Summary
capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L'échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées.
Abstract
Le développement d'indicateurs fluorescents représenté une révolution pour les sciences de la vie. Codées génétiquement et fluorophores synthétiques avec des capacités de détection permis la visualisation d'espèces biologiquement pertinentes avec une résolution spatiale et temporelle. Colorants synthétiques sont particulièrement intéressants grâce à leur grande accordabilité et la vaste gamme d'analytes mesurables. Cependant, ces molécules souffrent de plusieurs limitations liées à petite molécule comportement (faible solubilité, les difficultés de ciblage, souvent sans imagerie quotientométrique autorisé). Dans ce travail, nous introduisons le développement des capteurs à base de dendrimères et de présenter un mode opératoire pour la mesure du pH in vitro, dans des cellules vivantes et in vivo. Nous choisissons dendrimères comme plate-forme idéale pour nos capteurs pour leurs nombreuses propriétés souhaitables (de monodispersité, propriétés accordables, polyvalence) qui en font un échafaudage largement utilisé pour plusieurs dispositifs biomédicaux faites. La conjugaison de pH fluorescentindicateurs à l'échafaud des dendrimères ont conduit à une amélioration de leurs performances de détection. En particulier dendrimères exposition réduite fuite de cellule, un meilleur ciblage intracellulaire et permettre des mesures ratiométriques. Ces nouveaux capteurs ont été utilisés avec succès pour mesurer le pH dans la vie des cellules HeLa et in vivo dans le cerveau de la souris.
Introduction
L'utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd'hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. 1 Une amélioration pertinente a été représentée par l'élaboration d'indicateurs de fluorescence , c'est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentration d'une entité moléculaire spécifique. pH et de calcium indicateurs en particulier ont eu un impact dramatique sur l'étude de la physiologie de la cellule en raison de l'énorme importance de H + et Ca 2 + dans la biologie. 2,3
Cependant, la plupart des colorants de détection présentent plusieurs limites intrinsèques liés à leur petite molécule comportements tels que: i) des difficultés à targeti subcellulaireng, ii) une faible solubilité dans l'eau et par conséquent une mauvaise biocompatibilité,., et iii) des fuites de cellules et donc un manque de capacité à long imagerie time-lapse 4 En outre, le signal de plusieurs sondes ne peut pas être corrigée en fonction de la dépendance de la concentration de colorant (non Imagerie ratiométrique) et, par conséquent, une mesure absolue dans des cellules ou in vivo n'est pas possible.
Nous avons récemment décrit une méthode simple et efficace pour surmonter ces limitations, en fonction de la conjugaison de colorants de détection sur un échafaudage de dendrimère. 5 Les dendrimères sont des polymères hyper-ramifiés monodispersés avec des propriétés très attrayantes pour des applications biologiques. 6 en particulier plusieurs architectures dendritiques ont été mis au point et utilisé pour le médicament 7 et la livraison de gènes. 8 n'est que très récemment plusieurs groupes ont commencé à explorer le potentiel de ces molécules comme échafaudage pour dispositifs de détection. 9,10,11
Nous avons déjàdécrit une voie de synthèse facile vers la fonctionnalisation différente de polyamidoamine (PAMAM) des échafaudages à base d'esters de NHS-activées. conjugués peuvent 12 être obtenus en une seule étape au moyen d'une dialyse en tant que purification. Fait intéressant, cette approche peut facilement être appliquée à une variété d'échafaudages dendritiques ou polymères. 13,14
Pour atteindre les dendrimères d'imagerie ratiométrique étaient doublement marquée avec deux ensembles de colorants: i) un indicateur de pH (par exemple la fluorescéine) et ii) un fragment fluorescent indépendante du pH (par exemple la rhodamine). Cela nous a permis d'effectuer une imagerie précise du pH comme le rapport entre la fluorescéine et la rhodamine est seulement dépendante du pH et de pas plus de la concentration de la sonde. Une autre approche intéressante à ce sujet est représenté par l'utilisation de sondes à base de vie. 15 Comme la durée de vie ne dépend pas de la concentration de la sonde ces mesures n'ont pas besoin d'une correction de quotient. Cependant, lifmesures de etime nécessitent une configuration instrumentale plus complexe et leur résolution temporelle est sous-optimale pour les processus physiologiques rapides, limitant ainsi leurs applications potentielles.
