Summary
בפועלי דבורת דבש, הזדקנות תלויה בהתנהגויות חברתיות ולא על גיל כרונולוגי. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשיג עובד סוגים עם דפוסי הזדקנות שונים מאוד ונותחו להזדקנות תאית.
Abstract
אגודות בעלי החיים חברתיים מאוד וכוללות הבדלי תוחלת חיים עצומים בין יחידים הקשורים באופן הדוק. בקרב חרקים חברתיים, דבורת הדבש היא המודל הטוב ביותר שהוקם במטרה ללמוד כיצד פלסטיות בתוחלת חיים והזדקנות מוסברת על ידי גורמים חברתיים.
כת העובד של דבורי דבש דבורים כוללת אחות, אשר נוטים להרהר, ודבורים בוזזים, אשר אוספים צוף ואבקת פרחים. העבודות קודמות הראו כי תפקודי מוח וביצועי טיסה להזדקן במהירות רבה יותר במלקטי מזון מאשר באחיות. עם זאת, תפקודי מוח יכולים להתאושש, כאשר מלקטי מזון לחזור למשימות סיעוד. דפוסים כאלה של הזדקנות מואצת ופונקציונלית ההפוכה צמודים לרמות משאבי חילוף חומרים שהשתנו, לשינויים בשפע חלבון ואת תפקוד מערכת החיסון. Vitellogenin, חלבון חלמון עם פונקציות מותאמות בבקרה הורמונלית והגנה תאית, עשוי לשמש כאלמנט רגולטורים מרכזי ברשת ששולטת בדינמיקת ההזדקנות שונה בעובדים.
כאן אנו מתארים כיצד הופעתם של אחיות ומלקטי מזון יכול להיות במעקב, ומניפולציות, ובם ההיפוך ממלקטי מזון קצר בדרך כלל לאחיות אורך חיים גדולות יותר. תוצאות הנציג שלנו להראות כיצד אנשים עם גיל כרונולוגי דומה להתמיין למלקטי מזון ודבורים אחות תחת תנאי ניסוי. אנו מדגימים כיצד ניתן תוקף היפוך התנהגותיות ממלקטי מזון בחזרה לאחיות. לאחרונה, אנו מראים כיצד שונים הזדקנות תאית יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת ההצטברות של lipofuscin, סמן ביולוגי אוניברסלי של הזדקנות.
ללימוד מנגנונים העשויים לקשר את ההשפעות חברתיות והזדקנות פלסטיות, פרוטוקול זה מספק כלי סטנדרטי שנקבע לרכישת חומר מדגם רלוונטי, וכדי לשפר את יכולת השוואת נתונים בין מחקרים עתידיים.
Introduction
מבני המושבה המורכבים של בעלי חיים חברתיים מאוד נשמרים באמצעות האינטראקציה של כת רבייה, וכת עוזר של כלל עובדים הלא כפול עם התנהגויות משימה חברתית שונות. בפועלים השונים, התאמות פיסיולוגיות ספציפיות לאפשר התנהגויות טיפול SIB מובהקות, וגם קשורות להבדלי תוחלת חיים קיצוניים. דבורי דבש וחפרפרות מייצגים את המודלים של בעלי החיים הטובים ביותר שפותחו כדי ללמוד איך sociality קשור לדפוסי מואצים, זניח או הפוך הזדקנות 1-3.
במושבות דבורי דבש, מלכת הטלה אחת נעזרת באלף עובדים שנוטים להרהר, ללקט מזון, ולעסוק בשמירה, ויסות חום או התנהגויות היגיינה 4. בין העובדים אלה מלקטי מזון קצרים מאוד, דבורי אחות עם ביניים, ודבורים בחורף (diutinus) עם תוחלת החיים הארוכים ביותר הם. אנשים, לעומת זאת, לא באופן קבוע מחויבים מסוים ווrker סוג, אבל להציג ontogeny התנהגותיים גמיש: הם משתנים ממשימת התנהגות חברתית אחד למשנו ("קסטות זמניות"). דבורי קאלו יכולים לשנות לדבורי אחות להרהר בטיפול, שסופו של דבר עשוי להשתנות לליקוט מזון בחוץ. עם זאת, דבורי קן חסר ניסיון יכולים גם להפוך לדבורים בחורף ארוך חיים, ומלקטי מזון קצר מועד יכול אפילו לחזור לאחיות בדרך כלל אורך חיים גדולים יותר. עובדים עם קיצוניות (דבורים בחורף) ואורך חיים בינוניים (דבורי אחות) פיתחו היטב איברי ייצור ואחסון מזון עם משאבים עצומות - בניגוד למלקטי מזון קצר מועד (הנסקרת ב 1,5). עם זאת, שהרגולציה של תוחלת חיים בודדות חורגת שינויים פשוטים באיזון המשאבים של פרט שהוצע על ידי מחקר על חלבון חלמון, שבה יש פונקציות מותאמות מגוונות בכת העובד שאינו מתרבה, כגון ייצור ריבת 6, בקרה הורמונלית 7, חיסוניים 8 ונוגד חמצון להגנה 9.
