Summary
差分精子之间的竞争能力
Abstract
卵子受精的同种雄性之间的竞争性选择的机制之一， 即选择上运行的数量最大化，成功交配事件，而不是最大化的生存和活力1。精子竞争代表相同的女2，他们的精子是在时间和空间上的巧合交配后，雄性之间的竞争。这一现象已在多种植物和动物物种的3。例如，野生捕捞D.果蝇女性通常含有精子2-3名男性4。精子被储存在专门机关与有限的存储容量，这可能会导致直接的竞争，从不同男性的精子2,5。
权益（实验的男性类型）不同的男性的精子竞争能力的比较，通过控制双交配实验技术已执行在实验室6,7日ts。简单地说，一个单一的女性露出两个不同的男性连续的，一个实验的男性和一个交叉配合参考男性。相同的交配计划是随后使用其他实验的男性类型，从而促进他们的精子的竞争能力，通过一个共同的参考间接比较。父亲的实验和参考男性的个人的分数是确定使用的标记，它允许一个估计精子的竞争能力，用简单的数学表达式7,8。此外，精子的竞争能力，可以估算在两种不同的情况，根据实验的男性是否是第二或第一的队友（进攻和防守法，分别）9，被认为是反映不同的能力属性。
在这里，我们描述了一种方法，有助于询问不同的遗传因素的作用公认的基础吨他现象D.精子的竞争能力果蝇 。
Introduction
由于杰夫·帕克指出精子竞争的患病率在昆虫和进化的影响2，一股在果蝇和其他物种的研究，这种现象在许多不同的层面上试图摆脱一些光。感兴趣的领域的一些例子已经及其变化调查9,10自然种群，其遗传结构和潜在的遗传因素的相关性11-14，其作用是在推动两性之间的协同进化15,16。在D中专门的精子贮藏器官的能力有限，一对精囊和的精液插座6,17，雌性果蝇，有助于从不同男性的精子竞争。约1,500精子在交配过程中的女性，但只有约500，可容纳提到的器官18,19。在实验室中，控制双交配实验中涉及的参考男性和一个或多个感兴趣的男性，已被广泛用于评估精子的竞争能力7,8。
精子的竞争能力估计为双交配实验中实验的男性后代总量父系后代的比例， 即从实验和参考男性。精子的竞争能力，由两部分组成，他们每个人在一个单独的试验评估。罪检测，实验的男性的精子，以取代从第一男性的精子的能力， 即参考男性，评估。相反，在防守测定，实验男性精子的能力抵抗位移或减少参考男性的精子受精成功进行了评价。根据法，进攻或防卫的类型，估计精子的竞争能力，通过分数P 1，P 2。 P1和P 2只能取0和1之间的值。中间值通常被解释为间接证据的精子混合，这意味着一个生理情况下涉及直接的精子竞争。同样的理由也可以解释为，极端值强差的精子竞争能力的证据。早期研究表明，在D P 2 果蝇超过0.8，随着时间两者之间的交配延长7。此相同的实验设计已被用于在其他果蝇 ，P 2是常用的统计研究，以评估精子竞争力20。对于大多数种，菌株的P 2值高于0.6 21。然而，不同男性的精子之间的直接竞争无关的其他一些机制可以产生相同的分数（见讨论）。
ð通过使用由所述第一或第二男性与配istinguishing后代能够容易识别的标记。在早期的研究中，男性在亚致死剂量的照射，例如，X射线，使得几乎所有的卵子照射的精子受精失败孵化7。随后，基因突变改变眼部色素沉着或机翼形状是最常用的标记。前者的例子是突变体重 （ 棕色）9，CN（朱砂 ）22 和 w（ 白色 ）23，而突变循环 （ 卷发 ）24对应的第二个不同的表型，这些突变，已被合并在同一个人， 如CN体重 。程度较轻，25位酶和微26,27与已知的遗传模式也被使用。
设计的实验测试的差异这里描述的精子竞争能力如下实质上是克拉克等人 9。来自这些实验结果给出的信息仅差分侍正在审议的实验的男性类型。检测也作出拨备健身14,28和精子的可视化技术24受精后的差异使精子能力的差异被解释为在P 1（或P 2）破门得分的差异。
图1概括了双方的进攻和防御检测的理由。为了说明物流过程中的罪行进行的实验在D果蝇 14将进行详细说明。这种特殊的罪行检测被用于测试可衡量效果的精子特异性基因家族动力蛋白中间链（SDIC）对精子的竞争能力。所有成员s的这个基因家族位于X染色体上的串联。淘汰赛男性产生通过删除国投集群。由于删除的板块还包括必要的的基因短翼（SW），研究的目的是评估的相关性， 国投 ， 国投-SW缺失的男性携带被救出由转基因副本SW（标志为P {SW} 2号染色体上，还进行了一个小型记者白基因）。眼睛颜色被用来作为一个可见的标记亲子鉴定。所有的苍蝇在白色突变的背景，除了那些从应变俄勒冈-R，它被用来作为参考男性。
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Protocol
应进行小规模的实验，熟悉整个过程。
1。 ，收集处女女性和朴素男性
概述实验的最简单的版本包括四种类型的初始十字架，其中涉及下面结合成人：）W 1118人，以便收集处女雌二）俄勒冈-R，以收集天真参考男性的个人; ）P {SW}纯合子雄性和雌性携带野生型组织为了收集的天真实验男性（I型）， 国投的控制线;和d）P {SW}纯合子的男性和国投SW缺失携带处女雌为了收集天真实验国投SW缺乏（II型）的男性进行。