Dans le but d'effectuer une imagerie intracellulaire, la sonde doit être délivré à travers la membrane plasmique dans le cytosol. Comme les dendrimères sont pas perméable en raison de leur taille et leur caractère hydrophile, la délivrance intracellulaire pourrait être réalisé par électroporation. Au moyen de cette technique, largement utilisé en biologie pour la transfection, les macromolécules marquées peuvent être exécutés de manière efficace dans des cellules d'effectuer une imagerie de haute qualité. En outre, l'électroporation avec les complications liées à dendrimère endocytose peuvent être évités en tant que les macromolécules sont directement remis au cytoplasme. Intéressant après électroporation différents dendrimères montre localisations distinctes à l'intérieur des cellules, même en l'absence de toute séquence de ciblage spécifique. 5 Ce passife ciblage, seulement en raison des propriétés physico-chimiques du dendrimère, pourrait être exploitée pour obtenir un pH d'imagerie spécifiques à des organites.
Imagerie ratiométrique peut être effectuée en utilisant la microscopie confocale. La fluorescéine et la rhodamine, conjugué de manière covalente à l'échafaud dendritique, ont été séparément imagées et un rapport carte pixel par pixel a été créé. Plusieurs procédures de contrôle le pH intracellulaire dans les cellules vivantes au moyen d'ionophores ont été signalés. Ionophores sont de petites molécules hydrophobes capables de transporter des ions à travers la membrane plasmique; ionophores pour ion H +, comme nigéricine, sont disponibles et peuvent être utilisés pour étalonner les capteurs à base de dendrimères 16 Ces mesures ont révélé une réponse linéaire de pH similaire à ce qui est observé. in vitro. Sur la base de l'étalonnage du pH intracellulaire peut être mesurée avec précision. Ces mesures ont démontré que le capteur à base de dendrimères peut être un outil précieux dans l'étude H + homeostasis dans les cellules vivantes et les processus pathologiques qui impliquent pH dysfonctionnements de régulation.
Nous avons récemment démontré que les capteurs de pH à base de dendrimères peuvent également être appliqués in vivo, effectuer une imagerie de pH dans le cerveau de souris anesthésiées. 17 En raison de l'environnement complexe des tissus vivants de haute qualité dans la détection in vivo est techniquement difficile. Ici, nous montrons une description détaillée de la procédure expérimentale in vivo pour pH imagerie avec un accent des questions cruciales à traiter pour effectuer une imagerie précise du pH dans le cerveau. Microscopie à deux photons a été utilisé pour deux raisons principales: i) l'utilisation de la lumière infrarouge permet de pallier le manque de pénétration tissulaire de la microscopie confocale norme; ii) la large absorption à deux photons de la fluorescéine et de la rhodamine permettre leur excitation simultanée d'éviter la les complications liées à l'utilisation de deux longueurs d'onde pour l'excitation. des mesures de pH dans le cerveau de la souris étaientmenées à bien; capteurs répondent que difficilement à l'hypoxie induire des changements de pH dans l'espace extracellulaire du cerveau. Ces mesures montrent que les indicateurs à base de dendrimères peuvent être utilisés avec succès pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques de pH in vivo dans un modèle animal.
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Protocol
Une. Synthèse des capteurs
- Dans la section suivante, nous proposons une procédure pour la conjugaison d'indicateurs de pH de dendrimères PAMAM. Le même protocole peut être appliqué avec une modification minimale de substitution amine dendrimères porteurs. 5,17,13,14 dendrimères et les colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés sans autres purifications.
- Dissoudre le dendrimère dans du DMSO anhydre (50 uM de concentration finale). Préparer des solutions de 10 mM d'achat d'actions de la fluorescéine NHS et tétraméthyl-rhodamine-NHS (TMR) dans DMSO anhydre.
- Ajouter à la solution de dendrimère la quantité désirée de la fluorescéine et TMR. Le rapport molaire dans le mélange va tenir compte de la quantité de colorants chargées sur le dendrimère. Typiquement, 1 ml de solution de dendrimère de PAMAM G4 dans un microtube est mis à réagir avec 8 eq (40 ul) de la fluorescéine et 8 eq (40 ul) de la TMR. Agiter la solution à la température ambiante pendant 12 heures.