דפוסים של fירידת unctional (הזדקנות) פערי תוחלת חיים מראה בקרב עובדים, כפי שנקבע על חוש הריח, וגם לתפקודי מוח או מנוע אחרים 10-13. באופן ספציפי, הירידה המשמעותית בתפקוד למידה רק לאחר שבועיים של ליקוט תואמת התקדמות תמותה דומה במלקטי מזון 14, בניגוד לחוסר ירידה לזיהוי (הזדקנות זניחה) בדבורים בחורף ארוכים, חי 15.
כדי לזהות את טביעות האצבעות מולקולריות של הזדקנות גמישה שהותאמנו פרדיגמות ניסוי קבעו כי נאפשר לניטור וטיפול במעברי הזדקנות מסוג 8,16,17. להתנסות פרטים 1 איך להשיג דגימות שבו ניתן להפריד את ההשפעות של גיל כרונולוגי והתנהגויות חברתיות מסוימות עובד מסוג על הזדקנות. ניסוי 2 מתאר את ההיפוך של מלקטי מזון עם מואצים לתוך דבורי אחות עם דינמיקת הזדקנות מואטת. ניסוי 3 מספק גישה לחיטוט השפעות של הזדקנות תאית על ידי anatomicaכימות ליטר של סמן ביולוגי שהוקם להזדקנות תאים (lipofuscin) 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Decoupling הזדקנות מגיל כרונולוגי
סעיף זה מתאר את ההתקנה של מושבות עוקבה כפולות, שמורכבות מקבוצה של אנשים שזוהו שחולקים את אותה גיל כרונולוגי ("קבוצת גיל אחת") וקבוצה של דבורי קן. אנשים בגילים של אותה קבוצת גיל אחת סופו של דבר להפריד לעובד-סוגים שונים עם דינמיקת הזדקנות שונה - כל אלה הם דבורי אחות עם דבורי האטה ובוזזים עם ירידה תפקודית מואצת. כל ההליכים מתוארים למושבה אחת ניסיונית. אנו ממליצים, עם זאת, לבצע ניסויים לפחות שתי מושבה משכפל כך ניתן לשלוט בהשפעות שהמושבה ל( שני לשכפל את עיצוב).
- הכנת קופסות כוורת למושבות כפולות עוקבה: הכן תיבה אחת רגילה כוורת שמקבלת שני מסרקי מזון עם דבש, מסרק מזון אחר עם אבקה, ושני מסרקים ריקים. ודא כדי לאתר מלכה הזדווגו כמו גם מושבה תורם עם יותר מ 3,000דבורי קן. שניהם יושקו מאוחר יותר (1.3).
- קבלת וסימון אנשים עם גיל כרונולוגי דומה: לאסוף את המסרקים עם אפרוחים של אטום שעומד לצאת. ללשכפל אחד מצפה לאסוף מסרקים עם סך של 3,000-5,000 תאי קינון כתרים. עבור כל לשכפל להשתמש בכמות מאוזנת של גוזלים מלפחות שלושה מקורות כוורת שונים, כדי למנוע הפצות מוטות של גנוטיפים אימהיים (מקור כוורת).
- הנח סורקה להרהר בחממה מוגדרת 34 ° C עם 60-70% לחות יחסית. הקפד לאחסן את המסרקים בצורה כזאת, כי גוזלים מתעוררים לא יכולים לברוח.
- בואו דבורים לצאת ליומיים ולסמן דבורים אלה עם תג צבע קטן על בית החזה (למשל אוני POSCA, מיצובישי העיפרון ושות בע"מ). סימן הצבע יאפשר זיהוי הדבורים של עוקבה אחת הגיל (יום ההופעה), וכדי להבדיל ביניהם לבין מושבות לשכפל אחרות.
- הקמת מושבה עוקבה כפולה, הכוללת את הקבוצה שליdentified, דבורים יחיד גיל: ביום דבורים צעירים סומנו, אוספים אודות 2,500-3,000 דבורי קן ממושבת תורם (השוו סעיף 1 בדיון.), ולהוסיף דבורים לא מסומנים אלה לתיבת הכוורת שהוכנה לפני (ראה צעד 1.1). אנשים אלה האחרונים יהוו מחזור דבורת קן לא מזוהה.
- הוסף את המלכה, אשר יהיו תחילה מוגבלת לכלוב מלכה (זמין באופן מסחרי). לאטום את הכלוב עם ממתקים אכילים (למשל Apifonda, Südzucker AG, מנהיים / Ochsenfurt, גרמניה) כדי להפוך את הדבורים פועל לשחרר את המלכה באיטיות.
- הוסף את הדבורים יצאו זה עתה ומסומן, אשר יהווה את קבוצת גיל אחת. דבורים אלה הם רק האנשים מסומנים, והם קבוצת המיקוד לכל השלבים הבאים.
- ניטור ליקוט תחילת וסימון מלקטי מזון: על מנת להעריך את ההופעה ואת הדינמיקה של מעבר אחות לבוזז בקבוצת גיל אחת, לפקח על הפיתוח הדמוגרפי של דואר פעילות ליקוטיום אחר לכל מושבה. מתחיל לספור חמישה ימים לאחר המושבות הוקמו (איור 1).
- לספור את המספר הכולל של דבורים חוזרים מליקוט טיסות (ספירות כניסה) בתוך 3 x 20 תקופות תצפית דקות בזמנים קבועים. הקפד לא לספור דבורים בתקופות של טיסות נטייה (ראה דיון).
