Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Sintesi, Consegna Cellulare e Published: September 10, 2013 doi: 10.3791/50545
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 4, 2
1Institute for Complex Molecular Systems & Laboratory of Macromolecular and Organic Chemistry, Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 2NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR & IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation, 3NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR, 4IIT@NEST, Center for Nanotechnology Innovation

Summary

I sensori di fluorescenza sono strumenti potenti nella scienza della vita. Qui si descrive un metodo per sintetizzare ed utilizzare sensori fluorescenti basato dendrimero-per misurare il pH nelle cellule viventi e in vivo. L'impalcatura dendritiche esalta le proprietà dei coloranti fluorescenti coniugati che conducono al miglioramento delle caratteristiche di rilevamento.

Abstract

Lo sviluppo di indicatori fluorescenti ha rappresentato una rivoluzione per le scienze della vita. Geneticamente codificato e fluorofori sintetici con capacità di rilevamento ha permesso la visualizzazione di specie biologicamente rilevanti con alta risoluzione spaziale e temporale. Coloranti sintetici sono di particolare interesse grazie alla loro elevata sintonizzabilità e la vasta gamma di analiti misurabili. Tuttavia, queste molecole soffrono di alcune limitazioni legate alla piccola comportamento della molecola (scarsa solubilità, difficoltà di targeting, spesso senza immagini ratiometric consentito). In questo lavoro si introduce lo sviluppo di sensori basati dendrimero e presentiamo una procedura per la misurazione del pH in vitro, in cellule viventi e in vivo. Abbiamo scelto dendrimeri come piattaforma ideale per i nostri sensori per le loro numerose proprietà desiderabili (monodispersity, proprietà sintonizzabili, multivalenza) che li un'impalcatura ampiamente utilizzato per diversi dispositivi biomedici fatte. La coniugazione di pH fluorescenteIndicatori al patibolo dendrimer portato ad un miglioramento delle loro prestazioni di rilevamento. In particolare dendrimeri mostre ridotto la perdita delle cellule, migliore il targeting intracellulare e permettere misurazioni raziometriche. Questi nuovi sensori sono stati impiegati con successo per misurare il pH nel vivere cellule HeLa e in vivo nel cervello di topo.

Introduction

L'utilizzo di molecole fluorescenti per etichettare specifiche molecole biologicamente rilevanti ha completamente cambiato il nostro modo di studiare sistemi biologici. Widefield e microscopia confocale consentito in tempo reale ad alta risoluzione visualizzazione dei processi biologici e oggi sono tra le tecniche più popolari per studiare eventi biologici in vitro, in cellule e in vivo. 1 un miglioramento rilevante era rappresentata dallo sviluppo di indicatori di fluorescenza , cioè coloranti cui fluorescenza dipende dalla concentrazione di una entità molecolare specifico. pH e calcio indicatori, in particolare, hanno avuto un impatto drammatico sullo studio della fisiologia cellulare a causa della enorme rilevanza di 2 + ioni in biologia H + e Ca. 2,3

Tuttavia, la maggior parte dei coloranti sensibili presenti diversi limiti intrinseci legati alla loro piccola molecola comportamento quali: i) difficoltà targeti subcellulareng; ii) scarsa solubilità in acqua e conseguente scarsa biocompatibilità;. e iii) perdite cellulare e quindi la mancanza di capacità time-lapse imaging lungo 4 Inoltre, il segnale di molte sonde può non essere corretta per la dipendenza dalla concentrazione di colorante (non- l'imaging raziometrico) e quindi, una misura assoluta in cellule o in vivo non è possibile.

Recentemente abbiamo descritto un metodo semplice ed efficace per superare queste limitazioni, basato sulla coniugazione di coloranti sensibili alla pressione su un ponteggio dendrimero. 5 dendrimeri sono polimeri hyperbranched monodisperse con proprietà molto interessanti per applicazioni biologiche. 6 In particolare diverse architetture dendritiche sono stati sviluppati e utilizzati per la droga 7 e la consegna del gene. 8 Solo molto recentemente alcuni gruppi hanno cominciato a esplorare le potenzialità di queste molecole come impalcatura per i dispositivi di rilevamento. 9,10,11

Abbiamo precedentementedescritto una via sintetica semplice verso la funzionalizzazione di diversa polyamidoamine (PAMAM) scaffold a base di esteri NHS-attivati. Coniugati 12 possono essere ottenuti in un unico passaggio mediante dialisi come soltanto la purificazione. È interessante notare che questo approccio può essere facilmente applicata ad una varietà di scaffold dendritiche o polimerici. 13,14