- Diluer à 1:10 avec de l'eau déminéralisée et charger la réactionmélange dans un sac de dialyse (MWCO = 10 kDa). Dialyser pendant 24 heures contre de l'eau désionisée le remplacement fréquent de l'eau dans le réservoir.
- Transférer la solution dans un flacon et lyophiliser pendant 24 heures. Une poudre pourpre devrait être obtenu. Poids du solide obtenu et dissoudre dans de l'eau milliQ à une concentration finale de 10 uM. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C.
2. Mesures in vitro de pH
- Pour vitro étalonnage en préparer une solution de 500 nM de dendrimère dans du PBS (phosphate 2 mM) dans une cuvette en quartz. L'utilisation d'un tampon PBS très diluée (2 mM) afin d'éviter des changements brusques de pH au cours de la titration est recommandée.
- Mesurer les spectres d'émission de la fluorescéine (exc 488 nm) et TMR (exc 550 nm) et d'optimiser les paramètres optiques du fluorimètre pour obtenir un bon rapport signal-sur-bruit.
- Effectuer un titrage pH en ajoutant de petites quantités de NaOH 0,1 N et HCl 0,1 N. Après chaque ajout secouer la cuvettepour mélanger, attendre 1 min pour atteindre l'équilibre et de mesurer le pH au moyen d'une micro-électrode de pH. Les spectres d'émission de la fluorescéine et TMR doivent être enregistrées pour chaque étape sans aucun changement dans les paramètres optiques.
- Tracer l'intensité de la fluorescence en fonction du pH pour le titrage. Le signal de la rhodamine devrait pas être affecté par le pH (<10%). Le signal de la fluorescéine doit être une courbe sigmoïde et doit être équipé d'un modèle unique de liaison avec pK = 6,4.
3. Culture cellulaire et électroporation
- Cultiver des cellules HeLa dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine (Invitrogen). Maintenir une culture de cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5%.
- Pour dendrimère électroporation, lorsque les cellules sont confluentes, retirez le support et laver les cellules en utilisant DPBS (tampon phosphate salin de Dulbecco). Retirez le DPBS et ajouter la trypsine-EDTA. Neutraliser le tryppécher par addition de milieu contenant du sérum mais pas d'antibiotiques. Centrifuger à 900-1,200 rpm pendant 2 min à température ambiante. Retirez le support et rincer les pastilles en utilisant DPBS.
- Compter les cellules et prendre 4 * 10 6 cellules. Centrifuger à 1.200-1.500 tours par minute pendant 2 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 pi de tampon de microporation (fourni par le fabricant du microporateur) et transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter solution aqueuse dendrimère dans les cellules remises en suspension. La quantité de dendrimère requis par échantillon dépend du type PAMAM (typiquement de 250 nM pour le cationique et 2 uM de dendrimères neutres).
- Ajouter du tampon d'électroporation (fourni par le fabricant de microporateur) dans un tube de microporation. Introduire à la pipette les cellules et les dendrimères mélanges avec la pointe d'électroporation de 100 pi volume de taille. Insérer la pipette d'microporateur dans le poste de pipette. Définir l'état d'impulsion pour microporation: tension d'impulsion = 1,005 V; impulsion wide = 35 ms, le nombre d'impulsions = 2.
- Après que les cellules de transfert de l'impulsion à une 1,5 ml, tube à centrifuger et centrifuger les cellules pendant 5 min à 1200 rpm pour éliminer l'excès de dendrimère dans le milieu. Plaque 10 pi de cellules par électroporation sur des boîtes à fond de verre de 35 mm (WillCo-plat GWSt-3522) avec du milieu frais w / o des antibiotiques.
4. pH de détection dans les cellules vivantes HeLa
- cellules d'image avec un microscope confocal 12 heures après l'électroporation.
- Jeu de filtres standard pour la fluorescéine et la rhodamine peuvent être utilisés. Si des filtres accordables sont disponibles ensemble un canal vert 500-550 nm et un canal rouge de 580 nm à 650 nm. Excitation à 488 nm est optimale pour la fluorescéine pendant rhodamine peut être imagée soit avec le 543nm ou de la ligne de laser 561.