- כאשר ספירת כניסה מצביעה על פעילות ליקוט ניכרת להתחיל (> 100 ספירת כניסה / יום), מתחיל סימון מלקטי מזון. לשם כך, מלקטי מזון של העוקבה אחת הגיל (יחידים מסומנים יחיד) יקבלו סימן צבע שני כשחזרו מהטיסות הליקוט הראשונות שלהם. סימן צבע זה לציין את יום תחילת ליקוט, ויאפשר מאוחר יותר כדי לזהות את גיל ליקוט מזון עבור כל בוזז.
- חזור על סימוני יום עד מספר מספיק של דבורים כבר מסומן. להערכת מספר מספיק של מלקטי מזון מסומנים, מצפה שיעור אחזור של לא יותר מ 5-10% אחרי הדבורים הללו היו בגילים, בדרך כלל לאחר 14 ימיםחיפוש אחר מזון.
- דגימה: מאז כל הדבורים בתחילה סימנו גיל כרונולוגי דומה, קבוצות לפי גילים של אחיות ומלקטי מזון ישנים יכולות להיות שנאספו בו זמנית, כאשר מלקטי מזון שחפשו מזון ל≥ 14 ימים.
- דבורי אחות בולטים יחיד נאספים בתוך הכוורת, ומזוהים על ידי התנהגות סיעוד (האכלה וניקוי של זחלים עם ראשים הניחו בתאי קינון פתוחים).
- מלקטי מזון מסומנים זוגי גם נאספים בתוך הכוורת לפני הפעילות יומית ליקוט מתחילה.
- איסוף דבורים בכלובים (צינורות, תיבות) המספקים אוורור מספיק, ולשמור את החושך עד עיבוד נוסף. לחלופין, לtranscriptomic, אפיגנטיים או לימודי proteomic, ישירות להצמיד דבורי הקפאה בחנקן נוזלי. לאסוף מספרים מאוזנים של אנשים מכל קבוצות המבחן ולשכפל את המושבות.
2. היפוך של עובדים עם ראפיד לעובדים עם הזדקנות האטה על ידי שינוי דמוגרפיה של הכוורת </ P>
פרטים בסעיף זה כיצד ההיפוך מעובדים עם הזדקנות מואצת (מלקטי מזון) לעובדים עם הזדקנות מואטת (דבורי אחות) מתבצע. היפוך התנהגותיים כגון מושרה, כאשר מלקטי מזון חווים חוסר דבורי אחות, אשר בדרך כלל לעסוק בטיפול להרהר. ההליך חזרה יפריד מושבה אחת לשכפל לשתי כוורות: כוורת אחת עם שבר דבורת אחות ("כנגזרת של אחות"), ועוד אחד עם חלק קטן הבוזז ("כנגזרת של בוזז"). לאחר היפוך מוצלח, סימפטומים אפשריים של פלסטיק והזדקנות הפוכה ניתן ללמוד בקבוצת גיל אחת עם עובדים חזרו, מלקטי מזון ממשיכים, דבורי אחות ממשיכים ומלקטי מזון גויס לאחרונה. כמו בעבר, דבורים מזוהים של העוקבה אחת הגיל, לא הקבוצה של דבורי קן לא מזוהים, מהווים קבוצת המיקוד הניסיונית.
- הכנה: לשכפל כוורות עם אחיות (מסומן יחיד) ומלקטי מזון (כפול מסומן) נעשים זמין כפי שתואר בסעיף הקודם. הקפד לא להתחיל חזרה עם פחות מ 500 מלקטים מזון מסומנים למושבה לשכפל כדי להבטיח שליפה מספיק לאחר חזרה הושלם.
- לזיהוי בטוח של קבוצות מבחן אחרי היפוך זה קריטי, כי כל האוכלוסייה הבוזזת בכוורת המקורית סומנה מעל לפני חזרה. ההליך הבא מתואר ללשכפל אחד.
- היום לפני ההחזרה, להכין תיבה אחת נוספת כוורת לכוורת נגזר הבוזזת (ראה שלב 1.1). אתר שתי מלכות ושני מסרקים להרהר מכוורות תורם. לפני העברה למושבות הניסיוניות לצחצח את כל הדבורים הבוגרים ממסרקים אלה. מלכה אחת בכלוב (ראה שלב 1.3) ומסרק להרהר אחד יחליפו מסרקי מלכה ולהרהר בתיבת הכוורת המקורית. הקבוצה אחרת של מסרק מלכה ולהרהר תשמש למחרת לתיבת הכוורת החדשה. הקצאה דומה של מסרקים חדשים להרהר ומלכות זרות לשניהם, את המקור ואת הכוורת החדשה מומלץ לוודא כי מלקטי מזון ואחות נפרדיםים יהיה שווה ניסיון השתנה רמזי כוורת ("ריח כוורת").
- חזרה: בבוקר, ממש לפני ההחזרה, מוסיף את המלכה בכלוב והמסרק להרהר לתיבה החדשה, שתקבל את החלק יחסי הנגזר בוזז. חכה עד לפעם ליקוט השיא מתחילה. לאחר מכן להעביר את המושבה המקורית עם מלקטים מזון מסומנים ודבורים אחות 100 לפחות מ 'מהמיקום המקורי.
- במיקום המקורי, להגדיר את התיבה החדשה לכוורת נגזר בוזזת עם אפרוחים ומלכה בלבד.
