Synthesis, Cellular Levering og Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lorenzo Albertazzi¹, Barbara Storti², Marco Brondi², Sebastian Sulis Sato², Gian Michele Ratto³, Giovanni Signore⁴, Fabio Beltram²

¹Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, ²NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, ³NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, ⁴IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

Fluorescens sensorer er stærke værktøjer i life science. Her beskriver vi en metode til at syntetisere og anvende dendrimer-baserede fluorescerende sensorer til at måle pH i levende celler og in vivo. Dendritiske stillads forbedrer egenskaberne af konjugerede fluorescerende farvestoffer, der fører til forbedrede sensing egenskaber.

Abstract

Udviklingen af ​​fluorescerende indikatorer repræsenterede en revolution for biovidenskab. Genetisk kodede og syntetiske fluorophores med sensing evner tillod visualisering af biologisk relevante arter med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Syntetiske farvestoffer er af særlig interesse på grund af deres høje justerbarhed og den brede vifte af målbare analytter. Men disse molekyler lider flere begrænsninger relateret til lille molekyle adfærd (dårlig opløselighed, vanskeligheder med målretning, ofte ingen ratiometrisk billeddannelse tilladt). I dette arbejde har vi indføre udvikling af dendrimer-baserede sensorer og præsentere en procedure for pH-måling in vitro, i levende celler og in vivo. Vi vælger dendrimers som ideel platform for vores sensorer for deres mange ønskelige egenskaber (monodispersity, justerbare egenskaber, multivalens), der gjorde dem til et udbredt stillads flere biomedicinsk udstyr. Bøjningen af ​​fluorescerende pHindikatorer til dendrimer skafottet førte til en styrkelse af deres sensing forestillinger. Især dendrimerer udviser reduceret celle lækage, forbedret intracellulær målretning og tillade ratiometrisk målinger. Disse nye sensorer blev anvendt med succes til at måle pH i levende HeLa-celler og in vivo i muse-hjerne.

Introduction

Brugen af ​​fluorescerende molekyler til at mærke specifikke biologisk relevante molekyler har fuldstændig ændret den måde, vi studerer biologiske systemer. Widefield og konfokal mikroskopi tilladt for en real-time høj opløsning visualisering af biologiske processer, og i dag er blandt de mest populære teknikker til at studere biologiske begivenheder in vitro, i celler og in vivo. ^1. En relevant forbedring var repræsenteret ved udviklingen af fluorescens indikatorer , dvs farvestoffer, hvis fluorescens er afhængig af koncentrationen af en specifik molekylær enhed. pH-og calcium indikatorer især haft en dramatisk indvirkning på studiet af cellens fysiologi grund af den enorme betydning af H ⁺ og Ca ^{2 +-ioner} i biologi. ^2,3

Men de fleste af de sensing farvestoffer tilstedeværende række iboende begrænsninger relateret til deres lille molekyle adfærd såsom: i) vanskeligheder subcellulære targeting ii) dårlig opløselighed i vand og dermed dårlig biokompatibilitet. og iii) celle lækage og dermed mangel på lang time-lapse imaging evne ^4. Desuden signal af mange sonder kan ikke korrigeres for afhængigheden af farvestofkoncentrationen (non- ratiometrisk billeddannelse), og derfor en absolut måling i celler eller in vivo er ikke mulig.

Vi har for nylig beskrevet en enkel og effektiv metode til at overvinde disse begrænsninger, er baseret på konjugation af sensing farvestoffer på en dendrimer stillads. ⁵ Dendrimers er monodisperse hyperforgrenede polymerer med meget tiltalende egenskaber til biologiske anvendelser. ^6. Især flere dendritiske arkitekturer er blevet udviklet og anvendt for ^stof-7 og gen levering. ^8. Først for ganske nylig flere grupper begyndte at udforske potentialet i disse molekyler som stillads for følere. ^9,10,11

Vi har tidligerebeskrevet en let syntesevej mod funktionalisering af forskellige polyamidoamin (PAMAM) stilladser baseret på NHS-aktiverede estere. ¹² Konjugater kan opnås i et enkelt trin ved hjælp af dialyse som kun oprensning. Interessant denne fremgangsmåde let kan anvendes til en række af dendritiske eller polymere stillads. ^13,14