- Focus sur l'échantillon et ajuster les lasers de puissance et détecteurs acquérir pour maximiser le rapport signal-sur-bruit. Si l'électroporation des cellules était de succès devraient être fluorescent brillamment dans les deux canaux. Lalocalisation dépend de la taille et la charge du dendrimère utilisé. Souvent certains localisation lysosomale (petites vésicules périnucléaires) est présent en raison d'endocytose ou cloisonnement. Si la localisation lysosomale est prédominant, c'est à dire la majeure partie de la fluorescence est localisée à l'intérieur des vésicules et un signal faible est observée dans le cytosol, cela indique une toxicité et de mesure doivent être jetés. Acquérir successivement les deux canaux, si nécessaire l'acquisition de plusieurs images et la moyenne des images pour améliorer la qualité de l'image.
- Pour l'étalonnage pince cellule pH en utilisant des tampons avec des ionophores à différents pH et à acquérir au moins 20 cellules par un pH tel que décrit ci-dessus. Pour une description détaillée de la procédure et la composition des tampons s'il vous plaît se référer à Bizzarri et Collègues. 16 Nous proposons de mesurer au moins 5 points de pH = 5,5 à pH = 7,5. pH inférieur à 6 sont toxiques pour les cellules, mais toléré pour peu de temps, nous vous proposons d'acquérir les images aussi vite que possible. Si les cellulesmontrer des signes d'apoptose, jetez les cellules et redémarrer.
- Utilisez ImageJ ou un logiciel analogue pour l'analyse des données. Importez les images de la voie verte et rouge, soustraire fond et créer un pixel par pixel rapport imagerie avec l'outil "Calculateur de l'image".
- Dessiner une région d'intérêt (ROI) en sélectionnant la cellule souhaitée et mesurer le rapport du vert au rouge intracellulaire. Analyser toutes les images acquises puis tracer le ratio par rapport au pH. Dans la gamme de 5,5 à 7,5 la tendance devrait être linéaire. L'ajustement linéaire des points obtenus donnera la courbe d'étalonnage qui sera utilisé pour convertir le rapport du vert au rouge à pH.
- En outre le contrôle acquérir plusieurs cellules non traitées (sans ionophores) et essayer de calculer le pH de la courbe d'étalonnage obtenue. Une valeur comprise entre 7,2 et 7,4 soit obtenu.
5. In Vivo Préparation de l'échantillon
- Les expériences ont été effectuées sur C57BL/6J (mâles et femelles) entre postnatale day 28 et 70. Anesthésiés la souris par une injection intrapéritonéale d'uréthane (c'est-carbamate d'éthyle) (20% p / v dans une solution saline physiologique, 20 mg / kg d'uréthane). Les animaux ont été sacrifiés après essai avec une surdose d'uréthane suivie d'une injection intracardiaque de la même anesthésique.
- Effectuer une injection intramusculaire de phosphate sodique de dexaméthasone (2 mg / kg de poids corporel) pour réduire la réponse au stress et l'oedème cérébral cortical au cours de la chirurgie.
- Raser la tête de l'animal et appliquer le gel de lidocaïne à 2,5% sur le cuir chevelu.
- Utilisez des ciseaux pour couper le lambeau de peau recouvrant le crâne des deux hémisphères
- Laver l'os exposé avec une solution saline et retirez délicatement le périoste avec une pince. Cela permettra une meilleure base pour la colle et ciment dentaire à adhérer avec.
- Appliquer un acier poste de chef fait sur mesure avec une chambre d'imagerie centrale et coller avec cyanoacrylate dans un plan sensiblement parallèle avec le crâne sur la région corticale de intérêt et le fixer en place avec du ciment dentaire blanc (Paladur).
- Fixez la tête de la souris pour effectuer une craniotomie de 2-3 mm de diamètre foré sur la région d'intérêt.
- Essayez de minimiser l'échauffement du cortex pendant la chirurgie, les larmes dural, ou des saignements.
- Maintenir le cortex superfusées avec ACSF stérile (NaCl 126 mM, KCl 3, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM de CaCl2, glucose 15 mM, HEPES 1,2 dans H2O distillée , pH = 7,4).
6. imagerie de pH dans le cerveau de souris
- Au cours de la respiration des animaux de l'aide de l'expérience fournissant O 2 de l'air enrichi. L'oxygène est enrichi jusqu'à 80%. O 2 pression partielle et la circulation est fréquemment ajustés pour obtenir une aide à la respiration adéquate. Maintenir constante la température du corps à 37 ° C avec une couverture chauffante contrôlée rétroaction.