- מלקטי מזון יעזבו את תיבת הכוורת המקורית שיצאה מהמקום, ואת הראש חזרה למיקום המקורי. לאפשר מלקטי מזון כדי לחזור למיקום המקורי עבור שעה 2 על מנת להשיג הבא כדי להשלים את ההפרדה מהאוכלוסייה הבוזזת מדבורי קן.
- ואז, כדי לסיים את ההפרדה, לסגור את המקור, החברה "כנגזרת של אחות" כוורת, ולהעביר אותו למכוורת לפחות 3 ק"מ משם.
- תחזוקת כוורת וניטור למשימה חברתית מוצלחתהיפוך: בדוק את הכוורות הניסיוניות באופן קבוע לגוזלים בריאים, פתוחים.
- בימים הראשונים לאחר מניפולציה המושבה להחליף גוזלים ללא השגחה ומתים כדי להפחית את עומס הפתוגן פוטנציאלי.
- כדי לאמת את ההיפוך מוצלח בתוך הכוורת נגזר בוזזת, לצלם תמונות של מסרקים להרהר לפני החדרת אלה, ושוב כאשר מסרקים מוחלפים או כאשר הניסוי חזרה הושלם (איור 2). אזורים עם אפרוחים של הסירו את המכסה בעבר ועם אפרוחים של פתוחים, חיים הם סמנים אמינים של פעילות סיעוד במושבות שמקורם בוזזת.
- דגימה: תופעות פיזיולוגיות המלוות את ההיפוך חברתי יכולות להיות מזוהות על 3-8 ימים לאחר מלקטי מזון ואחיות הופרדו.
- אנו מייעצים דגימה כל קבוצות הבדיקה, עובדים חזרו כלומר מלקטי מזון וממשיך (כוורת נגזר בוזזת), כמו גם אחיות ממשיכות ומלקטי מזון חדש שגויס (כוורת נגזרת אחות) 8 ימים לאחר ההיפוך הוא יזמה.
- Colדגימות lect כמתואר בשלב 1.5.
3. ניתוח דפוסי הזדקנות תאית ספציפית לעובד מסוג ידי כימות של lipofuscin
Lipofuscin הוא סמן ביולוגי אוניברסלי של הזדקנות תאית. כמוצר הצטברות פנימי, autofluorescence הספציפי של lipofuscin (מקסימום פליטה = 530-650 ננומטר) יכול לשמש לזיהוי 18.
- נתיחה וקיבעון: דבורי צ'יל על קרח עד ללא תנועה, להסיר ולנתח את דגימת הרקמה הרצויה.
- העבר למקבעים (paraformaldehyde 4% בפוספט שנאגרו מלוח, PBS, pH 7.2) לדגירת הלילה ב 4 ° C.
- לשטוף דגימות 3 פעמים ב-PBS.
- עיבוד רקמות והרכבה: חותכים דגימות רקמה למקטעים עם לא יותר מ 40 מיקרומטר עובי, למשל באמצעות microtome רוטט להב, למשל לייקה VT 1000S (לייקה Biosystems, Nussloch, גרמניה).
- הר סעיפים בשקופיות מיקרוסקופיות בגליצרול 50% (PBS). לחותם אחסון לטווח ארוך תלושי לכסות עם לק.
- רכישת תמונה: כדי לזהות lipofuscin, אנו מציעים באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר, המספק קווי לייזר עם λ = 514, 561nm או דומה לעירור, ועם רוחב פס הגלאי מוגדר 570-650 ננומטר.
- לזיהוי טוב יותר של lipofuscin, כולל ערוץ שני, ולעשות סריקה בו זמנית בספקטרום אורך גל קצר יותר (עירור = 405 ננומטר; פליטה = 410-450 ננומטר). הערוץ באורך הגל הארוך יותר יגלה שניהם, lipofuscin הפרטני, אלא גם "רקע" נוקב בשל קנה הנשימה autofluorescent ומבנים שאינם פרטניים אחרים. הערוץ באורך הגל השני, קצר יותר רק יגלה autofluorescence הנוקב, אבל לא lipofuscin. לכן, זיהוי lipofuscin יכול להיות הוא מסייע tated על ידי השוואת האותות בשני הערוצים, ורק אחד מהם חושפים את הגרגרים עם הקרינה ספציפית lipofuscin.
- לרכישת תמונות ברזולוציה גבוהה להשתמש אובייקטיבית עם 40X הגדלה או גבוהה יותר, ועדיף צמצם מספרי של 1.25 או גבוהים יותר. תמונת סריקת ערימות עם ממדים של כ -100 x 100 x 10 מיקרומטר 3. כל דגימה בודדת ורקמות יש להיות מיוצגת על ידי ערימות של תמונות מרובות.
- כדי להפחית וריאציה התוך אישית והבין אישית הנגרמת על ידי וריאציה טכנית, תמיד לשמור על כוח לייזר ומתמיד רגישות גלאי.
- כדי להפחית את ההטיה על ידי יום ליום וריאציות טכניות לסרוק מספרי מדגם שווים של כל הקבוצות במבחן בכל אחד ממספר המפגשים בסריקה.
