Summary
Aterosklerose er en kronisk inflammatorisk prosess. Dette manuskriptet illustrerer en enkel å bruke ex vivo modell for å undersøke frisk carotis eller koronar plakk. Den ex vivo modellen gir mulighet for etterforskningen av mulige stoffer på inflammatorisk miljø i menneske aterosklerotiske lesjoner og resultatene kan analyseres ved ulike metoder.
Abstract
Aterosklerose er en kronisk inflammatorisk sykdom av vaskulaturen. Det finnes ulike metoder for å studere den inflammatoriske forbindelsen i aterosklerotiske lesjoner. Musemodeller er et viktig verktøy for å undersøke inflammatoriske prosesser i aterogenese, men disse modellene lider av de fenotypiske og funksjonelle forskjeller mellom de murine og humane immunsystem. In vitro-celleforsøk til å spesifikt å evaluere celletype-avhengige endringer forårsaket av en substans interesse, men kulturavhengige variasjoner og manglende evne til å analysere påvirkningen av spesifikke molekyler i sammenheng med den inflammatoriske forbindelsen i aterosklerotiske lesjoner begrense virkningen av resultatene. I tillegg er måling av nivåene av et molekyl av interesse i humant blod bidrar til ytterligere å undersøke dens klinisk betydning, men dette representerer ikke systemisk og lokal inflammasjon. Derfor har vi her beskrive en plakett kultur modell for å studere menneskelig aterosklerotisk lesjon biologiex vivo. Kort sagt, er friske plaketter innhentet fra pasienter som gjennomgår endarterektomigruppen eller koronar bypass grafting og lagret i RPMI medium på is inntil bruk. Prøvestykkene blir skåret i små stykker, etterfulgt av en tilfeldig fordeling i en 48-brønns plate, inneholdende RPMI medium i tillegg til et stoff av interesse, slik som cytokiner eller kjemokiner alene eller i kombinasjon for et gitt tidsrom. Etter inkubasjon, kan plakk bitene sjokk frosset for mRNA isolering, innebygd i parafin eller oktober for immunhistokjemi flekker eller knust og lysert for western blotting. Videre kan cellene isoleres fra plakk for strømningscytometri-analyse. I tillegg, kan supernatantene samles opp for målinger protein ved hjelp av ELISA. Som konklusjon, åpnes frem ex vivo-modell muligheten for ytterligere å studere inflammatorisk lesional biologi, noe som kan resultere i identifikasjon av nye sykdomsmekanismene og terapeutiske mål.
Introduction
Åreforkalkning som en kronisk inflammatorisk sykdom er en av hovedårsakene til dødsfall i industrialiserte land 1-2. Komplikasjoner av aterosklerose, spesielt akutt koronarsyndrom, har vært knyttet til ruptur av sårbare lesjoner, forårsaker atherothrombosis og fartøy okklusjon tre. Medfødte og adaptive immunitet synes å være involvert i alle trinn av atherogenesis 2,4-5. Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort i behandling av hjerteinfarkt, effektiv forebygging av aterosklerose og uønskede kardiovaskulære hendelser er fortsatt uløst. Således studere lesional biologi er viktig for å øke vår kunnskap om patofysiologien av aterosklerose og for å tillate identifisering av nye terapeutiske mål og utviklingen av nye behandlingsformer.
I mange tilfeller, er murine modeller som brukes til å undersøke patofysiologien av spesifikke sykdommer. Men studerer atherogenesis bruker musemodeller er accompanied av flere begrensninger: (1) Vanligvis aterosklerotiske musene mottar en høy kolesteroldiett. Kolesterolnivået i disse modellene kan ikke sammenlignes med de i pasienter med forhøyet kolesterol serumnivåer seks. (2) Det er store forskjeller mellom murine og menneskets immunsystem; dermed foxp3 er en spesifikk markør for murine regulatoriske T-celler, mens menneskelig foxp3 uttrykk i humane T-celler ikke nødvendigvis gi et regulatorisk fenotype 7. Dessuten er Th1/Th2 paradigmet som definert i mennesker ikke helt overføres til murine T-celler. (3) En rekke markører som brukes til å identifisere murine monocytter og makrofager, som F4/80 og markører for klassisk (M1) g. alternativ (M2) aktivering mønstre ikke finnes i humane myeloid-celler 8. (4) Gene expression of murine og humane perifere blod-monocytter er blitt funnet å være vesentlig forskjellig ni.