- 设置多个小瓶含8-10名女性和5名男性。允许女性奠定鸡蛋和新的小瓶传输成人每隔3-5天。使用瓶，而不是必要的小瓶，如果总是用新鲜的食物。所需的小瓶的数量将依赖于所研究的实验男性类型的数目，估计是要检测的差异（ 表1）的数目的个人。每瓶10多名女性，可能会导致过度拥挤在幼虫生长，这可能会导致在生育后代的变化。商店瓶在25°C的温度控制室。
- 开始收集处女女性和天真男性的上11 日和12 日成立后最初的十字架。等待的时间根据不同的温度较低的温度下在较长的发展时间延迟个人的集合。羽化的影响的定时的另一个因素是不同的介质。营养丰富的食物，如玉米面酵母培养基29的成人，确保正确的发展生殖系统，这有利于配合。收集未交配的苍蝇，每4-6小时。当收集，引入瓶中的CO 2，麻醉苍蝇点击苍蝇，性别体视显微镜下（ 图2）。按性别和表型和适当标签的小瓶，将所需的苍蝇成不同的小瓶。
注意事项1。收集日常在早上开始丢弃前一天晚上出现在成人。收集处女女性和天真男性的一次或两次在白天进行。通常情况下，D。成为性成熟的雄性果蝇羽化后的8小时，在25°C 30。如果的苍蝇都保持12:12小时的光/暗周期下，预计两峰羽化：在最初的1-2小时后灯开启，并在2个小时前的指示灯会熄灭。羽化后24小时内发生的蛹变暗。
注2。女性不超过10 SH应投入相同的小瓶，以防止过度拥挤。这也限制了损失的女性的情况下，他们必须被丢弃，因为它们中的至少一个不是处女。
注3。为了收取适当数量的的处女女性和男性天真在很短的时间内，可以采用以下措施。设置实验中，涉及两种类型的实验男性（ 表1）1118 瓦特 15-20小瓶。轻轻地洒在介质表面，并添加一些活性干酵母颗粒，以方便产卵。传输父母至少4次，连续几天。化蛹在每个管形瓶中，以增加可用的表面，插入多折叠纸（7×5厘米），在第 4或第 5天后，父母被转移到另一小瓶中（ 图3）。如果羽化数从最初的十字架是不够的，等再过几天，收集个体ALS从小瓶设立在不同的日期。计划开展的实验，甚至连续几天的工作量。
2。双交配实验
图4示出了双交配实验14中所涉及的主要步骤。
- 1日上午，成立了第一个交配。俄勒冈-R的雄性交配的罪行检测。
- 使用吸引器，设立小瓶含10 ,4-5日龄白眼1118瓦特处女的女性和10红眼俄勒冈-R天真男性。连续5天，每天两到三瓶。要设立的瓶数可能会有所不同，这取决于可用的个人的数目。允许苍蝇交配2小时。
- 丢弃俄勒冈-R男性和放置到一个新的小瓶，使用吸气器（ 图5）的每一位女性。性别鉴定可以通过目视检查几个形态上的差异（ 图2）。适当地标示每个小瓶，离开女性在小瓶为2天（以下简称“卷”）。
- 第3天，成立了第二次交配。男性和交叉设置应进行随机选择，为了尽量减少任何潜在的偏向任何实验的男性类型。
- 前两小时指示灯会熄灭，再次转移到一个新的小瓶女性吸气。适当地标签新瓶（以下简称“V2”）。
- 介绍5-6日龄三个实验男性相同基因型到V2。
- 重复2.2.1和2.2.2为每个女性。
- 第4天，2小时前光开启（ 即不超过12个小时后，2.2.1），丢弃男性使用抽吸。
- 第6天，每个女性再次转让到另一个新的小瓶。标签新瓶适当地（以下简称“V3”）。
- 第10天，放弃的 w 1118
- 检查V2和V3的后代。女性引入V2（V3）， 例如女性的第一开始产卵V2，后17天之后，第一次检查后，进行13-15天。正是后17天进行第二次检查。这个时间框架构成安全上的时间边界，保证没有第二代相同的小瓶。两次检查防止过度拥挤，同时有利于后代的计数。
- 17天，检查v1和确保有红眼睛的后代目前，如果没有标注相应的小瓶。白色眼睛的后代的存在下，表示不是处女雌性而没有后代表明，配合与参考或男性实验并没有出现在初始配合时。
- 第17天，执行第一次检查V2。麻醉后代出现v2中的CO 2和眼睛的颜色和性别对其进行排序。父亲由第一和秒的记录后代号码第二个位图6显示了预期的在每个配合计划的后代的表型。在这个特定的实验14中 ，可以明确地分配唯一的女性的后代，作为参考或实验男性与配，因此只有从女儿的信息可以被用于计算P 2。如果与其他标志物，雄性后代侍可以明确分配，后代数量的男女双方可以用在下游计算。丢弃的后代，但，保持V2第二次检查。
- 第20天，按2.5.2在v2中新涌现出的后代，然后丢弃药瓶。
- 第20天，检查第三版首次出现了后代，并按照步骤2.5.2。
- 第23天，继续在V3中新涌现出的后代2.5.3。
注1：由于潜在的P分数膨胀的效果，可能有多次交配（2.2.2和2.2.3），交配可以被限制在一个特定的时间帧。将依赖于频率与基因型的女性和男性使用remating的时间框架。多次交配的概率，特别是减少在夜间11。
注2：不要加，因为这可能会导致潜在的过度生长的酵母成蝇的当数低的问题，是由于活酵母颗粒。
3。数据分析
- 录制的后代计数应该在适当的组织容易视觉检查和高效的分析，用合适的统计软件包（ 如 JMP SAS研究所）或免费的基于Web的工具（ 如 http://vassarstats.net/ ）。