- עיבוד תמונה: השתמש בחבילות תוכנה עם מודולים המאפשרים עיבוד מתקדם של ערימות תמונה מיקרוסקופיות, למשל ImageJ (מכוני בריאות הלאומיים של ארה"ב, בתסדה, מרילנד, ארה"ב,gej.nih.gov / ij / "= היעד" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
- צור היטל מרבי 2D לכל אחת מערימות תמונת 3D.
- להחיל מסנן גאוס עם גודל ליבה צנוע כדי להחליש רעש בתדר גבוה, וכדי לשמר את המבנים עם ממדים של גרגרי lipofuscin.
- מיזוג שני ערוצי הצבע כדי להקל על זיהוי של lipofuscin (ראה שלב 3.2).
- תמונת מנתח: ודא כי הנושא ביצוע צעדי הכימות יהיה עיוור כדי לבדוק את זהות קבוצה.
- לכל התמונות, לבחור ראשון באזור של עניין (ROI) המכסה את המבנים הרלוונטיים, ויש לו ממדים דומים כמו ROIs מתמונות אחרות.
- לאחר מכן, בחר את המספר הרצוי של גרגירי lipofuscin המייצגים את כל החזר על השקעה. בעת בחירת גרגרי lipofuscin בתוך החזר על השקעה, היישום של הכללים הבאים יפחית הטיה הסובייקטיבית.
- בחר מיקום עקבי לבחירת granu הראשונהle. זה יכול להיות, למשל, בקצה השמאלי ביותר של החזר על השקעה, והגרגר שהוא הקרוב ביותר לקצה תמיד יהיה הבחירה הראשונה.
- אחד אחרי השני, גרגרים נבחרים, כי הם הקרובים ביותר לבחירה הקודמת (השכן).
- כאשר בוחר את השכן, לנוע רק בכיוון אחד, למשל חיפוש נכון רק מהבחירה הקודמת. כלל זה מונע כי הבחירה נשלט על ידי מדי פעם אשכולות של גרגירים צפופים.
- כאשר הבחירה הושלמה, להעריך את גודלו של כל חלקיק lipofuscin ידי חלוקה לרמות ומדידת שטח הגרגר המתאים. השתמש בבדיקות סטטיסטיות מתאימות כדי להשוות אנשים מקבוצות הבדיקה השונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיפי 1 ו -2 לפרוטוקול פירוט כיצד ניתן להשיג קבוצות מבחן ללמוד תכונות של מואץ, האטו והתהפכו הזדקנות במושבות עם קבוצת גיל אחת. כדי לפקח על בידול עובד מהסוג שמלווה את ontogeny הנורמלי שאנחנו הערכנו ספירות בוזזות ("ספירת כניסה") במשך 6 מושבות (איור 1, השווה סעיף 1). הגרפים מראים כי השינוי ניכר מאחות למדינה הבוזזת הוא בדרך כלל לא נצפה לפני אנשים הם בנים יותר מ 10 ימים. השתנות מסומנות בספירת בוזזת נצפו בכל הקשור לעיתוי של חיפוש אחר מזון התפרצות בין מושבות שונות, וכוריאציה היום יום מסומנת בתוך כל מושבה. מלבד גורמי מושבה ספציפיים דמוגרפיים, כגון עומס להרהר שונה, הרבה שונות מוסברת על ידי שינוי תנאי מזג אוויר (נקודות זמן מסומנות באדום באיור 1). ניטור הדוק של דינמיקת ליקוט מזון ולכן מומלץ כדי לייעל את המאמצים לציון וגביית during הניסוי.
Ontogeny ההפוך (הסעיף 2) מהליקוט חזרה למשימות סיעוד יכול להיות מאומת על ידי בדיקה סורקה להרהר שהם הציגו למושבות נגזרים הבוזזות (ראה צעדים 2.2 ו2.3). ל2A שלוש דמויות משכפל, מסרק להרהר מופע C, ו-E, לפני כניסתה למושבות נגזרים בוזזות. איורים 2B, D, ו-F להראות מסרקי בהתאמה לאחר ההסרה. טלאים של גוזלים כתרים חדשים, זחלים בריאים, אחסון אבקה מוגבר סביב תאי קינון עולה כי מלקטי מזון לשעבר החברה ביצעו בהצלחה קן טיפוסי, כולל משימות סיעוד.
Lipofuscin (סעיף 3) הוא סימפטום שמור ביותר של הזדקנות תאית, וניתן להעריך בקלות לניתוחים שלאחר ניסוי ברקמות הדבורים השונות. איור 3 בניגוד הצטברות lipofuscin, שנמדדה כגודל גרגר (איור 3E), בבלוטות hypopharyngeal של אחות באותו גילדבורים בוזזים nd. ההבדל בגיל כרונולוגי בין שני צעיר ושתי הקבוצות הישנות היה ≥ 17 ימים, עם קבוצה אחת בלבד (מלקטי מזון) מבלה ≥ 17 בימים אלה עם פעילויות טיסה ואיסוף מזון בחוץ. הצגת תמונות מיקרוסקופיות נציג (איורים 3A-D) עלתה הצטברות lipofuscin רק לקבוצה של מלקטי מזון מבוגרים לאחר יותר מ17 ימים של חיפוש אחר מזון (איור 3D), ולא לדבורי אחות מבוגרים של גיל כרונולוגי דומה (37-43 ימים; איור 3 ב) . ANOVA שתי עצרת עם העובד מסוג הגורמים העיקריים הקבוע (מלקטי מזון, אחיות) ופער גילים (Δage ≥ 17 ימים) חשף לוואי משמעותי לעובד מסוג, פער גילים ואת האינטראקציה בין שני הגורמים (סוג F = 33.67, P <0.001; F Δage = 21.93, P <0.001; סוג F x = Δage 22.07, P <0.001). עם זאת, בדיקות post hoc-הראו השפעות משמעותיות היחידהכאשר מנוגד מלקטי מזון מבוגרים (≥ 17 ימים של חיפוש אחר מזון) למלקטי מזון צעירים, או לשניהם אחות הקבוצות (PF 17d לעומת F 1d/N1d/N17d <0.001, LSD של פישר; איור 3E). לא נמצא הבדל בבין שלוש הקבוצות האחרונות, כוללים קבוצות כרונולוגית צעירות ומבוגרות אחות (את כל בדיקות עם P> 0.5, LSD של פישר; איור 3E). הדבר מצביע על כך הצטברות lipofuscin תלויה בפעילות בוזזת ספציפית (ליקוט גיל), במקום להיות פונקציה של גיל כרונולוגי בלבד כשלעצמה.