Derfor, for å øke vår forståelse avkroniske inflammatoriske prosesser i menneskelig aterosklerose, trenger vi å gjøre bruk av modeller som arbeider med menneskelig vev, blod eller celler. Her beskriver vi en modell av menneskelig plakk vev kultur, noe som gjør etterforskningen av mulige nye stoffer i begrepet menneskelig inflammatorisk lesional biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbered medium som følger
- Kultur Medium: RPMI medium.
- Tilsett 10% føtalt kalveserum (FCS).
- Tilsett 100 U / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin.
2. Lagring av fersk plakk sylinder før bruk
- Den endarterectomi drift av pasienter med eller uten iskemiske symptomer (slag, forbigående iskemisk hjertesykdom) med en betydelig carotisar stenose vil bli gjort av karkirurger og koronar endarterektomigruppen under koronar bypass grafting av hjerte kirurger. Carotis / koronar plakk må bli fjernet en bloc å bevare plakkstrukturen som tidligere beskrevet 5.
- Etter plakk extirpation sted prøven i et medium fylt rør og lagre det på is (plakk må være helt dekket med medium) inntil bruk.
Tre. Plakk behandling
- Bruk en tilstrekkelig cellekultur fatet (f.eks 60 mm)og tilsett 5 ml RPMI medium.
- Plasser plaque vevet inn i dyrkningsskål (plaque skal være fullstendig dekket med medium).
- Hold plaque vevet forsiktig ved kantene av vevet ved hjelp av sterile pinsetter.
- Skjær av kantene av plakkprøve ved hjelp av en steril skalpell.
- Fordel plakk vev i halvparten.
- Vurdere lesjon morfologi makroskopisk (forkalket, lipid rik, sprukket, trombe, fibrose).
- Analyser den nøyaktige plakk morfologi etter ex vivo eksperiment ved immunhistokjemi. Bruk AHA klassifisering 10.
- Kast plaketter med alvorlig forkalkning eller fibrose.
- Skjær plaque vevet inn homologe små stykker (3 x 3 x 3 mm).
- Shock fryse to plakk stykker og lagre dem i flytende nitrogen for grunnleggende verdier av lesjon inntil bruk.
- Forbered en 48-brønns plate.
- Legg 500 pl RPMI medium til hver brønn anvendes for forsøket.
- Vennligst bruk ent minste to plakk stykker for hver gruppe.
- Legg stoffet av interesse (f.eks spesifikke cytokiner og kjemokiner).
- Bruk unstimulated plakk stykker som kontroller.
- Tilfeldig plante bevilget antall plakk stykker i brønnene.
- Kultur plakett stykker for angitte tidspunkter.
- For plakk vev stimulering eksperiment med Lipopolysaccharide (LPS)
- Bruk følgende tidspunkter: 3 hr, 8 timers og 24-timers.
- Bruk to plakk stykker for LPS og to for unstimulated gruppe for hvert tidspunkt henholdsvis.
- Tilsett 1 ug / ml lipopolysakkarid.
- I løpet av inkubasjonen, opprettholde 48-brønners plate ved 37 ° C i fuktet luft som inneholdt 5% CO2.
4. Etter angitt tid høste plakk vev stykker
- Sjokkere fryse plakett stykker for mRNA isolering og cDNA syntese (for detaljert informasjon-se protocol seksjon 5).
- Samle supernatanten og lagres ved -20 ° C for ELISA-analyse.
- For western blotting, smash og Lyse plakk vev. Filter lysatet gjennom en 0,65 mikrometer og 0,1 mikrometer sentrifugalfilter enhet.
- Embed plakk vev i vev-tec eller parafin for immunhistokjemi stainings.
5. RNA ekstraksjon fra dyrkede plakk stykker
- Bruk en TissueLyser for homogenisering.