- Fixer l'animal par la poste en acier sous l'objectif d'un deux-photoconfiguration n d'imagerie.
- Afin d'injecter la sonde dans le cortex cérébral charger une pipette en verre contenant une électrode AgCl (diamètre de pointe de 4 mm) avec la solution de dendrimère (1 uM). L'électrode permet d'enregistrer les potentiels de champ extracellulaires.
- Avec une installation de micro-injection insérer la pipette dans le cortex à environ 150 um de profondeur. Injecter pendant 1-2 min à une pression de 0,5 psi.
- Optimiser le montage optique pour l'imagerie. Puissance du laser doit être ajustée pour minimiser photoblanchiment et le photovieillissement. Typiquement, la puissance du laser utilisé est de l'ordre de 20 mW et le gain PMT a été maintenue constante à 667 V depuis les étalonnages précédents ont montré que cette tension donne le meilleur rapport signal / bruit.
- Pour l'imagerie exciter le capteur à 820 nm et de détecter simultanément la fluorescéine et la fluorescence de la rhodamine à travers des filtres FITC et TRITC standard.
- Pour le temps des mesures résolues acquérir série laps de temps de 2 Hz.
- Pour la correction de fond acquérir un cadre noir avec le laser obturateur fermé pour mesurer le bruit thermique moyenne survenant dans les PMT et le piédestal généralement ajoutées par l'électronique.
- Pour l'analyse des données selon la même procédure indiqué à la section 4.
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Representative Results
La figure 1 montre une représentation schématique de la détection de la conjugaison de colorants différents échafaudages dendritiques. Les indicateurs qui en résultent peuvent être obtenues dans une étape de synthèse simple à partir de produits disponibles dans le commerce. Dendrimères amine portant sont mis à réagir avec des colorants NHS activés dans le DMSO et purifiés par dialyse. Ce mode opératoire général a déjà été utilisé avec succès pour le marquage de plusieurs dendrimères: i) la génération de dendrimère PAMAM 2, 4 et 6; dendrimères PAMAM 12 17 pégylés et des hybrides de PEG-18 dendritiques. Comme dendrimères distinctes montrent différentes interactions avec les cellules et les tissus (localisation, la toxicité, la perméabilité, la diffusion) la sélection de la structure dendritique est fortement liée à l'application souhaitée et de l'échantillon d'intérêt.
Les capteurs comprennent deux séries de colorants fluorescents: i) les indicateurs de pH et ii) des fragments de pH insensible agissant références internes. Although une grande variété d'indicateurs et de références sont disponibles, les meilleurs résultats ont été obtenus avec la fluorescéine et tétraméthylrhodamine. Le rapport des deux colorants peut être ajustée simplement en utilisant différents équivalents molaires dans la réaction. Figure 2 montre un titrage in vitro typique d'un capteur de pH. La fluorescéine et la rhodamine peuvent être excités séparément à 488 nm et 550 nm, respectivement, ce qui permet de diaphonie minimale entre les deux canaux. Comme on peut clairement être vu, la fluorescéine (figure 2A) montre un comportement dépendant du pH tandis que le signal de la rhodamine (Figure 2A) ne change pas de manière significative dans la gamme de pH physiologique. Par conséquent, le rapport entre ces deux signaux ne dépend pas de la concentration de la sonde, mais seulement sur le pH. Cette indépendance de concentration sera d'une grande importance pour les mesures biologiques comme la concentration de la sonde intracellulaire ne peut pas être contrôlé.