איור 1. בידול עובד מהסוג במהלך ontogeny הנורמלי. ספירת הכניסה מציג גרף של מלקטי מזון שחוזרים מהטיסות ליקוט נספרו ל6 מושבות שונות החל 5 ימים לאחר שהוקמו (לפרטים השווה סעיף פרוטוקול 1.4). מעבר משמעותי מnest לליקוט פעילויות נצפה לראשונה כאשר אנשים מסומנים של קבוצת גיל אחת היו כבן 10 ימים. מדרונות שונים לספירת הכניסה מצטברת מצביעים על כך שהדינמיקה של דבורת האחות למעבר בוזז שונה בין מושבות, ומושפעות מגורמים אקלימיים. לדוגמא, בימי גשם ופחות משעתיים של חיפוש אחר מזון, העלייה בספירת כניסה בדרך כלל כובה (נקודות נתונים באדום).
איור 2. האימות חזרה התנהגותיות. כדי לבדוק אם מלקטי מזון שחזרו בהצלחה למשימות סיעוד, השווינו מסרק להרהר לפני שהם הוכנסו לתוך כוורות הנגזרים בוזזות, ולאחר שהוצאו מכוורות אלה. נציג תמונות להראות מסרקות להרהר לפני כניסתה (A, C, E) ולאחר ההסרה (B, D, F) משלוש כוורות הנגזרים בוזזות שונות, בהתאמה. טיפול Brood על ידי דבורים בוזזים קודמים הוא הצביע על ידי מספר גדל והולך של תאים עם אפרוחים של כתרים (B, D, F, חץ שחור, משובצים בד '), ספג הישרדות של זחלים בתאים פתוחים (חץ אדום) ואחסון מוגבר של אבקה קרובה ל תאי קינון (חץ לבן). שים לב שנגזר בוזזת-מושבות בתחילה הן בדרך כלל פחות יעילים בטיפול להרהר יותר ממושבות שמקורם באחות. זה יכול להוביל לתמותת זחל גבוהה בבוזזת נגזרות-מושבות. תמונות בB, D, F נלקחו 5, 4 ו -7 ימים לאחר מסרק להרהר הוכנסו מושבות נגזרים בוזזות.
איור 3. הצטברות של lipofuscin, סמן ביולוגי של תאהזדקנות תואר בלבד, יכולה להצביע על הידרדרות רקמה ספציפית עובד מהסוג. נציג תמונות מיקרוסקופיות של בלוטות hypopharyngeal בצעירים () ודבורים ישנים אחות (ב '), כמו גם בדבורים בוזזים גיל בהתאמה עם ≥ יום 1 (ג), בהתאמה ≥ ניסיון 17 ימי ליקוט (סרגל קנה מידה ב= 20 מיקרומטר). הצטברות lipofuscin נמדדה כגודל גרגיר, והוא ניתן כחציונים ורבעונים עבור N = 5 אנשים לכל גיל ועובדת מסוג (E). חיפוש אחר 17 ימים הביאו להצטברות lipofuscin משמעותית, ואילו באותה תקופה לא הביאה לשינויי lipofuscin בדבורי אחות (לסטטיסטיקה לראות תוצאות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו כאן לאמץ בעבר תאר גישות 8,16,17,19,20, ולשלב אותם לתוך זרימת עבודה אחת שתאפשר לימוד הזדקנות גמישה בדבורי דבש. המטרה שלנו היא לספק למדענים כי הם טירון בתחום זה עם כלי סטנדרטי מוגדר להשיג חומר מדגם רלוונטי, וכדי לשפר את שחזור ניסיוני בקרב צוותי מחקר שונים. בעוד שהנהלים שלנו הם פשוטים ואינו דורשים ציוד מיוחד כמו בתיאורים קודמים (השווה לדוגמא 8), כמה אמצעי זהירות מומלץ ונאספים בהמשך.