- Isolere RNA ved hjelp av settet (se materialer tabell) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bestem RNA mengden og kvaliteten på prøvene med spektrofotometer.
- Bruk Boehringer cDNA kit for revers transkripsjon i henhold til produsentens instruksjoner.
- For kvantitativ PCR, bruker for eksempel Roche real-time PCR kit med SYBR Grønn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi en rekke tall som viser resultatene av ex vivo plakk dyrkning. For å vurdere endringer i inflammatorisk miljø som reaksjon på midlet av interesse i ex vivo-modell forsøket måler vi forskjellige molekyler som er kjent for å være primært involvert i aterogenese. Som representative pro-atherogenic cytokiner vi velger TNFa, IL6 og IFNg 2,11. I tillegg bruker vi von Willebrand faktor og vevsfaktor å evaluere pro-trombotiske endringer. Videre, for å ta opp utviklingen av plakk ustabilitet forårsaket av et middel av interesse, matrise metallopeptidase 9 (MMP9) nivåer vil bli analysert. Chemoattractance er også et viktig skritt i plakk progresjon og regresjon 11, altså, vi undersøke nivåene av CCL2, også referert til som monocytter kjemotaktisk protein-1 (MCP-1), prinsippet kjemoattraktant for monocytter / makrofager. Etter celle tiltrekning celle rullende og heft er følgende trinn.På grunn av at vi velger ICAM-1. Ved nærmere analyse av signalveier påvirket av stoffet av interesse bruker vi ekstracellulære-signal-regulert kinaser (ERK1 / 2), allment uttrykt og aktiveres av mange forskjellige stimuli som cytokiner, apoptose, differensiering, virusinfeksjon og ligander for heterotrimeric G protein -koblede reseptorer 12.
Først, viser vi tidsavhengige forandringer i den inflammatoriske forbindelsen med ustimulerte dyrkede aterosklerotiske lesjoner, analysert ved kvantitativ sanntid-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) (figur 1). Under plaque dyrking, kan observeres en økning av aktiviteten av den inflammatoriske lesional miljø. Ingen forskjell ble funnet etter 3 timers kontra ingen kultur (data ikke vist). Etter 8 timers kultur av plakk, har vi funnet bare en liten oppregulering av enkelte molekyler som IL6, men ikke av TNF a og IFN-g, mens det etter 24 timer, var det en oppreguleringav ulike molekyler slik som TNF a, IL6 og IFN g. Spesielt, desto lengre tid av plaque kultur jo høyere variant av molekylet uttrykk er.
For det andre, for å demonstrere gjennomførbarheten av å påvirke den inflammatoriske miljøet i aterosklerotiske lesjoner, vi presenterer resultatene av plakk stykker inkubert med 1 pg / ml LPS i 3 timer, målt ved QRT-PCR (figur 2). Unstimulated plaque stykker tjente som en negativ kontroll . Vi har funnet at LPS induserte en markert økning av graden av aktivering av inflammatoriske forbindelsen inne aterosklerotiske lesjoner. Forskjellige cytokiner (IL6, TNF-en etc., figur 2A-B), kjemokiner (CCL2 etc., ikke vist), adhesjon (ICAM1, ikke vist), plaque destabiliserende (Matrix metallopeptidase 9 (MMP9), ikke vist), og pro- trombotiske molekyler (von Willebrand faktor, figur 2C, Tredje å evaluere protein overflod, supernatants av dyrkede lesjoner ble analysert ved ELISA og knuste plakk vev av vestlige blotting (Figur 3D). På figur 3A-C viser vi ELISA analyse av IFN-g, MCP-1 og TNF-a i supernatanten av kulturprøver inkubert med LPS eller kontroll etter 8 timer. I tillegg, western blot analyse for (fosforylert) ERK 1/2 av knuste og lysated plakk vev, enten stimulert med LPS eller kontroll, er vist i Figur 3D. 