Pour les cellules vivantes mesures la intrlivraison acellulaire des capteurs dendritiques est obtenue par électroporation. Cette technique est largement utilisée en biologie pour la transfection d'ADN et peut être appliqué avec des variations minimes sur le protocole du fabricant. Grâce à l'électroporation, les macromolécules peuvent être délivrés directement dans le cytoplasme, évitant toute complication liée au système vésiculaire de l'endocytose. Figure 3a montre des images confocales électroporation de cellules HeLa avec les capteurs de dendrimères. Un signal fort à la fois à la fluorescéine (vert, à gauche) et la rhodamine (rouge, milieu) est observée. Les deux signaux parfaitement colocalisent démontrer l'intégrité de la structure de capteur. Une carte de quotient est reconstruite en divisant les deux images pixel par pixel, et représenté avec une échelle de pseudo-couleurs (figure 3a, à droite). a été effectuée au pH de serrage avec des ionophores, afin d'étalonner la réponse du capteur à l'intérieur des cellules. Calibrage avec ionophores est un protocole bien établi, several protocoles ont été largement décrits et peuvent être utilisés sans modification. indicateurs réagissent facilement 19 à un pH avec un changement du rapport du vert au rouge, comme indiqué sur la figure 3b. Cela nous a permis d'obtenir une courbe d'étalonnage (Figure 3c) pour les mesures de pH précises. La tendance linéaire dans l'étalonnage démontre la capacité du capteur à répondre à pH sans aucune perturbation de l'environnement cellulaire. La courbe d'étalonnage a été utilisée pour déterminer la valeur du pH de la vie des cellules HeLa de 7,4 et 4,8 pour le cytoplasme et les lysosomes, respectivement. Ces résultats sont en bon accord avec la littérature.
Enfin, nous avons montré comment capteurs à base de dendrimères peuvent être utilisés pour l'imagerie in vivo. Les dendrimères peuvent être injectés aisément à travers le tissu avec une procédure très similaire à celle des indicateurs de calcium largement utilisés. Fois 20 dans le tissu, les indicateurs diffusent très lentement, allowing imagerie à long terme avant le drainage des tissus complet. Des résultats typiques sont présentés dans la figure 4. Fluorescéine (vert) et la rhodamine signaux (rouges) ont été simultanément obtenu avec 820 nm excitation et la carte du rapport a été construit sur une base pixel par pixel, similaire à vivre cellules mesures. En particulier, les indicateurs se localisent dans l'espace extracellulaire, les zones non-fluorescents dans l'image à identifier les organismes cellulaires ou de petits vaisseaux sanguins. Afin de vérifier la réponse du capteur de pH, nous avons proposé l'utilisation d'une hypercapnie. En effet, le dioxyde de carbone est connu pour modifier les équilibres de tampons carbonates dans le sang et les tissus, entraînant une acidification des tissus. 21 Comme représenté sur la figure 4b, l'inhalation de 30% de CO 2 est suffisante pour induire une forte réponse de l' capteur qui est complètement réversible lors d'une nouvelle ventilation de la souris. Ces résultats démontrent le potentiel des capteurs à base de dendrimères de mettre en évidence physiologique et pachangements ornithologique de pH dans les cellules vivantes et in vivo.
Figure 1. Synthèse des capteurs à base de dendrimères représentation schématique du capteur de pH à base de dendrimères. La même procédure peut être appliquée à pratiquement tous les dendrimère amine-palier (à gauche). Le produit a été obtenu par une réaction de conjugaison unique suivie d'une dialyse. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. In vitro titration de pH pour un capteur à base de dendrimères. a) Réaction de l'indicateur de pH à la fluorescéine et b) l'iréférence nternal, la rhodamine, ne montrant aucun changement dans la gamme de pH physiologique.
Figure 3. Les résultats représentatifs de l'imagerie de pH dans la vie des cellules HeLa. a) l'imagerie confocale de canal fluorescéine (à gauche), le canal de la rhodamine (au milieu) et le pH quotientométrique carte (à droite). b) pH étalonnage avec ionophores. c) représentatifs de cartes ratiométriques de cellules serrées à différents pH. . Reproduit de Albertazzi L, M Brondi, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Indicateurs Dendrimer-Based fluorescentes:.. In vitro et in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi: 10.1371/journal.pone.0028450
Figure 4. imagerie de pH dans lacerveau de souris anesthésiée. a) canal vert et rouge (en même temps excité à 820 nm) et le pH quotientométrique carte. b) la réponse typique de la sonde à l'hypercapnie (30% de CO 2). Adapté de:. Reproduit de Albertazzi L, M Brondi, Pavan GM, Sato SS, et al (2011) Dendrimer-Based indicateurs fluorescents:.. In vitro et in vivo Applications PLoS ONE 6 (12), e28450. doi:. 10.1371/journal.pone.0028450 Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Les étapes essentielles pour l'imagerie de pH réussie avec des capteurs à base de dendrimères sont: i) la sélection de l'échafaudage dendritique correct et le nombre d'indicateurs conjugués à elle et ii) l'optimisation du protocole de distribution de capteur dans des cellules ou in vivo.