Decoupling הזדקנות מגיל כרונולוגי. היבט הקריטי ביותר הוא להימנע מזיהוי שווא של דבורים בוזזים באישור ראשוני של התנהגויות חיפוש מזון (2 nd לציון). לכן, כאשר מלקטי מזון הם להיות במעקב ("ספירת כניסה") או מסומן, אין להימנע לחלוטין תקופות יומיומיות עם טיסות אורינטציה. בתקופות אלה רבות מראש פורומיםדבורי שלב גינג תצאנה מאו להיכנס לכוורת. הדבורים האלה לא להציג מאפיינים פיסיולוגיים אופייניים למלקטי מזון בוגרים, אבל לבנות את המפה המרחבית של סביבת הכוורת על ידי דפוסי טיסה מעגליים לזיהוי בקלות 21.
בעוד שרוב הדבורים לשנות לליקוט עם גיל 2 שבועות ומעלה, ליקוט סדיר הוא ציין כבר בגילים צעירים מאוד (איור 1). מלקטי מזון מאוד מוקדמים בדרך כלל לפתח מדבורי קן חסרי ניסיון ישירות מבלי שעבר את שלב האחות. שלא לכלול אנשים עם ontogeny חריג כזה (השווה 22 והפניות בו), אנשים שמתחילים ליקוט עם גיל 10 ימים או פחות אינם נחשבים לניתוחים נוספים.
כדי להימנע מייצוג יתר של מלקטי מזון מוקדמים עוד יותר, אנחנו לא עושים שימוש "מושבות אחת עוקבה" קלאסיות שמורכבות רק מקבוצת גיל אחת 17,23. במקום זאת, בעת הגדרהמושבות דבורים אנו מוסיפים קן אקראי ("עוקבה דבורת קן") לקבוצת גיל אחת המסומן (ראו צעדים 1.1 ו1.3). מאז דבורי קן אקראיים הם בדרך כלל מבוגרים יותר, הם יכולים להפחית את הלחץ על דבורים צעירים מאוד להתפתח למלקטי מזון מאוד מפותחים לגיל 17. מושבות עוקבה כפולות כזה, אם כן, עשויות טוב יותר דומה לדמוגרפיה כוורת טבעית עם אנשים שיתקדמו לאט מהנקה לחיפוש אחר מזון.
כאשר התאמות ספציפיות עובד לטווח ארוך הן כדי להיחקר, לאסוף את כל קבוצות הבדיקה מחוץ ליקוט שעות. זה מומלץ כדי להפחית את ההטיה על ידי התאמות מטבולים חריפות יותר בשל פעילות של תנועה האחרונה, למשל מיצוי טיסה.
היפוכם של עובדים עם מהיר להאטת הזדקנות על ידי שינוי הדמוגרפיה של הכוורת. שלאחר מלקטי מזון הוטסו בחזרה למיקום המקורי זה הכרחי כדי להתרחק הכוורת נגזרת אחות (> 3 קילומטר). זאת, כדי למנוע שדבורי שלב הטרום ליקוט מגויסים ומודרךמיקום ישן על ידי דבורים אחרים, בהתאמה באמצעות תקשורת פרומו 24.
כדי למנוע עוד כל אחות או אנשים מראש ליקוט מזון אחרים מלהיכנס לכוורת נגזר הבוזזת, אנו ממליצים לשמור על הכללים הבאים: (I) לסיים את הליך הפרידה לפני טיסה נטייה יומית להתחיל. (II) תנסה רק היפוך בימים שבם פעילות ליקוט חזקה הוא ציין. (III) במהלך ולאחר טרנסלוקציה הראשונית של הכוורת המקורית, למנוע תסיסה מיותרת של דבורים, בפרט לא לפתוח את הכוורת.
באופן עקרוני, הגדרות מלאכותיות יותר, כי להגביל מלקטי מזון בסביבה מקופחת אחות גם עלולות להוביל להחזרה. עם זאת, הגדרות כאלה רק הגבילו את ערך אינפורמטיבי כחוויות שבריר נגזר הבוזזות סביבות מלחיצים אחרות, ובכך נמנע אפשרות השוואה ישירה עם קבוצות ביקורת ממושבות שמקורם באחות.
המאשר דפוסי הזדקנות שוניםעל ידי כימות של lipofuscin, סמן ביולוגי של הזדקנות תאית. כאן אנו הודגמנו הערכת lipofuscin עם תמונות ונתונים סטטיסטיים של בלוטות hypopharyngeal בגלל lipofuscin הוא ביותר לזיהוי בקלות ברקמה זו. זו, לדעתנו, היא חשובה כדי לעזור לצופה חסרת ניסיון הגדרת הפרוטוקולים הנכונים לזיהוי מיקרוסקופי. עם זאת, בניגוד לרקמות אחרות, בלוטות hypopharyngeal אל יציגו אפופטוזיס ונימק משמעותיים במהלך אחות בוזזת מעבר 25. תהליכים כאלה עלולים ליצור אינטראקציה עם הצטברות של סמן ההזדקנות, למרות שאנחנו לא לזהות רמות מוגברות של lipofuscin במלקטי מזון צעיר שלאחרונה השתנו ממשימות סיעוד (3C דמויות, E). עם זאת, כדי להעריך את צעדי הזדקנות ברקמות דבורים אחרים, המבוסס על שיטות מיקרוסקופיה המתוארות כאן ניתן להתאים בקלות.