- 精子的竞争能力。添加v2和v3的罪名。雌蝇引起没有或非常有限的后代（ 如 <10），在手术过程中死亡，只有成功insemina泰德由一个，两个男性被视为无信息的，被排除在任何下游的统计分析（2.5.1和表2）。计算P 2的得分为每个翔实的女性。
- 测试实验的男性相比，P 2值之间是否有统计学上的显着差异。这可以通过使用参数（ 例如 Tukey的HSD）或非参数（ 例如钢Dwass）的测试，这取决于几个因素，包括的P 2值的分布的方差和均值之间的依赖关系的歪斜。通常适用于角度变换参数测试31的使用之前，如P 2的比例。
- 交配率差额（可选）。对于每一个实验的男性类型，计算双重交配的女性和那些只交配与男性（参考男性的罪行检测和实验的男性在d法）efense。使用双尾Fisher精确检验（可在http://www.langsrud.com/fisher.htm ），确定两种类型的实验男性之间是否有统计学上的显着差异。
- 性别比（可选）。对于每个实验的男性，使用卡方检验，以确定是否偏离预期的1:1的比例从每个女性后代的性别比例。
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Representative Results
表2总结了两个罪行实验（化验1和2）的一些主要特征，其中D。 （I和II型），分别的功能国投集群与无果蝇实验的男性相比，14。考虑后遇到一些重复的不同发病率58-83％的女性被认为是信息，因此他们的后代可以用于计算P 2侍计数。非参数检验的结果是一致的，男性精子的竞争能力，而不的国投集群（II型）相比，男性与完整的集群（I型）14。这种模式是重现跨越的罪行进行检测。一个类似但没有统计学意义的趋势被发现在并行执行的防御检测（未显示）。更重要的是，缺乏交配率差异（3.4）的可能性排除男性的基因型可能影响女性remating的行为14。
| 进攻含量 | 国防含量 | |||||
| 实验 ♂ 类型 | 瓦特1118♀ | 或-R♂ | 实验 ♂ | 瓦特1118♀ | 实验 ♂ | 或-R♂ |
| 我 | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
| 二 | 60-70 | 60-70 | 180-210 | 60-70 | 60-70 | 180-210 |
表1中。用于比较两个实验的男性类型双交配实验所需的个人数或-R，俄勒冈-R。
| ♀ | ||||||
| 实验 ♂ 类型 | 初始计数 | 没有成功受精参照 ♂ | 没有 ♂ 实验的成功受精 | 存在问题1 | 信息（％） | P 2 2 |
| 含量1 | ||||||
| B +（I型） | 60 | 5 | 6 | 2 | 47（78％） | 1.000（1.000-0.987） |
| A-级（II型） | 55 | 1 | 7 | 5 | 42（76％） | 0.986（1.000-0.936） |
| 试验2 | ||||||
| I +（I型） | 74 | 9 | 7 | 15 | 43（58％） | 1.000（1.000-0.979） |
| E-（II型） | 75 | 3 | 8 | 2 | 62（83％） | 0.983（1.000-0.927） |
表2中。摘要的女性犯罪分析中使用的数量不同的事件的影响进行了测试实验的男性类型之间的差异，死亡1例 ，ESCAPED在检测过程中，或上升到低于阈值的后代数量。2位数（四分位距）。
图1。用于各基因型检测的进攻和防守。实验设计的颜色代码表示成年果蝇的眼睛颜色。俄勒冈-R男性作为参考进行比较间接精子竞争力的两个实验的男性：一个承载正在研究中的遗传因子的野生型形式（类型I）和一个在其中的遗传因子的功能已经使用扰动（II型）。的的国投群集，在这种情况下，遗传因素，位于X染色体上的，而SW转基因位于2号染色体上的。描述的实验部分中执行的
图2。 D.性别鉴定（A） 果蝇背，（B）外侧，以及（C）1小时岁女性（左）和男性（右）与CO 2麻醉体视显微镜下腹面观。男性生殖器的色素比阴道板上升到一个明显的暗斑，这是最可靠的字符，用于绝育。此外，男性前肢跗拥有黑暗边缘的刷毛（性别）缺席的梳子（D）女性。可靠和快速的性别鉴定旧苍蝇肉眼强烈建议时转移个人使用吸痰器装入小瓶。在老年人中，男性腹部背部比女性多深。女性通常较大，比男性有一个苍白的腹部。产卵器使得女性腹部指出。
图3。使用多重折叠的纸张，以增加可用的表面徘徊的幼虫。