Le mode opératoire de synthèse est relativement simple et peut être appliquée à pratiquement tous polymère hyperbranché amine portant. Les capteurs peuvent être obtenus à partir des dendrimères disponibles dans le commerce et les colorants NHS-activés dans une seule étape. Nous croyons que cette procédure modulaire et simple sera bénéfique pour l'application ultérieure de ces capteurs pour une variété de questions biologiques. La purification peut être efficacement atteint par dialyse pour éliminer les colorants non conjugués. La sélection de l'échafaudage dendritique est cruciale et dépend de l'application particulière souhaitée. Les différents dendrimères ont été montrés pour avoir des localisations particulières à l'intérieur de cellules en raison d'interactions spécifiques avec des sstructures ubcellular. Dendrimères neutres (par exemple acétyle PAMAM G4) ne montrent aucune interaction à l'intérieur des cellules et montrent une localisation diffuse. Ainsi, ils représentent un bon choix pour une imagerie de cellules entières. Au contraire chargé positivement dendrimères de générations différentes (de G2 à G6) interactions électrostatiques avec affichage de charge négative biomolécules (c.-à-ARN) résultant de la localisation cellulaire spécifique. Dendrimères cationiques sont donc idéal pour l'imagerie spécifique organite.
Le choix des colorants de détection est critique. Plusieurs indicateurs de pH, les colorants de pH non photosensible avec émission de couleur différente et H + affinité (pK) sont disponibles. Nous avons essayé beaucoup de différentes combinaisons de colorants et les meilleurs résultats ont été obtenus avec de la fluorescéine et tétraméthylrhodamine. Cette paire de fournir une bonne réponse à un pH dans la gamme physiologique (pK = 6,4) et est compatible avec couramment utilisés configurations de filtre de la microscopie. Pour des exigences différentes, comme mesures dans les différentes gammes de pH, une certaine optimisation peut être exigée. Notamment, tous les indicateurs conservent leurs propriétés (luminosité, PK) sur dendrimère conjugaison 5 Ce comportement dépend à la fois de colorant et structures dendrimères;. Cependant, nous avons pu rendre compte de plusieurs indicateurs dont les propriétés photophysiques des indicateurs ne sont pas affectées de manière significative. 17 Si tel est le cas, nous suggérons de conjugaison des colorants au moyen d'un linker de façon à minimiser les interactions dendrimère-colorant. Plusieurs colorants réactifs sont disponibles dans le commerce avec des espaceurs alkyle 22 ou dans d'autres groupes de liaison de PEG peut être utilisé. De plus, le nombre d'indicateurs et les ratios indicateurs-à colorants référence sur l'échafaud est important. Le rapport idéal dépend de la sensibilité spectrale de l'installation de microscopie utilisé et de l'échantillon biologique d'intérêt 5,17. Bien que peu de dépannage peut être nécessaire, la procédure de synthèse très facile et rapide va grandement faciliter le processus. Enfinle degré de fonctionnalisation du dendrimère, c'est à dire le pourcentage de groupes terminaux du dendrimère qui sont conjugués à des colorants, peut influer sur les performances des indicateurs. Afin d'éviter tout problème de solubilité, nous suggérons de fonctionnalisation d'environ 10% à 20% des groupes terminaux de dendrimère. Dans le cas des dendrimères pégylés Toutefois, en raison de la contribution du PEG à la solubilité, une fonctionnalisation complète peut être obtenue. Cela peut aussi limiter la présence indésirable de FRET et autres phénomènes d'extinction parmi les colorants conjugués.
Les dendrimères sont pas cellule perméable, mais la livraison intracellulaire peuvent être atteints par électroporation. Nous avons utilisé l'ADN-transfection protocole du fabricant pour la lignée cellulaire d'intérêt sans autres modifications. Un paramètre important est la concentration du dendrimère dans le tampon d'électroporation, en particulier dans le cas des indicateurs ayant une mauvaise luminosité ou dendrimères à des concentrations élevées qui pourraient être toxiques pour les cellules. Low concentrations de dendrimère résulteront dans un mauvais signal à l'intérieur des cellules tandis que des concentrations élevées provoquent toxicité et induire la mort cellulaire. La concentration idéale dépend de la paire dendrimère / indicateur ainsi que sur l'installation d'imagerie disponible et peut avoir besoin d'optimisation. Si un électroporateur n'est pas disponible dans le laboratoire, la micro-injection pourrait représenter une alternative valable. Cependant, il s'agit d'une technique simple cellule et fera l'acquisition d'un nombre important de cellules imagées plus laborieuse.