Per raggiungere dendrimeri di imaging raziometrici erano doppio marcato con due serie di coloranti: i) un indicatore di pH (cioè fluoresceina) e ii) una porzione fluorescente pH-indipendente (cioè rodamina). Questo ha permesso di effettuare l'imaging pH accurate come rapporto tra fluoresceina e rodamina dipende solo dal pH e non più sulla concentrazione della sonda. Un altro approccio interessante per questo problema è rappresentata dall'utilizzo di sonde a vita basata. 15 Come la vita non dipende concentrazione sonda queste misurazioni non necessitano di correzione raziometrico. Tuttavia, LIFmisure Etime richiedono una più complessa configurazione strumentale e la loro risoluzione temporale è sub-ottimale per i processi fisiologici veloci, limitando così le loro potenziali applicazioni.

Al fine di effettuare l'imaging intracellulare, la sonda deve essere consegnato attraverso la membrana plasmatica nel citosol. Poiché i dendrimeri non vengono membrana permeabile causa delle loro dimensioni e idrofilia, consegna intracellulare potrebbe avvenire tramite elettroporazione. Mediante questa tecnica, ampiamente utilizzata in biologia per la trasfezione, macromolecole etichettati possono essere efficacemente consegnati in cellule effettuare immagini di alta qualità. Inoltre, con elettroporazione le complicazioni legate al dendrimero endocitosi possono essere evitate le macromolecole sono direttamente consegnati al citoplasma. È interessante notare che dopo l'elettroporazione diversi dendrimeri mostra localizzazioni distinte all'interno delle cellule anche in assenza di qualsiasi sequenza di targeting specifico. 5 Questo passivoe rivolti, solo a causa delle proprietà fisico-chimiche del dendrimero, può essere sfruttata per realizzare specifici organello pH imaging.

Immagini Raziometrico può essere effettuata utilizzando la microscopia confocale. Fluoresceina e rodamina, covalentemente coniugato con l'impalcatura dendritica, sono stati ripresi separatamente e un pixel per pixel rapporto mappa è stata creata. Sono stati segnalati diversi procedure di controllo di pH intracellulare in cellule viventi mediante ionofori. Ionofori sono piccole molecole idrofobiche in grado di trasportare ioni attraverso la membrana plasmatica; Ionofori per ione H +, come nigericin, sono disponibili e possono essere usati per calibrare sensori basati dendrimero-16 Queste misurazioni hanno rivelato una risposta lineare a pH analogamente a quanto osservato. in vitro. Sulla base del pH intracellulare calibrazione potrebbe essere misurata con precisione. Queste misure hanno dimostrato che il sensore basato dendrimer, può essere uno strumento prezioso per lo studio H + homeostAsis nelle cellule viventi e dei processi patologici che coinvolgono pH regolazione malfunzionamenti.

Abbiamo recentemente dimostrato che i sensori di pH basato dendrimero possono essere applicate anche in vivo, eseguendo l'imaging pH nel cervello di topi anestetizzati. 17 causa dell'ambiente complesso di tessuti viventi una qualità elevata rilevamento vivo è tecnicamente difficile. Qui vi mostriamo una descrizione dettagliata della procedura sperimentale in vivo pH di imaging con enfasi delle questioni cruciali da affrontare per eseguire un accurato immagini pH nel cervello. Microscopia a due fotoni è stato impiegato per due motivi principali: i) l'uso di luce infrarossa permette di superare la mancanza di penetrazione nei tessuti della microscopia confocale norma; ii) l'ampio assorbimento a due fotoni di fluoresceina e rodamina consentire la loro eccitazione simultanea evitando l' complicanze legate all'uso di due lunghezze d'onda di eccitazione. misure di pH nel cervello di topo sono statieffettuate con successo; sensori prontamente rispondono all'ipossia provocare cambiamenti di pH nello spazio extracellulare cervello. Queste misurazioni mostrano che gli indicatori basato dendrimero possono essere usati con successo per evidenziare cambiamenti fisiologici e patologici del pH in vivo in un modello animale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sintesi dei sensori