图4。大纲的实验测定精子的竞争能力差异，在D质量果蝇交配2小时使用VIR杜松子酒1118瓦特的女性和俄勒冈-R男性开始每天5天。在每个质量交配，一旦终止，女性12-14必须分开吸气成个别小瓶（V1）。两天后，每雌转移到一个新的管形瓶（v2）的三个实验的雄性相同基因型。这些人被允许交配过夜。男性〜12小时后，将被丢弃，而雌性产卵2天。随后，转移到新的小瓶（第三版），允许再次产卵雌性，后3天，最后被丢弃。十三至十五天及17天之后，女性开始产卵v2和v3，父亲的实验和参考男性后代使用适当的标记来识别和记录。 v2和v3后后代的两次检查，小瓶被丢弃。向下箭头，舍弃个人眼睛标志，瓶检查。改编自9。d/50547/50547fig4large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图5。柔性吸气，，从琥珀乳胶管组装 ，一个1毫升毕业于小费支配口器接收苍蝇和其他运作。为了防止苍蝇被吸进管，细网眼布管交界处，是用来屏蔽飞尖。
图6。预期表型的罪行检测的后代。左边和右边分别跨越评估控制和基因敲除男性精子的竞争能力。两个F亲本和后代的基因型和眼睛的颜色示athers。由于在该测定中所用的特定的遗传标记，只有女性后代可以用于计算P 1（或P 2）分数（见文中说明）;的男性后代与配实验男性白色眼睛因此表型没有区别参考男性的雄性后代。DF，阴虚，P {SW}，转基因的，W 1118的白色基因的突变等位基因点击这里查看大图 。
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Discussion
我们已经描述了实验设计，评估基因上不同的差异的相对贡献D.雄性果蝇的后代控制的双交配实验7,8。已经这样做在假设有遗传因素影响精子的竞争能力，已经示出的相似方法虽然适用于防御吸附试验（ 图1）内的罪行检测的上下文中。这种实验的设计可以进行修改，以测试如女性基因型32的影响等方面的侍成功。可以合并的修改的一个例子是直接监测交配之间的女性和男性第二。此外，同样重要的是，要注意的是实验的男性类型的相对性能是依赖于基因型的男性和女性使用的测试仪，并因此不能被外推到其他场景涉及不同的测试仪的男性和女性10,32,33。
由于收集所需的个人（处女女性和天真男性的后代）和得分是劳动密集型的，应该根据不同的实验的男性类型进行评估的训练有素的人员数量。这里所列的实验，可以很容易地处理超过六个星期由一个人。事实上，多达五个实验的男性类型，可以并行计算。唯一的额外的措施采用的是延长数天设立初始质量交配和收集所需的个人。
根据我们的经验，起始号码使用的女性（60-70）减少样本大小足以容纳又不损害我们的统计功率检测实验的男性类型（ 表2）之间的差异。我数减少nformative女性可以从不同的因素导致，例如双重交配或过早死亡的证据不足。然而，需要为每个实验的凸型的女性人数，以达到足够的统计功率会有所不同，这取决于遗传因素的影响，所研究的幅度上。为了估算合适的复制水平是非常明智的试点实验。
统计差异P 1（或P 2）分数表示男性施肥效率的变化，虽然他们不告知造成这种差异的基本机制。这是因为多个变量，可能会影响精子的竞争能力（广泛的评论在20和34）。精子属性，如大小，数量和运动，可以影响精子的竞争直接35。此外，其他的机制无关的直接精子竞争约n也有助于在P 1 P 2值的差异。例如，男性的精子可以被优先删除，重新定位，或冲出之前或在交配与第二男19,20。机械刺激，可能会发生这种情况，例如，在交配，并通过分子存在于第二男性精液，这将影响第一男性的精子产生负面19,36。因此，互补性分析，评估其影响的那些额外的间接机制必须进行，最好事先这里描述的双重交配实验。这些实验的例子是那些测试差异在受精卵的可行性（ 如幼体成活率）和卵孵化率（卵子受精成功的代理）28,37，最终导致后代数量的差异。
精子成像技术，也可以是非常翔实的19,24,28。从本质上讲，一个f的男性基因被修改，使得精子标记用荧光融合蛋白（ 例如 ，参考男性与绿色荧光蛋白）的帮助监测在雌性生殖道中的精子动态。这种方法相结合，进一步染色用4'，6 -二脒-2 - phenyllindole吲哚（DAPI），用于直接识别在解剖的精液的容器D.从所述第一和第二的男性的精子计数果蝇雌性24,28。在一项研究中24，精子计数差异很好的一致性与支持的观念，精子的竞争能力，而不是间接机制的真正差异，这些差异在男性侍反射的P 2值的差异。
随后的优化已经实现，产生表达融合精子特异性蛋白19的绿色和红色的荧光标记的转基因株系。这些improvem已废除允许研究人员监测精子的两个直接竞争的男性精子的分辨率了前所未有的程度。总之，执行双交配实验和像那些额外的检测建议有助于缩小P 1 P 2分数的差异，发现在实验的男性类型，这可能打开了解剖的遗传学基础的性质自然发生的变化在精子竞争能力。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢NSF（MCB-1157876）提供资金。我们也感谢阿尔贝托CIVETTA约翰Roote，两位匿名审稿征求他们的意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber latex tubing | VWR | 62996-473 | 1/4 inch ID, 1/6 inch Wall |