Figur 1. Effekt av plaque dyrkning på inflammatorisk lesional forbindelsen over tid.. Aterosklerotisk plakk stykker ble umiddelbart frosset sjokk eller dyrket i 8eller 24 timer og ekspresjon av angitte cytokiner IL6 (A), IFN g (B) og TNF-a (C) ble analysert ved QRT-PCR. De viste resultater er gjennomsnitt av fem uavhengige eksperimenter. Fem aterosklerotiske lesjon stykker for hver gruppe ble anvendt for angitte tidspunkt. Verdiene er normalisert til b-aktin og uttrykt som cDNA kopier / 1000 b-aktin kopier. Resultatene er vist som boksplott som viser gjennomsnittet og 25 th og 75 th percentiles som bokser og 10 th og 90 th persentiler som værhår. *: P <0,01. 
Figur 2. LPS stimulering av dyrkede plaque stykker induserte en økning på forskjellige inflammatoriske molekyler. Plaque stykker ble inkubert med 1 pg / ml LPSeller ustimulert i 3 timer og analysert ved QRT-PCR. De viste resultater er gjennomsnitt av fem uavhengige eksperimenter. Ble brukt to stykker for hver gruppe. Verdiene er normalisert til b-aktin og uttrykt som cDNA kopier / 1000 b-aktin kopier. Resultatene er vist som boksplott som viser gjennomsnittet og 25 th og 75 th percentiles som bokser og 10 th og 90 th persentiler som værhår. *: P <0,01. 
Fig. 3. Protein expression i supernatanten av dyrkede plakk. Representative ELISA-målinger av cytokiner IFN-g (A), TNF-a (B) og MCP-1 (C) i supernatanten av plaque biter som ble behandlet med LPS eller ustimulert for åtte hr vises. De viste resultater er gjennomsnitt av fem uavhengige experiments. Resultatene er vist som boksplott som viser gjennomsnittet og 25 th og 75 th percentiles som bokser og 10 th og 90 th persentiler som værhår. I tillegg er representative western blotting for (fosforylert) ERK 1/2 av LPS stimulerte eller kontrollere dyrkede aterosklerotiske lesjoner etter 3 timer er vist i Figur 3D. Kolonnen søylediagrammer som viser midlere + SEM som whiskers er gjennomsnitt av fem uavhengige eksperimenter. *: P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en ex vivo plakett kulturmodell for å undersøke påvirkning av potensielt relevante stoffer på aterosklerotisk lesjon biologi. Den store fordelen med dette ex vivo fremgangsmåte er evnen til å evaluere innflytelsen av angitte stoffer på inflammatoriske celler og deres cellulære veksel samt inflammatoriske trasé og kaskader innen human aterosklerotiske lesjoner. Flere brukbare metoder (f.eks RT-PCR, western blot, immunhistokjemi, flowcytometri, ELISA) bidrar til å gi en helhetlig analyse av virkningen av stoffet av renter på aterosklerotisk lesjon betennelse.
De inflammatoriske prosesser i murine aterosklerose er godt forstått, også takket være musemodeller over uttrykke eller mangler visse gener av interesse 11. Men resultatene ikke alltid nøye svarer til mennesker 6-9,13. Aterosklerotiske mus vanligvis mottar en patologisk høy cholesterol diett seks. I tillegg er det kjent at immunsystemet mellom mennesker og mus viser betydelige forskjeller 7-9. Her presenterer vi en ex vivo plaque kulturmodell, noe som gjør det mulig å studere påvirkningen av et stoff av interesse i den inflammatoriske forbindelsen i humane aterosklerotiske lesjoner som vist ved Niessner et al. 14.. Dessuten kan forskjellige andre metoder kan brukes for å analysere resultatene fra en plaque kultureksperiment, kan sammenlignes med murine studier. Derfor åpner ex vivo-modell muligheten for å erstatte murine in vivo studier i noen tilfeller, og kan utgjøre en utmerket brodannende metode mellom putative aterosklerose fremme molekyl i murine system og translasjon til human biology.