For at opnå ratiometrisk billeddannelse dendrimerer var dobbelt-mærket med to sæt af farvestoffer: i) en pH-indikator (dvs. fluorescein) og ii) en pH-uafhængig fluorescerende del (dvs. rhodamin). Dette tillod os at udføre nøjagtige pH billeddannelse som forholdet mellem fluorescein og rhodamin er kun afhængig af pH og ikke mere på koncentrationen af ​​sonden. En anden interessant tilgang til dette spørgsmål er repræsenteret ved brug af livstids-baserede prober. ¹⁵ Som levetid ikke afhænger probekoncentration disse målinger behøver ikke en ratiometriske korrektion. Men lifEtime målinger kræver en mere kompliceret instrumental opsætning og deres tidsmæssige opløsning er sub-optimale til hurtige fysiologiske processer, hvilket begrænser deres potentielle anvendelsesmuligheder.

For at udføre intracellulær billeddannelse, skal leveres over plasmamembranen i cytosolen sonden. Da dendrimerer ikke membran permeable på grund af deres størrelse og hydrofilicitet, kan intracellulær levering opnås ved elektroporation. Ved hjælp af denne teknik, er meget udbredt i biologi til transfektion kan mærkede makromolekyler effektivt afgives til celler til at udføre høj billedkvalitet. Desuden med elektroporation af komplikationer relateret til dendrimer endocytose kan undgås som makromolekyler leveres direkte til cytoplasmaet. Interessant efter elektroporation forskellige dendrimerer viser distinkte lokaliseringer inde i cellerne, selv i mangel af en specifik sekvens målretning. ⁵ Denne passive målretning, kun på grund af de fysisk-kemiske egenskaber af dendrimeren, kan udnyttes til at opnå organel-specifik pH-billeddannelse.

Ratiometrisk billeddannelse kan udføres ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Fluorescein og rhodamin, konjugeres kovalent til dendritiske stilladset blev separat afbildet og pixel-for-pixel-forhold kort blev oprettet. Adskillige procedurer til kontrol af intracellulær pH ​​i levende celler ved hjælp af ionophorer blev rapporteret. Ionoforer er små hydrofobe molekyler stand til at transportere ioner over plasmamembranen, ionoforer for H ^+-ion, såsom nigericin, er tilgængelige og kan anvendes til at kalibrere dendrimer-baserede sensorer ¹⁶ Disse målinger viste en lineær respons til pH på samme måde, hvad overholdes. in vitro. På grundlag af kalibreringen intracellulære pH kan måles nøjagtigt. Disse målinger viste, at dendrimer-baserede sensor kan være et værdifuldt redskab i studiet H ⁺ homeostAsis i levende celler og patologiske processer, der involverer pH-regulering funktionsfejl.

Vi har for nylig påvist, at dendrimer-baserede pH-sensorer kan også anvendes in vivo, der udfører pH billeddannelse i hjernen på bedøvede mus. ^17. På grund af det komplekse miljø af levende væv en høj kvalitet i vivo sensing er teknisk udfordrende. Her viser vi en detaljeret beskrivelse af den eksperimentelle procedure for in vivo pH billeddannelse med vægt af de afgørende spørgsmål, der skal behandles for at udføre en nøjagtig pH-billeddannelse i hjernen. To-foton mikroskopi har været ansat i to hovedårsager: i) anvendelse af infrarødt lys tillader at afhjælpe manglen på vævspenetration standard konfokal mikroskopi, ii) den brede to-foton absorption af fluorescein og rhodamin tillade deres samtidige excitation undgå komplikationer relateret til anvendelsen af ​​to bølgelængder til excitation. pH målinger i musehjerne blevsucces gennemført, sensorer let reagere på hypoxi fremkalde ændring af pH i hjernen ekstracellulære rum. Disse målinger viser, at dendrimer-baserede indikatorer, med held kan anvendes til at fremhæve fysiologisk og patologisk ændring af pH i vivo i en dyremodel.