| 1 ml graduated XL filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed |
| Parafilm | Sigma | P-7793 | |
| Mesh Fabric | Thin and smooth | ||
| Stereomicroscope | Leica | S6D | |
| CO2 Tank | Airgas | CD-50 | Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available |
| FlyStuff Foot Valve, complete system | Genesee Scientific | 59-121C | Not necessary if FlyNap is used |
| Plastic vials | Genesee Scientific | 32-109 | Come with carboard trays that can be reused for holding vials |
| Cotton balls | Fisher Scientific | AS-212 | |
| Active dry yeast | Red Star | Found in general grocery store | |
| Sharpie markers | Different colors may be used for marking different genotypes |
References
- Darwin, C. The descent of man and selection in relation to sex. , John Murray. (1871).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).
- Birkhead, T. R., Møller, A. P. Sperm competition and sexual selection. , Academic Press. (1998).
- Jones, B., Clark, A. G.
- Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster. Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).
- Jonsson, U. B. Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster. Genetics. 47, 1719-1736 (1962).
- Boorman, E., Parker, G. A. Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status. Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).
- Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C. Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. Smith, R. L. , Academic Press. 372-427 (1984).
- Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster. Genetics. 139, 189-201 (1995).
- Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. Female x male interactions in Drosophila sperm competition. Science. 283, 217-220 (1999).
- Civetta, A., Clark, A. G. Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila. Genet. Res. 75, 143-151 (2000).
- Greenspan, L., Clark, A. G. Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster. Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).
- Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).
- Yeh, S. D., et al. Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).
- Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila. Evolution. 53, 1804-1822 (1999).
- Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A.
- Nonidez, J. F. The internal phenomenon of reproduction in Drosophila. Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).
- Miller, G. T., Pitnick, S.
- Manier, M. K., et al. Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster. Science. 328, 354-357 (2010).
- Simmons, L., Siva-Jothy, M. Sperm competition and sexual selection. Birkhead, T. R., Møller, A. P. , Academic Press. 826 (1998).
- Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila. Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).
- Markow, T. A. A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei. Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).
- Barbadilla, A., Quezada-Díaz, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance. Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).
- Civetta, A. Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila. Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).
- Turner, M. E., Anderson, W. W. Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes. Evolution. 38, 983-995 (1984).
- Harshman, L. G., Clark, A. G. Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila. Evolution. , 1334-1341 (1998).
- Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).
- Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation. Nature. 400, 449-452 (1999).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , CSHL. (1997).
- Sokal, R. R., Rohlf, F. J. Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , 3d, Freeman, W.H. (1994).
- Clark, A. G., Begun, D. J. Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila. Genetics. 149, 1487-1493 (1998).
- Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A.
- Wigby, S., Chapman, T.
- Pizzari, T., Parker, G. A. Sperm biology: an evolutionary perspective. Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. , Academic Press. 674 (2008).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction. Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).
- Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).