לחלופין, גישות זרימת cytometric הן פחות זמן רב 26. ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיהיש את היתרון שתסמיני הזדקנות סלולארי ניתן להעריך לאזורים שונים או אפילו לתאים בתוך איברים בודדים 27. ללימודים במוח ובאיברים מורכבים אחרים עם ההטרוגניות המרחבית בהזדקנות תאי 28, ולכן אנו ממליצים על הגישה מיקרוסקופית מבוסס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים אוסמן Kaftanoglu לעצות מועילות וסיוע בזמן צילומים. ברצוננו להודות למבקרים האנונימיים על הערות תובנה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר של נורבגיה (מעניק 180,504, 191,699, ו213,976), מארי Curie/FP7 (נ"צ פרויקט. 238,665), המכון הלאומי ל( AG22500 P01 NIA מענק) הזדקנות, ונאמנויות הצדקה Pew.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apifonda | Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany | ||
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Glycerol | Merck | 1.04094.1000 |
References
- Munch, D., Amdam, G. V. The curious case of aging plasticity in honey bees. FEBS Lett. 584, 2496-2503 (2010).
- Buffenstein, R. Negligible senescence in the longest living rodent, the naked mole-rat: insights from a successfully aging species. J Comp Physiol B. 178, 439-445 (2008).
- Parker, J. D. What are social insects telling us about aging? Myrmecological News. 13, 103-110 (2010).
- Seeley, T. D. The Wisdom of the Hive. , Harvard University Press. (1995).
- Amdam, G. V., Omholt, S. W. The regulatory anatomy of honeybee lifespan. J Theor Biol. 216, 209-228 (2002).
- Amdam, G. V., Norberg, K., Hagen, A., Omholt, S. W.
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
- Amdam, G. V., et al. Social reversal of immunosenescence in honey bee workers. Exp Gerontol. 40, 939-947 (2005).
- Seehuus, S. C., Norberg, K., Gimsa, U., Krekling, T., Amdam, G. V. Reproductive protein protects functionally sterile honey bee workers from oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 962-967 (2006).
- Scheiner, R., Amdam, G. V. Impaired tactile learning is related to social role in honeybees. J Exp Biol. 212, 994-1002 (2009).
- Behrends, A., Scheiner, R., Baker, N., Amdam, G. V. Cognitive aging is linked to social role in honey bees (Apis mellifera. Exp Gerontol. 42, 1146-1153 (2007).
- Münch, D., Baker, N., Kreibich, C. D., Braten, A. T., Amdam, G. V. In the laboratory and during free-flight: old honey bees reveal learning and extinction deficits that mirror mammalian functional decline. PLoS One. 5, e13504 (2010).
- Vance, J. T., Williams, J. B., Elekonich, M. M., Roberts, S. P. The effects of age and behavioral development on honey bee (Apis mellifera) flight performance. J Exp Biol. 212, 2604-2611 (2009).
- Dukas, R. Mortality rates of honey bees in the wild. Insect Soc. 55, (2008).
- Behrends, A., Scheiner, R. Learning at old age: a study on winter bees. Front Behav Neurosci. 4, 15 (2010).
- Huang, Z. -Y., Robinson, G. E. Honeybee colony integration: Worker-worker interactions mediate hormonally regulated plasticity in division of labor. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 11726-11729 (1992).
- Huang, Z. Y., Robinson, G. E. Regulation of honey bee division of labor by colony age demography. Behavioral Ecology and Sociobiology. 39, 147-158 (1996).
- Double, K. L., et al. The comparative biology of neuromelanin and lipofuscin in the human brain. Cell Mol Life Sci. 65, 1669-1682 (2008).
- Fonseca, D. B., Brancato, C. L., Prior, A. E., Shelton, P. M., Sheehy, M. R. Death rates reflect accumulating brain damage in arthropods. Proc Biol Sci. 272, 1941-1947 (2005).
- Baker, N., Wolschin, F., Amdam, G. V. Age-related learning deficits can be reversible in honeybees Apis mellifera. Exp Gerontol. 47, 764-772 (2012).
- Capaldi, E. A., et al. Ontogeny of orientation flight in the honeybee revealed by harmonic radar. Nature. 403, 537-540 (2000).
- Marco Antonio, D. S., Guidugli-Lazzarini, K. R., do Nascimento, A. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. RNAi-mediated silencing of vitellogenin gene function turns honeybee (Apis mellifera) workers into extremely precocious foragers. Naturwissenschaften. 95, 953-961 (2008).
- Whitfield, C. W., Cziko, A. -M., Robinson, G. E. Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees. Science. 302, 296-299 (2003).
- Schmidt, J. O. Attraction of reproductive honey bee swarms to artificial nests by Nasonov pheromone. Journal of Chemical Ecology. 20, 1053-1056 (1994).
- De Moraes, R., Bowen, I. D. Modes of cell death in the hypopharyngeal gland of the honey bee (Apis mellifera L). Cell Biol Internat. 24, 737-743 (2000).
- Sheehy, M. R. A flow-cytometric method for quantification of neurolipofuscin and comparison with existing histological and biochemical approaches. Arch Gerontol Geriatr. 34, 233-248 (2002).
- Hsieh, Y. S., Hsu, C. Y. Honeybee trophocytes and fat cells as target cells for cellular senescence studies. Exp Gerontol. 46, 233-240 (2011).
- Wolschin, F., Munch, D., Amdam, G. V. Structural and proteomic analyses reveal regional brain differences during honeybee aging. J Exp Biol. 212, 4027-4032 (2009).