Protocol

1.. Syntese af sensorerne

1. I det følgende afsnit giver vi en procedure for konjugation af pH-indikatorer til PAMAM dendrimerer. Den samme protokol kan anvendes med minimal modifikation til alternative amin-bærende dendrimerer. ^5,17,13,14 Kommercielt tilgængelige dendrimers og farvestoffer kan anvendes uden yderligere oprensninger.
2. Dendrimeren opløses i vandfrit DMSO (50 uM slutkoncentration). Forbered 10 mM stamopløsninger af fluorescein-NHS og tetramethyl-rhodamin-NHS (TMR) i vandfrit DMSO.
3. Tilføj til dendrimeren opløsning den ønskede mængde af fluorescein og TMR. Det molære forhold i blandingen vil afspejle mængden af ​​farvestoffer indlæst på dendrimeren. Typisk 1 ml G4 PAMAM dendrimer opløsning i et mikrocentrifugerør omsættes med 8 ækv (40 ul) af fluorescein og 8 eq (40 ul) af TMR. Opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer.
4. Fortynd 1:10 med demineraliseret vand og indlæse reaktionenblandingen i en dialysepose (MWCO = 10 kDa). Dialyseres i 24 timer mod deioniseret vand erstatter ofte vand i reservoiret.
5. Opløsningen overføres til et hætteglas og frysetørres i 24 timer. En lilla pulver skal opnås. Vægt det opnåede faste stof og opløse den i milliQ vand ved en slutkoncentration på 10 uM. Afmål opløsningen og opbevares ved -20 ° C.

2. In Vitro pH-målinger

1. Til in vitro kalibrering forberede en løsning 500 nM af dendrimer i PBS (2 mM phosphat) i en kvarts kuvette. Det anbefales at anvende en meget fortyndet PBS-buffer (2 mM) for at undgå pludselige ændringer i pH-værdi under titrering.
2. Mål emissionsspektret af fluorescein (exc 488 nm) og TMR (exc 550 nm) og optimere de optiske indstillinger fluorimeteret at opnå et godt signal-støj-forholdet.
3. Udfør en pH-titrering ved tilsætning af små mængder af NaOH 0,1 N og HCI 0,1 N. Efter hver tilsætning ryste kuvettentil blanding, vent 1 min for ækvilibrering og måle pH-værdien ved hjælp af et pH-mikroelektrode. Emission spektre af fluorescein og TMR skal registreres for hvert trin uden nogen ændring i de optiske indstillinger.
4. Plot fluorescensintensitet vs pH til titreringen. Den rhodamine signalet skal være upåvirket af pH (<10%). Fluorescein signalet skal være en S-formet kurve, og bør være udstyret med en single-bindende model med pK = 6,4.

3. Celledyrkning og Elektroporation

1. Dyrk HeLa-celler i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin (Invitrogen). Hold cellekultur ved 37 ° C i en befugtet 5% _{CO2-atmosfære.}
2. For dendrimer elektroporation, når cellerne er sammenflydende, fjern mediet og vaske cellerne ved hjælp DPBS (Dulbeccos phosphatbufferet saltvand). Fjern DPBS og tilføj trypsin-EDTA. Neutraliseres Trypsynde ved at tilsætte medium indeholdende serum, men ikke antibiotika. Centrifuger ved 900-1.200 rpm i 2 minutter ved stuetemperatur. Fjern mediet og skyl træpiller vha. DPBS.
3. Tæl cellerne og tage 4 * 10 ⁶ celler. Centrifuger ved 1,200-1,500 rpm i 2 minutter ved stuetemperatur.
4. Resuspender cellepelleten i 200 pi mikroperforering puffer (leveret af mikroperforatoren fabrikant) og overføre cellerne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
5. Tilføj dendrimer vandig opløsning i resuspenderede celler. Mængden af ​​dendrimer kræves per prøve er afhængig af PAMAM type (typisk 250 nM for kationiske og 2 uM neutrale dendrimerer).
6. Tilføj elektroporation buffer (leveres af mikroperforator producenten) i en mikroperforeringsanordning rør. Pipette cellerne og dendrimers blandinger med elektroporation spidsen af ​​100 ul volumen-størrelse. Sæt mikroperforator pipetten ind i pipetten station. Indstil puls betingelse for mikroporering: pulsspænding = 1.005 V, puls width = 35 msek, puls nummer = 2.
7. Efter pulsen overføre cellerne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres cellerne i 5 minutter ved 1200 rpm for at fjerne overskuddet af dendrimer i mediet. Plade 10 pi elektroporerede celler på 35 mm glasbund retter (WillCo-fad GWSt-3522) med frisk medium w / o antibiotika.