Den menneskelige ex vivo modell for aterosklerose ikke er sammenlignbare med in vitro-celleforsøk. Cellelinjer kan enkelt lagres og kultivert, men er fenotypisk og functionally ikke identisk med primære celler. Friske celler kan oppnås ved vanlige blodprøver, men det er av og til meget vanskelige å dyrke dem og kulturen utsatt for mange faktorer. I tillegg, ved bruk av in vitro cellekultur eksperimenter er det ikke mulig å undersøke innflytelsen av spesifikke molekyler i den inflammatoriske forbindelsen i aterosklerotiske lesjoner. Dermed in vitro eksperimenter er viktige for første (translasjonsforskning) skritt for menneskelig biologi undersøkelser, men ikke klarer å ytterligere analysere rollen til molekyl av interesse i begrepet menneskelig aterosklerose, spesielt cellulær samspill og innflytelse på inflammatoriske kaskader og sti innenfor aterosklerotiske lesjoner .
Monaco et al. Etablert en viktig korttidskultur system av celler isolert fra human atherosclerotic vev 15.. De har brukt en enzymatisk blanding av collagenase, elastase og DNase. Denne metoden gjør at etterforskningen av lesional celle-celle eksperimenter, signalveien analyse og genoverføring studier med adenovirus vektorer. Men det er fortsatt ukjent hvordan den enzymatiske blanding påvirker cellene, dvs. grad av aktivering, overflate markør uttrykk osv. I tillegg kan det stilles spørsmål ved om resultatene av disse eksperimentene gjenspeile de reelle prosessene inne aterosklerotiske lesjoner. Videre vil den opprinnelige plassering av cellene bli ødelagt av den enzymatiske blandingen og den korttidskultur-system har de samme begrensninger som de in vitro celleeksperimenter.
For spesifikke celle-eller celle populasjons undersøkelsene i en aterosklerotisk lesjon, er det mulig å bruke laser fange mikro disseksjon metode. Den celle-eller celle forbindelse av interesse vil bli kuttet ut av vevet ved hjelp av en infrarød-eller UV-laser og RNA, DNA eller protein-analyse kan utføres. Laseren fange mikro disseksjon synes ikke å skade cellene, celleoverflatereseptoren EXPREssion etc. Fordelen med fremgangsmåten er analysen av en celle eller et sted av interesse i en aterosklerotisk lesjon. Men det er ikke mulig for ytterligere å vurdere celler slik som in vitro-studier.
Den ex vivo-modell impliserer et bredt spekter av mulige metoder for å måle og analysere resultatene. Sanntids PCR kan utføres etter RNA isolering, og cDNA-syntese for å undersøke genekspresjon nivå som vist ved Niessner et al. 14.. Immunhistokjemi er et etablert verktøy for å evaluere protein nivå for å bevise protein uttrykk og mobil opprinnelse inne aterosklerotiske lesjoner. Western blot kan bli brukt til å analysere signalveier. I tillegg er celleisolasjon ved nedbryting i en enzym-løsning åpner muligheten for å utføre strømningscytometri-analyse for å analysere for eksempel celletype, cellulære subtyper og grad av aktivering. Videre, etter celleisolasjonspectratyping representerer en god metode for å analysere T celle reseptor variabilitet. Dessuten, etter fordøyelsen magnetisk celleisolasjon er en bevist høy kvalitet metode for celle separasjon av spesifikke cellulære subtyper for ytterligere in vitro-studier eller microarray analyse. Endelig, kan supernatants samles for protein måling av ELISA. I konklusjonen, er det ex vivo modellen et verdifullt verktøy for å undersøke de nøyaktige endringer i den inflammatoriske miljøet i menneskelige aterosklerotiske lesjoner.
Den ex vivo-modellen er basert på endarterektomi prøver. Ved hjelp av aterosklerotisk plakk oppnådd fra forskjellige individer, kan føre til en større grad av differensialcellesammensetning og dermed høyere variasjon i nivåene av gener / proteiner av interesse. Således er det viktig å bruke lipid rik eller kompliserte plaque prøver i stedet for fibrosclerotic lesjoner 10, fordi den inflammatoriske respons er merkbart lavere fibrosclerotic lesions. Derfor er det av stor interesse å evaluere plakk-morfologi før analysere resultatene av plaque-kultur-eksperimenter.
I tillegg omfatter hver prøve sample forskjellige stadier av den aterosklerotiske lesjon utvikling / progresjon, fra den første endotelial dysfunksjon og lipidakkumulering trinn, mot fettstoffer striper og utvikling av en nekrotisk kjernen til ødelagte plaques. Derfor, for å minimalisere heterogenitet av plakk vev, er det nødvendig å skjære de kanter, som generelt representerer tidlige trinn av aterogenese.
