結果を分析するために使用することができる。したがって、ex vivoでのモデルは、いくつかの場合においてインビボ研究において 、マウスを交換する可能性を開き、ヒト生物学にマウス系および翻訳を促進する分子で推定上のアテローム性動脈硬化症との間の優れた架橋方法を表すことができる。
アテローム性動脈硬化症のための人間のex vivoモデルは、in vitroの細胞実験と比較することはできません。細胞株は容易に保存し、培養されますが、することができ、表現型とFU初代細胞へのnctionally同一ではない。新鮮な細胞は、通常の血液引き込むことによって得ることができるが、それは時々それらを培養することは非常に困難であり、培養物は、多くの要因に供される。加えて、 インビトロ細胞培養実験に使用することにより、アテローム硬化性病変における炎症性化合物上の特定の分子の影響を調査することは不可能である。このように、in vitroの実験では、ヒト生物学の調査のための初期（並進）ステップのために重要であるが、さらに人間のアテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化病変内の炎症カスケードおよび経路上の、特に携帯の相互作用と影響力の概念に目的の分子の役割を分析するために失敗する。
モナコらは、ヒトのアテローム性動脈硬化組織15から単離した細胞の重要な短期的な培養系を確立した。彼らは、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびDNA分解酵素の酵素混合物を使用している。この方法は、国際ライセンス協会の調査を可能にする経路分析およびアデノウイルスベクターによる遺伝子導入研究をシグナリングonal細胞 - 細胞実験。それはまた、酵素混合物が細胞にどのように影響するか活性化表面マーカーの発現等の卒業生、すなわち未知のままであるが、それはこれらの実験の結果は、アテローム性動脈硬化病変内の実プロセスを反映するかどうかを疑問視することができる。さらに、細胞の元の場所は、酵素混合物によって破壊され、短期培養系は、 インビトロ細胞実験と同じ制限を有している。
アテローム性動脈硬化病変内の特定の細胞または細胞集団研究のために、レーザー捕捉顕微解剖法を用いることができる。目的の細胞または細胞の化合物は、赤外線またはUV-レーザーとRNA、DNAまたはタンパク質分析を行うことができる用いて組織から切断される。レーザー捕捉顕微解剖は、細胞表面受容体expreの細胞を損傷していないようssionなど方法の利点は、アテローム性動脈硬化病変の内部目的の細胞または場所の分析である。しかし、それはさらに、 インビトロ研究のような細胞を評価することは不可能である。
エクスビボモデルは、調査結果を測定し、分析するための可能な方法を幅広く関与。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応はNiessner ら 14によって示されるように、遺伝子発現レベルを調べるためにRNA単離およびcDNA合成後に行うことができる。免疫組織化学は、タンパク質発現およびアテローム性動脈硬化病変の内部細胞起源を証明するために、タンパク質レベルを評価するための確立されたツールである。ウェスタンブロッティングは、信号経路を分析するために使用することができる。また、酵素溶液中で消化による細胞の単離は、更に、インスタンス細胞タイプ、細胞サブタイプおよび活性化の程度を分析するためにフローサイトメトリー分析を実行する機会を開く。さらに、細胞単離後スペクトラはさらに、T細胞受容体の可変性を分析するために良い方法を表す。また、消化磁気細胞単離後、さらにin vitro試験やマイクロアレイ解析のための特定の細胞サブタイプの細胞分離の実績のある高品質な方法です。最後に、上清を、ELISAによるタンパク質測定のために収集することができる。結論として、ex vivoでのモデルは、人間のアテローム性動脈硬化病変における炎症性環境での正確な変化を調査するための貴重なツールです。
ex vivoでのモデルは、動脈内膜切除標本に基づいています。異なる個体から得られた動脈硬化性プラークを使用すると、差動細胞組成のより大きな程度および目的の遺伝子/タンパク質のレベルのより高い変動をもたらし得る。炎症反応はfibrosclerotic lesio著しく低いので、従って、それは、脂質に富むプラークや複雑なサンプルではなくfibrosclerotic病変10を使用することが重要であるNS。したがって、プラーク培養実験の結果を分析する前にプラーク形態を評価するために非常に興味深い。
また、各検体試料は、脂肪線条と破裂プラークの壊死性コアの開発に向かって最初の内皮機能不全および脂質蓄積段階から、アテローム硬化性病変発症/進行の異なる段階を含む。したがって、プラーク組織の不均一性を最小限にするためには、一般にアテローム発生の初期段階を表すエッジを切断することが必要である。
これは、切断組織損傷応答を誘導することを排除することはできない。しかし、我々のプラーク組織培養実験は、非培養プラーク組織に培養されたプラーク組織の同等の遺伝子発現レベルを示した。したがって、これは現在のメソッドがアテローム性動脈硬化病変における炎症環境を調査するための良いツールであることを強調している。
文化プラーク片は、最大一日の時間に制限される。プラーク組織は、劇的な結果は増加の変化日以上培養する場合。また、3日後にプラーク組成や形態が崩壊する。
このモデルを適用する際に留意する必要がある制限があります。 ex vivoでのモデルは、アテローム性動脈硬化病変における炎症環境を研究するための良い方法です。それにもかかわらず、主要なコンポーネントは、このコンテキストでは不足しています。いいえ血行動態の機能が適用されておらず、全身の影響が完全に欠落しています。また、この方法では、それは短期的変化を調査することだけが可能であるが、なぜならプラーク形態の崩壊の長期分析を欠いている。
結論として、我々はここで、人間のアテローム性動脈硬化病変炎症に対する潜在的な新しい分子の研究に興味を持っている研究者のために有用であろう手法を提案する。 ex vivoでのプラークCultureモデルは、マウスおよびヒトの免疫系との違いに苦しんでいますが、それは私たちに、アテローム性動脈硬化病変の文脈における細胞の相互作用を分析し、ローカル病変炎症カスケードおよび経路を調査する機会を表現できるようになります。ここで説明エクスビボプラークの培養方法は、使いやすく、再現可能であり、新規な病気のメカニズムおよび治療 標的を同定および検証するのに役立ち得る。
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Disclosures
著者らは、開示する競合を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、優れた技術支援のためナディーンWambsganssに感謝します。この作品は、ドイツ研究協会（DFG）のER 682/2-1とC Erbelに心臓病のドイツ社会からの研究奨学金だけでなく、L·趙にドイツ学術サービスハイデルベルクからの研究奨学金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
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