  1. Nella sezione seguente forniamo una procedura per la coniugazione di indicatori di pH a dendrimeri PAMAM. Lo stesso protocollo può essere applicato con modifiche minime al dendrimeri ammina-cuscinetto alternativi. 5,17,13,14 dendrimeri e coloranti disponibili in commercio possono essere utilizzati senza ulteriori purificazioni.
  2. Sciogliere il dendrimer in DMSO anidro (concentrazione finale di 50 micron). Preparare soluzioni 10mM stock di fluoresceina NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) in DMSO anidro.
  3. Aggiungere alla soluzione dendrimero la quantità desiderata di fluoresceina e TMR. Il rapporto molare nella miscela rifletterà la quantità di coloranti caricati sul dendrimero. Tipicamente 1 ml di soluzione G4 dendrimero PAMAM in una provetta viene fatto reagire con 8 eq (40 microlitri) di fluoresceina e 8 eq (40 microlitri) di TMR. Agitare la soluzione a temperatura ambiente per 12 ore.
  4. Diluire 1:10 con acqua deionizzata e caricare la reazionemiscela in un sacchetto di dialisi (MWCO = 10 kDa). Dializzare per 24 ore contro acqua deionizzata sostituire frequentemente l'acqua nel serbatoio.
  5. Trasferire la soluzione in un flaconcino e congelare asciugare per 24 ore. Una polvere viola deve essere ottenuta. Peso del solido ottenuto e sciogliere in acqua milliQ ad una concentrazione finale di 10 mM. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C.

2. In vitro Misurazioni del pH

  1. Per in vitro calibrazione preparare una soluzione di 500nm dendrimero in PBS (phosphate 2 mM) in una cuvetta di quarzo. Si raccomanda l'uso di un tampone PBS molto diluite (2 mM) per evitare brusche variazioni di pH durante la titolazione.
  2. Misurare gli spettri di emissione di fluoresceina (exc 488 nm) e TMR (exc 550 nm) e ottimizzare le impostazioni ottiche del fluorimetro per ottenere un buon rapporto segnale-rumore.
  3. Eseguire una titolazione pH con l'aggiunta di piccoli volumi di NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N. Dopo ogni aggiunta agitare la provettaper la miscelazione, attendere 1 min per equilibrazione e misurare il pH mediante un pH microelettrodo. Spettri di emissione della fluoresceina e TMR deve essere registrato per ogni passo senza alcun cambiamento nelle impostazioni ottiche.
  4. Tracciare l'intensità di fluorescenza vs pH per la titolazione. Il segnale rhodamine dovrebbe essere influenzata dal pH (<10%). Il segnale fluoresceina dovrebbe essere una curva sigmoidale e dovrebbe essere dotata di un modello single-vincolante con pK = 6.4.

3. Cella cultura e elettroporazione

  1. Coltivare cellule HeLa in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (Invitrogen). Mantenere coltura cellulare a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 nell'atmosfera.
  2. Per dendrimer elettroporazione, quando le cellule sono confluenti, rimuovere il supporto e lavare le cellule con DPBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Rimuovere il DPBS e aggiungere tripsina-EDTA. Neutralizzare Il Tryppeccato con l'aggiunta di siero mezzo contenente ma non antibiotici. Centrifugare a 900-1.200 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente. Togliere la carta e sciacquare il pellet con DPBS.
  3. Contare le celle e prendere 4 * 10 6 cellule. Centrifugare a 1.200-1.500 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente.
  4. Risospendere il pellet di cellule in 200 ml di tampone microporation (fornito dal costruttore microporator) e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml.
  5. Aggiungere la soluzione acquosa dendrimero in cellule risospese. La quantità di dendrimero necessaria per campione dipende dal tipo PAMAM (tipicamente 250 nM per cationico e 2 mM per dendrimeri neutri).
  6. Aggiungere tampone elettroporazione (fornito dal costruttore microporator) in un tubo microporation. Pipettare le cellule ei dendrimeri miscele con elettroporazione punta di 100 volumi di dimensioni microlitri. Inserire la pipetta microporator nella stazione pipetta. Impostare la condizione impulsi per microporation: tensione ad impulsi = 1.005 V; impulso wid° = 35 msec, il numero di impulsi = 2.
  7. Dopo che le cellule di trasferimento dell'impulso a 1,5 ml provetta e centrifugare le cellule per 5 min a 1200 rpm per rimuovere l'eccesso di dendrimero nel mezzo. Tavola 10 ml di cellule elettroporate da 35 mm piatti con fondo di vetro (WillCo-dish GWSt-3522), con terreno fresco w / o antibiotici.