4.. pH Sensing i Living HeLa-celler

1. Billede celler med et konfokalt mikroskop 12 timer efter elektroporering.
2. Standard filter sæt til fluorescein og rhodamin kan bruges. Hvis afstemmelige filtre er tilgængelige sæt en grøn kanal 500-550 nm og en rød kanal fra 580 nm til 650 nm. Excitation ved 488 nm er optimal for fluorescein mens rhodamin kunne afbildes enten med 543nm eller 561 laser linje.
3. Fokus på prøven og justere lasere magt og detektorer får at maksimere signal-til-støj-forhold. Hvis elektroporation var vellykkede celler bør være lyst fluorescerende i begge kanaler. Denlokalisering afhænger af størrelsen og ladningen af ​​dendrimeren anvendes. Ofte nogle lysosomale lokalisering (små perinukleær blærer) er til stede på grund af endocytose eller opdeling. Hvis lysosomale lokalisering er fremherskende, dvs det meste af fluorescens er lokaliseret inde i vesikler og der observeres dårlig signal i cytosolen, betyder toksicitet og måling skal kasseres. Anskaf sekventielt de to kanaler, hvis det er nødvendigt at erhverve flere billeder, og gennemsnittet af billeder for at forbedre billedkvaliteten.
4. Til kalibrering klemme celle pH ved anvendelse af buffere med ionoforer ved forskellige pH og erhverve mindst 20 celler pr pH som beskrevet ovenfor. For en detaljeret beskrivelse af proceduren og sammensætningen af bufferne henvises til Bizzarri og kolleger. ^16. Vi foreslår at måle mindst 5 point fra pH = 5,5 til pH = 7,5. pH under 6 er giftige for celler, men tolereret for kort tid, anbefaler vi at erhverve billederne så hurtigt som muligt. Hvis cellerdemonstrere tegn på apoptose, kasseres cellerne og genstart.
5. Brug ImageJ eller tilsvarende software til dataanalyse. Importer billeder af den røde og grønne kanal, trække baggrunden og skabe en pixel for pixel forholdet billeddannelse med værktøjet "Image regnemaskine".
6. Tegn en region af interesse (ROI) har valgt den ønskede celle og måle intracellulære grøn-til-rød-forholdet. Analysere alle de billeder, der er erhvervet, og derefter plotte forholdet versus pH. I intervallet 5,5-7,5 tendensen bør være lineær. Den lineære fit af de punkter, der er opnået vil give kalibreringskurven, der skal bruges til at konvertere fra grøn til rød i forhold til pH.
7. Som yderligere kontrol erhverve flere ubehandlede celler (ingen ionophorer) og forsøge at beregne pH med den opnåede kalibreringskurven. Bør indhentes En værdi mellem 7,2 og 7,4.

5.. In Vivo Prøveforberedelse

1. Eksperimenter blev udført på C57BU6J (hanner og hunner) mellem postnatal day 28 og 70 år. Bedøves musen med en intraperitoneal injektion af urethan (dvs. ethylcarbamat) (20% w / v i fysiologisk saltvand, 20 mg / kg urethan). Dyrene blev aflivet efter forsøget med en overdosis af urethan efterfulgt af en intrakardial injektion af samme bedøvelsesmiddel.
2. Udfør en intramuskulær injektion af dexamethason natriumphosphat (2 mg / kg legemsvægt) for at reducere den korticale stress-respons og cerebralt ødem under operationen.
3. Barbere dyrets hoved og anvende 2,5% lidocain gel til hovedbunden.
4. Brug saks til at klippe hudlap dækker kraniet begge halvkugler
5. Vask udsatte knogle med saltvand og fjern forsigtigt periost med pincet. Det vil give et bedre grundlag for lim og dental cement til at overholde med.
6. Påfør en custom-made stål hoved post med en central billedbehandling kammer og lim det med cyanoacrylat i et plan omtrent parallelt med kraniet over den kortikale region interest og ordne det på plads med hvid dental cement (Paladur).
7. Fastgør hovedet af musen for at udføre en kraniotomi på 2-3 mm i diameter boret over regionen af ​​interesse.
8. Forsøge at minimere opvarmning af cortex under kirurgi, dural tårer eller blødning.
9. Hold cortex superfusioneret med sterilt ACSF (126 mM NaCI, 3 mM KCI, 1,2 mM KH _{2PO 4} 1,3 mM _MgSO4, 26 mM _NaHCO3, 2,4 mM _CaCl2, 15 mM glucose, 1,2 mM HEPES i destilleret _H2O , pH = 7,4).