La procédure capteurs d'imagerie est très flexible et peut être facilement adapté à plusieurs configurations de microscopie. Nous avons précédemment rapporté l'utilisation des capteurs dans un système confocal avec des filtres acousto-optique accordable 5,17 mais standards des jeux de filtres FITC / TRITC de peut également être utilisé. Quand une concentration intracellulaire optimal est obtenu, l'imagerie du pH est simple. Nous conseillons d'optimiser l'intensité du laser, sténopé et détecteurs gagner sur une large gamme de capteur intracellulaireconcentrations avant de lancer la calibration pH avec ionophores. Si la même installation de microscopie est utilisé dans les mêmes conditions de l'étalonnage peut être utilisé pour toutes les expériences. Ici, nous vous proposons imagerie ratiométrique pour éviter capteur concentration dépendance et des artefacts. Une autre méthode intéressante pour obtenir que est représenté par des sondes à base de vie-comme élégamment indiquées par Vinogradov et ses collègues 15 et des avantages de l'affichage des options et des inconvénients. mesures de durée de vie ne nécessitent pas de correction car ils sont les procédures de concentration-indépendante et d'étalonnage intrinsèque est souvent plus facile et plus stable. En outre, une seule couleur est utilisée en évitant les complications et l'aberration possible induite par l'imagerie ratiométrique du vert au rouge. Toutefois, seuls quelques sondes de vie efficaces sont disponibles en une large gamme de sondes basées sur l'intensité sont commercialement accessible. L'équipement nécessaire pour l'imagerie quotientométrique est plus simple et plus susceptibles disponible en tant queinstallation de microscopie tandard. Mesures de durée de vie ailleurs sont intrinsèquement lent et ne peuvent pas être appliqués à suivre les processus biologiques rapides. Par conséquent, le choix entre ces deux techniques dépend fortement de l'instrumentation disponible et sur le processus biologique d'intérêt spécifique.
Bien que conceptuellement similaire, l'imagerie in vivo est plus difficile que dans la culture cellulaire. Rapport signal sur bruit est réduit par diffusion et les interactions avec les tissus peut influencer la réponse du capteur. De plus, la diffusion à travers le tissu et donc la fuite de l'indicateur à partir de la région d'intérêt représente un problème supplémentaire non présent pour les mesures intracellulaires en culture. Pour ces raisons, le choix de l'indicateur est cruciale. Alors que pour les mesures intracellulaires plupart des dendrimères fonctionne très bien (G4, G4-Ac, G6, hybrides PAMAM-PEG), pour in vivo de détection, nous recommandons l'utilisation de dendrimères pégylés. 17 IndEED cette architecture est particulièrement efficace à cet effet pour plusieurs raisons: i) le PEG augmenter la taille du dendrimère et réduit sa fuite du tissu; ii) la liaison PEG minimise la trempe résultant de colorant colorant et colorant dendrimères interactions et iii) le PEG protège les colorants à partir du tissu en évitant la perte de la fonction souvent observé après l'injection de tissu de capteurs. La qualité de la détection du pH dépend fortement du succès de l'injection d'une quantité suffisante de dendrimère dans le tissu. Lorsque ceci est réalisé la procédure d'imagerie et l'analyse de données sont similaires à ce qui a été déjà rapporté pour la culture de cellules. Ceci est une démonstration claire de l'efficacité de détection in vivo et peut être utilisé en tant que contrôle interne de l'activité de l'indicateur avant toute mesure.
Nous pensons que ces résultats ainsi que les procédures détaillées présentées dans ce travail permettra l'application des capteurs à base de dendrimères pour sélectionner physchangements siologiques et pathologiques de pH dans les cellules vivantes et in vivo.
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Disclosures
Par défaut: les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Discussions utiles avec Isja de Feijter et Matt Baker grandement appréciée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
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