4. pH Sensing in cellule viventi HeLa

  1. Celle di immagine con un microscopio confocale a 12 ore dopo l'elettroporazione.
  2. Set di filtri standard per fluoresceina e rodamina può essere utilizzato. Se i filtri sintonizzabili sono disponibili set di un canale verde 500-550 nm e un canale rosso da 580 nm a 650 nm. Eccitazione a 488 nm è ottimale per la fluoresceina, mentre rodamina potrebbe essere ripreso sia con il 543nm o la linea laser 561.
  3. Fuoco il preparato e regolare la potenza laser e rivelatori guadagno per massimizzare il rapporto segnale-rumore. Se l'elettroporazione era cellule successo dovrebbero essere fluorescente brillantemente in entrambi i canali. Illocalizzazione dipende dalla dimensione e carica del dendrimero utilizzato. Spesso alcuni localizzazione lisosomiale (piccole vescicole perinucleari) è presente a causa di endocitosi o compartimentazione. Se la localizzazione lisosomiale è predominante, cioè la maggior parte della fluorescenza è localizzato all'interno di vescicole e segnale debole si osserva nel citosol, ciò significa la tossicità e la misurazione devono essere eliminati. Acquisire sequenzialmente i due canali, se necessario acquisire diverse immagini e media immagini per migliorare la qualità dell'immagine.
  4. Per morsetto calibrazione pH cellulare utilizzando tamponi con ionofori a diversi pH e acquisire almeno 20 cellule per pH come descritto sopra. Per una descrizione dettagliata della procedura e la composizione dei buffer consultare Bizzarri e colleghi. 16 Si consiglia di misurare almeno 5 punti dal pH = 5,5 a pH = 7.5. pH inferiore a 6 sono tossici per le cellule ma tollerata per un breve lasso di tempo, si consiglia di acquisire le immagini più velocemente possibile. Se le celluledimostrare segni di apoptosi, eliminare le cellule e riavviare.
  5. Utilizzare ImageJ o software analoghi per l'analisi dei dati. Importare le immagini del canale verde e rosso, sottrarre sfondo e creare un rapporto pixel per pixel delle immagini con lo strumento "Calcolatore di immagine".
  6. Prelievo di una regione di interesse (ROI) selezionando la cella desiderata e misurare il rapporto intracellulare verde a rosso. Analizzare tutte le immagini acquisite e quindi tracciare il rapporto rispetto al pH. Nell'intervallo tra 5.5 e 7.5 la tendenza dovrebbe essere lineare. L'adattamento lineare dei punti ottenuti darà la curva di calibrazione che verrà utilizzato per convertire rapporto verde a rosso a pH.
  7. Come ulteriore controllo acquisire diverse cellule non trattate (senza Ionofori) e provare a calcolare il pH con la curva di calibrazione ottenuta. Un valore compreso tra 7.2 e 7.4 deve essere ottenuta.

5. In Vivo Preparazione del campione

  1. Gli esperimenti sono stati eseguiti su C57BL/6J (maschi e femmine) tra postnatale day 28 e 70. Anestetizzato il mouse con un'iniezione intraperitoneale di uretano (cioè etil carbammato) (20% w / v in soluzione salina fisiologica, 20 mg / Kg uretano). Gli animali sono stati sacrificati dopo esperimento con una overdose di uretano seguita da una iniezione intracardiaca della stessa anestetico.
  2. Eseguire una iniezione intramuscolare di desametasone fosfato di sodio (2 mg / kg peso corporeo) per ridurre la risposta allo stress corticale e edema cerebrale durante l'intervento chirurgico.
  3. Radersi la testa dell'animale e applicare 2,5% gel lidocaina al cuoio capelluto.
  4. Usare le forbici per tagliare il lembo di pelle che ricopre il cranio di entrambi gli emisferi
  5. Lavare l'osso esposto con soluzione salina e rimuovere delicatamente il periostio con pinze. Ciò fornirà una base migliore per colla e cemento dentale ad aderire con.
  6. Applicare un acciaio palo di testa su misura con una camera di imaging centrale e incollare con cianoacrilato in un piano approssimativamente parallelo con il cranio sulla regione corticale di interest e fissarlo in posizione con cemento dentale bianco (Paladur).
  7. Fissare la testa del mouse per eseguire una craniotomia di 2-3 mm di diametro forato sopra la regione di interesse.
  8. Cercare di minimizzare il riscaldamento della corteccia durante l'intervento chirurgico, lacerazioni durali, o sanguinamento.
  9. Mantenere la corteccia superfuse con ACSF sterile (126 mM NaCl, KCl 3 mM, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1.3 MgSO mm 4, 26 NaHCO mm 3, 2.4 mM CaCl 2, glucosio 15 mM, 1,2 mM HEPES in H 2 O distillata , pH = 7,4).