6.. pH billeddannelse i musehjerne

1. Under eksperimentet støtte dyr åndedræt give O _2-beriget luft. Oxygen er beriget med op til 80%. O ₂ partialtrykket og flow ofte justeres for at opnå en ordentlig respiration støtte. Holde kropstemperaturen konstant på 37 ° C med en feedback kontrolleret varmetæppe.
2. Fastgør dyret gennem stål indlæg under målet om en to-foton imaging setup.
3. For at injicere sensoren i hjernebarken indlæse en glaspipette indeholdende en AgCl elektrode (spids diameter 4 mm) med dendrimeren opløsning (1 uM). Elektroden vil gøre det muligt at optage ekstracellulære feltpotentialer.
4. Med en mikroinjektion setup indsætte pipetten i cortex ved ca 150 um dybde. Indsprøjtes i 1-2 minutter ved et tryk på 0,5 psi.
5. Optimer den optiske setup for billeddannelse. Laser magt bør justeres for at minimere fotoblegning og solskader. Typisk laser magt ansat er omkring 20 mW og PMT gevinst blev holdt konstant på 667 V, da de tidligere kalibreringer viste, at denne spænding giver den bedste S / N-forholdet.
6. Til billeddannelse ophidse sensoren ved 820 nm og opdage samtidigt fluorescein og rhodaminfluorescens gennem standard FITC og TRITC filtre.
7. For tiden løst målinger erhverve tidsforskydningen serie på 2 Hz.
8. For korrektion baggrund erhverve en mørk ramme med laser lukkeren lukket for at måle den gennemsnitlige termiske støj, der opstår i PMT'er og soklen sædvanligvis tilføjet af elektronikken.
9. Til dataanalyse følge samme fremgangsmåde som rapporteret i afsnit 4.

Representative Results

Figur 1 viser en skematisk repræsentation af konjugation af sensing farvestoffer til forskellige dendritiske stillads. Kan opnås de resulterende indikatorer i en let syntetisk skridt fra kommercielt tilgængelige produkter. Amin-bærende dendrimerer omsættes med NHS-aktiverede farvestoffer i DMSO og oprenset ved dialyse. Denne generelle procedure er allerede med held blevet anvendt til mærkning af flere dendrimerer: i) PAMAM dendrimer generation 2, 4 og 6, ¹² pegylerede PAMAM dendrimerer ¹⁷ og PEG-dendritiske hybrider ^18. Som særskilte dendrimerer viser forskellige interaktioner med celler og væv (lokalisering, toksicitet, permeabilitet, diffusion) valg af den dendritiske struktur er stærkt knyttet til det ønskede program, og med den model af interesse.

Sensorerne omfatter to sæt fluorescerende farvestoffer: i) pH-indikatorer og ii) pH-ufølsom grupper fungerer som interne referencer. Althdybdegående en lang række forskellige indikatorer og referencer er til rådighed, de bedste resultater er opnået med fluorescein og tetramethylrhodamin. Forholdet mellem de to farvestoffer kan indstilles blot ved hjælp af forskellige molære ækvivalenter i reaktionen. Figur 2 viser en typisk in vitro-titrering af en pH-sensor. Fluorescein og rhodamin kan separat ophidset ved 488 nm og 550 nm, henholdsvis, så minimum cross-talk mellem de to kanaler. Som det tydeligt ses, fluorescein (figur 2A) viser en pH-afhængig adfærd, mens rhodamin (figur 2A) signal ikke ændres væsentligt i det fysiologiske pH-område. Derfor er forholdet mellem disse to signaler ikke afhænge af koncentrationen sensor, men kun på pH. Denne koncentration uafhængighed vil være af stor betydning for de biologiske målinger som intracellulær probekoncentration ikke kan kontrolleres.