Det kan ikke utelukkes at skjære induserer vev skade svar. Men våre plaque vevskultur eksperimenter viste sammenlign genekspresjon nivåer av de dyrkede plaque vev til ikke-dyrkede plakk vev. Dermed understreker dette at dagens metode er et godt verktøy for å undersøke den inflammatoriske miljøet i aterosklerotiske lesjoner.
Kulturen iplakkstykker er begrenset til en tidsperiode på opp til en dag. Hvis plaque vev dyrket mer enn en dag, variasjonen av resultatene øker dramatisk. I tillegg, etter 3 dager plakk sammensetning og morfologi kollapser.
Det er begrensninger som må holdes i bakhodet når du søker denne modellen. Den ex vivo-modellen er en god metode for å studere den inflammatoriske miljøet i aterosklerotiske lesjoner. Likevel er hovedkomponenter mangler i denne sammenheng. Ingen hemodynamiske funksjoner er aktuelle og systemiske påvirkninger er helt mangler. I tillegg, med denne metoden er det bare mulig å undersøke kortvarige endringer, men mangler en sikt-analyse på grunn av sammenbruddet av plakk-morfologi.
I konklusjonen, presenterer vi her en metode som vil være nyttig for forskere som er interessert i etterforskningen av eventuelle nye molekyler på menneskelig aterosklerotisk lesjon betennelse. Den ex vivo plakk culture modellen gjør lider av forskjeller mellom murine og menneskets immunsystem, men det gir oss muligheten til å analysere cellulære samspillet i sammenheng med aterosklerotiske lesjoner og representerer en ny mulighet til å undersøke lokale angrepne inflammatoriske kaskader og trasé. Den ex vivo plakk kultur metoden beskrevet her er enkel å bruke og er reproduserbar og kan bidra til å identifisere og validere nye sykdomsmekanismer og terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Nadine Wambsganss for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Foundation (DFG) ER 682/2-1 og et forskningsstipend fra den tyske Society of Cardiology til C. Erbel samt et forskningsstipend fra German Academic Tjenesten Heidelberg til L. Zhao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Gibco | 21875-091 | |
| FCS | Gibco | 10270-106 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P-4458 | |
| 15 ml Tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Culture dish (60 mm) | Orange Scientific | 5550200 | |
| LPS | Sigma | L4516 | |
| Cell culture plates 48-well | Greiner | 677102 | |
| Scalpel - single use | Feather | FEA200130011 | |
| TissueLyser | Precellys 24 Dual | Cat. No. EQ03119.200.RD010.0 | |
| RNeasy (Mini) Kit | Qiagen | Cat. No. 74104 | |
| Boehringer cDNA kit | Roche Diagnostics | Cat. No. 11483188001 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific |
References
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Hansson, G. K., Libby, P. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1262-1275 (2000).
- Erbel, C., et al. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability. Basic Res Cardiol. 106, 125-134 (2011).
- Erbel, C., et al. Functional profile of activated dendritic cells in unstable atherosclerotic plaque. Basic Res Cardiol. 102, 123-132 (2007).
- Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease. Curr Opin Lipidol. 21, 434-440 (2010).
- Tran, D. Q., Ramsey, H., Shevach, E. M. Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype. Blood. 110, 2983-2990 (2007).
- Raes, G., et al. Arginase-1 and Ym1 are markers for murine, but not human, alternatively activated myeloid cells. J Immunol. 174, 6561-6562 (2005).
- Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
- Stary, H. C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 1177-1178 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Suganuma, T., Workman, J. L. MAP kinases and histone modification. J Mol Cell Biol. 4, 348-350 (2012).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473, 317-325 (2011).
- Niessner, A., et al. Synergistic proinflammatory effects of the antiviral cytokine interferon-alpha and Toll-like receptor 4 ligands in the atherosclerotic plaque. Circulation. 116, 2043-2052 (2007).
- Monaco, C., et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5634-5639 (2004).