6. pH imaging cervello di topo

  1. Durante l'animale la respirazione aiuti esperimento fornendo O aria 2 arricchita. L'ossigeno è arricchito fino al 80%. O 2 pressione e flusso parziale è spesso regolati per ottenere un aiuto alla respirazione corretta. Mantenere costante la temperatura corporea a 37 ° C con una valutazione riscaldamento centralizzato coperta.
  2. Fissare l'animale attraverso il palo di acciaio sotto l'obiettivo di una due-fotoinstallazione n imaging.
  3. Per iniettare il sensore nella corteccia cerebrale caricare una pipetta di vetro contenente un elettrodo AgCl (diametro consigliato 4 mm) con la soluzione dendrimero (1 mM). L'elettrodo permetterà di registrare potenziali di campo extracellulari.
  4. Con una configurazione microiniezione inserire la pipetta nella corteccia a circa 150 micron di profondità. Iniettare per 1-2 min ad una pressione di 0,5 psi.
  5. Ottimizzare la configurazione ottica per l'imaging. Potenza del laser deve essere regolato per minimizzare photobleaching e fotodanneggiamento. Tipicamente potenza del laser impiegato è di circa 20 mW e guadagno PMT è stata mantenuta costante a 667 V in quanto le calibrazioni precedenti hanno dimostrato che questa tensione dà il miglior rapporto S / N.
  6. Per l'imaging eccitare il sensore a 820 nm e rilevare simultaneamente fluoresceina e rodamina fluorescenza attraverso filtri FITC e TRITC standard.
  7. Per il tempo le misure risolte acquisiscono serie lasso di tempo a 2 Hz.
  8. Per la correzione del fondo acquisire cornice scura con il laser otturatore chiuso per misurare il rumore termico medio risultante nei PMT e il piedistallo solitamente aggiunti dall'elettronica.
  9. Per l'analisi dei dati seguire la stessa procedura riportata nella sezione 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica della coniugazione di rilevamento coloranti differenti scaffold dendritiche. Gli indicatori risultanti possono essere ottenuti in un solo passo sintetica facile da prodotti commercialmente disponibili. Dendrimeri ammina cuscinetti vengono fatti reagire con coloranti NHS attivati ​​in DMSO e purificati mediante dialisi. Tale procedura generale è già stato utilizzato con successo per l'etichettatura di alcuni dendrimeri: i) generazione PAMAM dendrimer 2, 4 e 6, 12 pegilato dendrimeri PAMAM 17 e ibridi PEG-dendritiche 18. Come dendrimeri distinti mostrano differenti interazioni con cellule e tessuti (localizzazione, tossicità, permeabilità, diffusione) la selezione della struttura dendritica è fortemente correlato all'applicazione desiderata e al modello di interesse.

I sensori comprendono due serie di coloranti fluorescenti: i) indicatori di pH e ii) le frazioni pH-sensibile che agiscono come riferimenti interni. ALTHough una grande varietà di indicatori e riferimenti sono disponibili, i migliori risultati sono stati ottenuti con fluoresceina e tetramethylrhodamine. Il rapporto tra i due coloranti possono essere sintonizzati semplicemente utilizzando diversi equivalenti molari nella reazione. Figura 2 mostra un tipico titolazione in vitro di un sensore di pH. Fluoresceina e rodamina possono essere eccitati separatamente a 488 nm e 550 nm, rispettivamente, permettendo minima diafonia tra i due canali. Come si può chiaramente vedere, fluoresceina (Figura 2A) mostra un comportamento pH-dipendente mentre il segnale rodamina (Figura 2A) non cambia significativamente nell'intervallo pH fisiologico. Pertanto, il rapporto di questi due segnali non dipende dalla concentrazione sensore ma solo su pH. Questa indipendenza concentrazione sarà di grande importanza per le misurazioni biologiche come concentrazione intracellulare sonda non può essere controllato.