For levende celler målinger intracellulær levering af de dendritiske sensorer opnås via elektroporation. Denne teknik er almindeligt anvendt i biologi til DNA-transfektion og kan anvendes med minimale variationer producenten protokol. Gennem elektroporation kan makromolekylerne leveres direkte til cytoplasmaet, idet enhver komplikation relateret til vesikulær system endocytose. 3a viser konfokale billeder af HeLa-celler elektroporeret med dendrimer sensorer. Et kraftigt signal i både fluorescein (grøn, til venstre) og rhodamin (rød, midten). De to signaler perfekt colocalize viser integriteten af ​​sensoren struktur. En ratiometrisk kort rekonstrueres ved at dividere de to billeder pixel-for-pixel og repræsenteret med en pseudo-skala (figur 3a, højre). pH-fastspænding med ionoforer blev udført med henblik på at kalibrere sensoren reaktion inde i cellerne. Kalibrering med ionophorer er en veletableret protokol, Several protokoller er blevet udførligt beskrevet og kan anvendes uden ændringer. ¹⁹ Indikatorer let reagere på pH med en ændring af den grønne-til-rød-forholdet som vist i figur 3b. Dette tillod os at opnå en kalibreringskurve (figur 3c) til nøjagtige pH-målinger. Den lineære trend i kalibreringen viser sensorens evne til at reagere på pH uden forstyrrelse fra det cellulære miljø. Kalibreringskurven er blevet anvendt til at bestemme pH-værdien af ​​levende HeLa-celler til at være 7,4 og 4,8 for cytoplasmaet og lysosomer, hhv. Disse resultater er i god overensstemmelse med litteraturen.

Endelig viste vi, hvordan dendrimer-baserede sensorer kan anvendes til in vivo billeddannelse. Dendrimers kan injiceres nemt gennem vævet med en procedure meget lig de udbredte calcium indikatorer. ^20. gang i vævet, indikatorerne diffunderer ekstremt langsomt, allowing langsigtet billeddannelse før fuldstændig væv dræning. Typiske resultater er vist i figur 4. Fluorescein (grøn) og rhodamin (rød) signaler samtidigt har været opnået med 820 nm excitation og forholdet kort blev bygget på en pixel-for-pixel basis, svarende til levende celler målinger. Især indikatorerne lokaliseres i det ekstracellulære rum, ikke-fluorescerende områder i billedet, identificerer cellelegemer eller små blodkar. For at kontrollere sensor reaktion på pH, vi foreslog brugen af ​​hyperkapni. Faktisk er kuldioxid kendt for at ændre ligevægten af karbonatholdige buffere i blod og væv, hvilket resulterer i en forsuring af vævene. ^21. Som vist i figur 4b, inhalation af 30% CO ₂ er nok til at fremkalde en kraftig reaktion af sensor, der er helt reversible ved re-ventilation med musen. Disse resultater viser potentialet i dendrimer-baserede sensorer til at fremhæve fysiologiske og pathological ændringer i pH i levende celler og in vivo.

Figur 1. Syntese af dendrimer-baserede sensorer Skematisk repræsentation af dendrimer-baserede pH-sensor. Den samme fremgangsmåde kan anvendes til stort set enhver amin-bærende dendrimer (venstre). Produktet blev opnået gennem en enkelt konjugationsreaktion efterfulgt af dialyse. Klik her for at se større figur .

Fig. 2. In vitro pH titrering af en dendrimer-baserede sensor. a) reaktion af pH-indikator fluorescein og b) iINDRE henvisning, rhodamin, ikke viser nogen ændring i forhold til fysiologisk pH.

Figur 3. Repræsentative resultater af pH-billeddannelse i levende HeLa-celler. a) Konfokal billeddannelse af fluorescein kanal (venstre), rhodamine kanal (i midten) og pH ratiometriske kort (højre). b) pH-kalibrering med ionoforer. c) repræsentative ratiometriske kort celler fastspændt ved forskellige pH. . Gengivet fra Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer Based Fluorescent Indikatorer:.. In vitro og in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figur 4.. pH billeddannelse ihjerne bedøvede mus. a) grøn og rød kanal (samtidig spændt på 820 nm), og pH-ratiometrisk kort. b) typiske reaktion af sensoren til hyperkapni (30% CO _2). Tilpasset fra:. Gengivet fra Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer Based Fluorescent Indikatorer:.. In vitro og in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Klik her for at se større figur .

Discussion

De kritiske skridt for en vellykket pH billeddannelse med dendrimer-baserede sensorer er: i) udvælgelsen af den korrekte dendritiske stillads, og antallet af indikatorer, konjugeret til det og ii) optimering af sensor levering protokol i celler eller in vivo.

Den syntetiske fremgangsmåde er forholdsvis let og kan anvendes til næsten alle amin-bærende hyperbranched polymer. Sensorerne kan fås fra kommercielt tilgængelige dendrimers og NHS-aktiverede farvestoffer i et enkelt trin. Vi mener, at denne modulære og enkel procedure vil være til gavn for den videre anvendelse af sådanne sensorer for en række biologiske spørgsmål. Oprensning kan opnås effektivt ved dialyse for at fjerne ukonjugeret farvestoffer. Udvælgelsen af ​​den dendritiske stilladset er afgørende og afhænger af den specifikke ønskede anvendelse. Forskellige dendrimerer har vist sig at have særlige lokaliseringer i celler på grund af specifikke interaktioner med subcellular strukturer. Neutrale dendrimerer (for eksempel acetyleret PAMAM G4) ikke viser nogen interaktion i celler og vise en diffus lokalisering. Således repræsenterer de et godt valg for en hel-cell imaging. Tværtimod positivt ladede dendrimerer af forskellige generationer (fra G2 til G6) display elektrostatiske interaktioner med negativt ladede biomolekyler (dvs. RNA) resulterer i specifik cellulær lokalisering. Kationiske dendrimerer er derfor ideel til organel-specifik billeddannelse.

Valget af sensing farvestoffer er kritisk. Adskillige pH indikatorer og pH-ufølsom farvestoffer med forskellig farve emission og H ⁺ affinitet (pK) er tilgængelige. Vi forsøgte mange forskellige farvestof kombinationer og de bedste resultater blev opnået med fluorescein og tetramethylrhodamin. Dette par giver et godt respons på pH-værdi i det fysiologiske område (pK = 6,4), og er kompatibelt med almindeligt anvendte mikroskopi filtrer opsætninger. For forskellige krav, såsom målings i forskellige pH-område, kan der kræves en vis optimering. Især ikke alle indikatorerne bevarer deres egenskaber (lysstyrke, PK) på dendrimer konjugation ⁵ Denne adfærd afhænger både af farvestof og dendrimer strukturer. Men vi var i stand til at rapportere flere indikatorer, hvor fotofysiske egenskaber af indikatorerne er ikke væsentligt påvirket. ^17. Hvis dette er tilfældet, foreslår vi at konjugere farvestoffer via en linker for at minimere dendrimer-farvning interaktioner. Adskillige reaktive farvestoffer er kommercielt tilgængelige med alkyl afstandsstykker ²² eller i alternative PEG indeksobligationer kan anvendes. Også antallet af indikatorer og forholdet indikatorerne-til-henvisning farvestoffer på stilladset er vigtig. Den ideelle forhold afhænger af den spektrale følsomhed af mikroskopi setup anvendes, og hvilke biologiske materiale af interesse ^5,17. Selv om nogle fejlfinding kan være nødvendig, vil meget let og hurtigt syntesemetode i høj grad lette processen. Endeliggraden af funktionalisering af dendrimeren, dvs procentdelen af endegrupper af dendrimeren, som er konjugeret til farvestoffer, kan påvirke resultaterne af de indikatorer. For at undgå enhver opløselighed problem foreslår vi funktionalisere omkring 10% -20% af dendrimer endegrupper. I tilfælde af pegylerede dendrimerer Men på grund af PEG bidrag til opløselighed, kan en komplet funktionalisering opnås. Dette kan også begrænse uønskede tilstedeværelse af FRET og andre quenching fænomener blandt de konjugerede farvestoffer.

Dendrimers ikke celle-permeabel, men intracellulær levering kan opnås ved elektroporation. Vi ansat DNA-transfektion producent protokol for cellelinie af interesse uden yderligere ændringer. En afgørende parameter er koncentrationen af ​​dendrimeren i elektroporation buffer, navnlig i tilfælde af indikatorer med svag lysstyrke eller dendrimerer at ved høje koncentrationer kan være toksisk for celler. Lav koncentrations af dendrimer vil resultere i dårlig signal inde i cellerne, mens høje koncentrationer vil forårsage toksicitet og fremkalde celledød. Den ideelle koncentration afhænger af dendrimer / indikator for parret såvel som på den billeddannende opsætning til rådighed, og muligvis nogle optimering. Hvis en elektroporator er ikke tilgængelig i laboratoriet, kunne mikroinjektion udgøre et gyldigt alternativ. Men dette er en enkelt celle teknik og vil gøre erhvervelsen af ​​et betydeligt antal filmede celler mere omstændelig.

Den sensorer imaging procedure er meget fleksibelt og kan nemt tilpasses til flere mikroskopi opsætninger. Vi har tidligere rapporteret anvendelsen af sensorer i et konfokalt system afstemmelige acusto-optiske filtre ^5,17, men standard FITC / TRITC filter sæt kan også anvendes. Når optimal intracellulære koncentration er opnået, pH billeddannelse er ligetil. Vi foreslår at optimere laser intensitet, pinhole og detektorer vinde over et stort udvalg af sensor intracellulærkoncentrationer før du kører pH-kalibrering med ionoforer. Hvis den samme mikroskopi setup anvendes under de samme betingelser kalibreringen kunne bruges til alle forsøg. Her foreslår vi ratiometrisk billeddannelse for at undgå sensor koncentration afhængighed og artefakter. En anden interessant metode til at opnå dette er repræsenteret ved livstids-baserede prober så elegant viste ved Vinogradov og kolleger ¹⁵ og begge muligheder display fordele og ulemper. Lifetime målinger ikke kræver nogen korrektion, som de er intrinsisk koncentrations-uafhængig og kalibrering er ofte lettere og mere stabilt. Desuden er en enkelt farve, der bruges undgå de komplikationer og den mulige aberration induceret af grøn-til-rød ratiometrisk billeddannelse. Men kun få effektive levetid sonder er tilgængelige, mens en bred vifte af intensitet-baserede prober er kommercielt tilgængelige. Det udstyr, der kræves for ratiometrisk billeddannelse er enklere og mere sandsynligt findes i såtandard mikroskopi facilitet. Desuden levetid målinger er naturnødvendigt er langsom og kan ikke anvendes til at følge hurtige biologiske processer. Derfor er valget mellem disse to teknikker afhænger i høj grad af den instrumentering til rådighed, og på den specifikke biologiske proces af interesse.

Selv begrebsmæssigt lignende, in vivo billeddannelse er mere udfordrende end i cellekultur. Signal-støj-forhold er reduceret ved at sprede og interaktionerne med de væv, kan påvirke reaktionen af ​​sensoren. Desuden diffusion gennem vævet og således lækage af indikatoren fra området af interesse udgør et yderligere problem ikke er til stede intracellulære målinger i kultur. Af disse grunde er valget af indikatoren er afgørende. Mens for intracellulære målinger fleste af de dendrimererne virker fortrinligt (G4 G4-Ac G6, PAMAM-PEG-hybrider), til in vivo sensing anbefaler vi brug af pegylerede dendrimerer. ^17. Indeed denne arkitektur er særlig effektiv til dette formål af flere grunde: i) PEG øge størrelsen dendrimerens og reducerer dets siver fra vævet, ii) PEG linker minimerer quenching som følge af dye-farvestof og Dye-dendrimer interaktioner og iii) PEG afskærmer farvestofferne fra vævet undgå tab af funktion ofte observeres efter væv injektion af sensorer. Kvaliteten af ​​pH sensing stærkt afhængig af en vellykket injektion af en tilstrækkelig mængde af dendrimer i vævet. Når dette er opnået imagografiproceduren og dataanalysen svarer til, hvad der blev allerede rapporteret til cellekultur. Dette er en klar demonstration af sensor effektivitet in vivo og kan bruges som en intern kontrol af indikatoren aktivitet før hver måling.

Vi mener, at disse resultater sammen med de detaljerede procedurer rapporteret i dette arbejde vil tillade anvendelsen af ​​dendrimer-baserede sensorer til at fremhæve fysiological og patologiske ændringer i pH i levende celler og in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PAMAM G4	Sigma-Aldrich	412449
Carboxyfluorescein NHS ester	Life technologies	C-1311
TMR NHS ester	Life technologies	C-1171
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dyalsis bags	Spectrum Labs	132117
WillCo Dishes	WillCo Wells	GWSt-3512
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500