Per le misure di cellule vive l'intrconsegna acellulare dei sensori dendritiche è ottenuta tramite elettroporazione. Questa tecnica è ampiamente usato in biologia per la trasfezione del DNA e può essere applicato con minime variazioni sul protocollo produttore. Attraverso elettroporazione, le macromolecole possono essere consegnati direttamente al citoplasma, evitando qualsiasi complicazione correlata al sistema vescicolare di endocitosi. Figura 3a mostra immagini confocali di cellule HeLa elettroporate con i sensori dendrimero. È osservato un forte segnale sia fluoresceina (verde, sinistra) e rodamina (rosso, al centro). I due segnali perfettamente colocalize dimostrare l'integrità della struttura del sensore. Una mappa raziometrico viene ricostruita dividendo le due immagini pixel per pixel e rappresentato con una scala pseudocolore (figura 3a, destra). è stata eseguita-pH serraggio con ionofori, per calibrare la risposta del sensore all'interno delle cellule. Calibrazione con ionofori è un ben noto protocollo, Seveprotocolli ral sono stati ampiamente descritti e possono essere usati senza modifiche. 19 indicatori prontamente rispondere agli pH con un cambiamento del rapporto di verde a rosso come mostrato in Figura 3b. Questo ci ha permesso di ottenere una curva di calibrazione (Figura 3c) per misure di pH accurate. L'andamento lineare nella calibrazione dimostra la capacità del sensore di rispondere a pH senza perturbazione dall'ambiente cellulare. La curva di calibrazione è stata utilizzata per determinare il valore pH di vivere cellule HeLa essere 7.4 e 4.8 per citoplasma e lisosomi, rispettivamente. Questi risultati sono in buon accordo con la letteratura.

Infine, abbiamo mostrato come sensori basati dendrimer-possono essere impiegati per l'imaging in vivo. Dendrimeri possono essere iniettati facilmente attraverso il tessuto con una procedura molto simile agli indicatori calcio ampiamente utilizzati. 20 Una volta nel tessuto, gli indicatori diffondono molto lentamente, allowing di imaging a lungo termine prima che il drenaggio dei tessuti completo. I risultati tipici sono mostrati in Figura 4. Fluoresceina (verde) e rodamina (rosso) i segnali sono stati contemporaneamente ottenuti con 820 nm di eccitazione e il rapporto di mappa è stata costruita su una base di pixel-by-pixel, simile a vivere cellule misure. In particolare, gli indicatori localizzano nello spazio extracellulare; le zone non fluorescenti nell'immagine identificano corpi cellulari o piccoli vasi sanguigni. Al fine di verificare la risposta del sensore di pH, abbiamo proposto l'uso di ipercapnia. Infatti, l'anidride carbonica è conosciuto per alterare gli equilibri dei buffer carbonato nel sangue e nei tessuti, con conseguente acidificazione dei tessuti. 21 come mostrato in Figura 4b, l'inalazione del 30% CO 2 è sufficiente per indurre una forte risposta del sensore che è completamente reversibile al momento della ripresa ventilazione del mouse. Questi risultati dimostrano il potenziale di sensori basati dendrimero-per evidenziare fisiologica e pacambiamenti thological di pH nelle cellule viventi e in vivo.

Figura 1
Figura 1. Sintesi di sensori basati dendrimero-rappresentazione schematica del sensore pH basato dendrimero. La stessa procedura può essere applicata a quasi tutti dendrimero ammina-cuscinetto (sinistra). Prodotto è stato ottenuto attraverso una singola reazione di coniugazione seguita da dialisi. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. In vitro pH titolazione per un sensore basato dendrimero. a) Reazione dell'indicatore fluoresceina pH e b) l'iriferimento nterno, rodamina, mostrando alcuna variazione nel range di pH fisiologico.

Figura 3
Figura 3. Risultati rappresentativi dell'imaging pH nel vivere cellule HeLa. a) l'imaging confocale canale fluoresceina (a sinistra), il canale rodamina (al centro) e il pH mappa raziometrica (a destra). b) calibrazione pH con ionofori. c) rappresentative mappe raziometriche di cellule serrati a diversi pH. . Tratto da Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimero-Based fluorescenti Indicatori:.. In vitro e in applicazioni Vivo PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450

Figura 4
Figura 4. pH di imaging nellacervello del topo anestetizzato. a) canale verde e rosso (contemporaneamente eccitato a 820 nm) e pH raziometrica mappa. b) risposta tipica del sensore all'ipercapnia (30% CO 2). Adattato da:. Tratto da Albertazzi L, Brondi M, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimero-Based fluorescenti Indicatori:.. In vitro e in applicazioni Vivo PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Clicca qui per ingrandire la figura .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le fasi critiche per l'imaging pH con sensori basati dendrimero-sono: i) la selezione del ponteggio dendritica corretta e il numero di indicatori coniugati ad esso e ii) l'ottimizzazione di protocollo di recapito sensore in cellule o in vivo.

La procedura di sintesi è abbastanza semplice e può essere applicato praticamente ad ogni polimero hyperbranched ammina-cuscinetto. I sensori possono essere ottenuti da dendrimeri disponibili in commercio e coloranti NHS-attivati ​​in un unico passaggio. Crediamo che questa procedura modulare e lineare sarà vantaggioso per l'ulteriore applicazione di tali sensori per una varietà di questioni biologiche. La purificazione può essere efficacemente effettuata con la dialisi per rimuovere i coloranti non coniugati. La selezione del ponteggio dendritica è cruciale e dipende dalla specifica applicazione desiderata. Diversi dendrimeri hanno dimostrato di avere localizzazioni particolari all'interno delle cellule a causa di specifiche interazioni con sstrutture ubcellular. Dendrimeri neutri (per esempio acetilato PAMAM G4) non mostrano alcuna interazione all'interno delle cellule e mostrano una localizzazione diffusa. Così essi rappresentano una buona scelta per una rappresentazione cellula intera. Al contrario carica positiva dendrimeri di diverse generazioni (da G2 a G6) interazioni elettrostatiche visualizzazione con carica negativa biomolecole (cioè RNA) con conseguente localizzazione cellulare specifico. Dendrimeri cationici sono quindi ideale per l'imaging specifico organello.

La scelta dei coloranti di rilevamento è critica. Diversi indicatori di pH e coloranti pH-sensibile con emissione di colore diverso e H + affinità (PK) sono disponibili. Abbiamo provato molte combinazioni differenti tinture ed i migliori risultati sono stati ottenuti con fluoresceina e tetrametilrodamina. Questa coppia fornire una buona risposta al pH nel range fisiologico (pK = 6.4) ed è compatibile con i filtri comunemente usati configurazioni microscopia. Per esigenze diverse, come misuras in diversi range di pH, qualche ottimizzazione possono essere richiesti. In particolare, non tutti gli indicatori mantengono le loro proprietà (luminosità, PK) su dendrimer coniugazione 5 Questo comportamento dipende sia tintura e strutture dendrimer,. Tuttavia, siamo stati in grado di riferire alcuni indicatori in cui le proprietà fotofisiche degli indicatori non sono significativamente influenzati. 17 In questo caso si consiglia coniugare i coloranti attraverso un linker per minimizzare le interazioni dendrimero-dye. Diversi coloranti reattivi sono disponibili in commercio con distanziali alchil 22 o in titoli indicizzati PEG alternative possono essere utilizzati. Anche il numero di indicatori e il rapporto indicatori di riferimento coloranti sul patibolo è importante. Il rapporto ideale dipende dalla sensibilità spettrale del setup microscopia utilizzato e il campione biologico di interesse 5,17. Anche se alcuni di risoluzione dei problemi può essere necessario, la procedura di sintesi molto facile e veloce agevolerà notevolmente il processo. Infineil grado di funzionalizzazione del dendrimero, ossia la percentuale di gruppi terminali del dendrimero coniugate ai coloranti, potrebbe influenzare le prestazioni degli indicatori. Per evitare qualsiasi problema di solubilità suggeriamo funzionalizzazione circa il 10% -20% dei terminali dendrimer. Nel caso di dendrimeri pegilati Tuttavia, a causa PEG contributo alla solubilità, una funzionalizzazione completo può essere raggiunto. Questo può anche limitare la presenza indesiderata di FRET e altri fenomeni di quenching tra i coloranti coniugati.

Dendrimeri non sono cellula-permeabile, ma consegna intracellulare possono essere raggiunti tramite elettroporazione. Abbiamo impiegato protocollo produttore DNA-trasfezione per la linea cellulare di interesse senza ulteriori modifiche. Un parametro importante è la concentrazione del dendrimero nel buffer elettroporazione, in particolare nel caso di indicatori con luminosità o dendrimeri che ad alte concentrazioni poteva essere tossico per le cellule poveri. Low concentrations di dendrimer si tradurrà in segnale debole all'interno delle cellule, mentre alte concentrazioni provocano tossicità e indurre la morte cellulare. La concentrazione ideale dipende dalla coppia dendrimero / indicatore nonché sulla configurazione di imaging libero e può essere necessario qualche ottimizzazione. Se un elettroporatore non è disponibile in laboratorio, microiniezione potrebbe rappresentare una valida alternativa. Tuttavia, questa è una tecnica a cella singola e renderà l'acquisizione di un numero significativo di cellule impressionate più laborioso.

La procedura di sensori di immagini è molto flessibile e può essere facilmente adattato a diverse configurazioni di microscopia. Abbiamo precedentemente riportato l'uso dei sensori in un sistema confocale con filtri acusto-ottica accordabili 5,17 ma set di filtri standard di FITC / TRITC può anche essere usato. Una volta ottenuta la concentrazione intracellulare ottimale, l'imaging pH è semplice. Si consiglia di ottimizzare intensità del laser, pinhole e rilevatori di guadagnare su una vasta gamma di sensori intracellulariLe concentrazioni prima di eseguire la calibrazione del pH con ionofori. Se viene utilizzata la stessa configurazione microscopia alle stesse condizioni della calibrazione può essere utilizzato per tutti gli esperimenti. Qui ci proponiamo di imaging raziometrica per evitare sensore di concentrazione di dipendenza e artefatti. Un altro metodo interessante per raggiungere questo obiettivo è rappresentato da sonde a vita basata, come elegantemente presentate da Vinogradov e collaboratori 15 e sia vantaggi opzioni di visualizzazione e svantaggi. Misure di vita media non richiedono alcuna correzione come sono procedure indipendente dalla concentrazione e calibrazione intrinseca sono spesso più facili e più stabile. Inoltre, un singolo colore è usato evitando le complicazioni e la possibile aberrazione indotta dalla rappresentazione raziometrica verde a rosso. Tuttavia solo pochi sonde a vita efficaci sono disponibili, mentre una vasta gamma di sonde a base di intensità, sono commercialmente accessibili. L'attrezzatura necessaria per l'imaging raziometrico è più semplice e più probabile disponibile comeimpianto di microscopia tandard. Misure di vita media Inoltre sono intrinsecamente lenta e non possono essere applicati a seguire processi biologici veloci. Pertanto la scelta tra queste due tecniche dipende fortemente dalla strumentazione disponibile e sul processo biologico specifico di interesse.

Anche se concettualmente simili, imaging in vivo è più impegnativa rispetto alla coltura cellulare. Rapporto segnale-rumore è diminuito di scattering e le interazioni con i tessuti può influenzare la risposta del sensore. Inoltre, la diffusione attraverso il tessuto e quindi perdite dell'indicatore della regione di interesse rappresentano un problema aggiuntivo non presente per le misurazioni intracellulari in coltura. Per queste ragioni, la scelta dell'indicatore è cruciale. Mentre per le misurazioni intracellulari maggior parte dei dendrimeri funzionano ottimamente (G4, G4-Ac, G6, ibridi PAMAM-PEG), per il rilevamento in vivo si consiglia l'uso di dendrimeri peghilati. Ind 17eed questa architettura è particolarmente efficace a questo scopo per diverse ragioni: i) il PEG Aumentare la dimensione del dendrimer e riduce la sua fuoriuscita dal tessuto, ii) il linker PEG minimizza la tempra risultante dalla dye-dye e colorante dendrimer interazioni e iii) il PEG protegge i coloranti dal tessuto evitando la perdita della funzione spesso osservato dopo l'iniezione tessuto di sensori. La qualità del rilevamento del pH dipende fortemente dalla iniezione di successo di una quantità sufficiente di dendrimero nel tessuto. Quando questo avviene la procedura di imaging e l'analisi dei dati sono simili a quanto già riportato per la coltura cellulare. Questa è una chiara dimostrazione dell'efficacia sensore in vivo e può essere utilizzato come controllo interno dell'attività indicatore prima di una misurazione.

Riteniamo che tali risultati e le procedure dettagliate riportate in questo lavoro consentiranno l'applicazione di sensori basati dendrimer-per evidenziare educazione fisicacambiamenti iological e patologici di pH nelle cellule viventi e in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Default: Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Utili discussioni con Isja de Feijter e Matt Baker sono riconosciuti con gratitudine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAMAM G4 Sigma-Aldrich 412449
Carboxyfluorescein NHS ester Life technologies C-1311
TMR NHS ester Life technologies C-1171
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dyalsis bags Spectrum Labs 132117
WillCo Dishes WillCo Wells GWSt-3512
Urethane Sigma-Aldrich U2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  2. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  3. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
  4. Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
  5. Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
  6. Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
  7. Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
  8. Caminade, A. -M., Turrin, C. -O., Majoral, J. -P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
  9. Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
  10. Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
  11. Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
  12. Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
  13. Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
  14. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
  15. Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
  16. Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
  17. Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
  18. Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
  19. Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  20. Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
  21. Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
  22. Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).

Tags

Chimica tecniche investigative Chimica e dei Materiali (Generale) dendrimer fluorescenza sensori pH consegna confocale
Sintesi, Consegna Cellulare e<em&gt; In vivo</em&gt; Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi,… More

Albertazzi, L., Storti, B., Brondi, M., Sulis Sato, S., Michele Ratto, G., Signore, G., Beltram, F. Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors. J. Vis. Exp. (79), e50545, doi:10.3791/50545 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter