Innhenting Prøver med Bremset, Accelerated og Reversed Aldring i Honey Bee Model

Summary

I honningbie arbeidere, aldring avhenger av sosial atferd snarere enn på kronologisk alder. Her viser vi hvordan arbeidstaker-typer med svært ulike aldring mønstre kan bli innhentet og analysert for mobilnettet senescence.

Abstract

Societies av svært sosiale dyr har store levetids forskjeller mellom nært beslektede individer. Blant sosiale insekter, er honningbie best etablert modell for å studere hvordan plastisitet i levetid og aldring forklares med sosiale faktorer.

Arbeideren kaste av honningbier omfatter sykepleier bier, som pleier på avkommene, og nitter, bier, som samler nektar og pollen. Tidligere arbeid har vist at hjernens funksjoner og ytelse senesce raskere i nitter enn i sykepleiere. Imidlertid kan hjernefunksjoner gjenopprette, når fins gå tilbake til sykepleieroppgaver. Slike mønstre av akselerert og reversert funksjonell senescence er knyttet til endrede metabolske ressursnivå, til endringer i protein overflod og immunforsvar. Vitellogenin, en eggeplomme protein med tilrettelagte funksjoner i hormonell kontroll og cellulær forsvar, kan tjene som en viktig regulatorisk element i et nettverk som styrer de ulike aldring dynamikk i arbeiderne.

Her beskriver vi hvordan fremveksten av sykepleiere og fôrhøstere kan overvåkes, og manipulert, herunder reversering fra typisk kortlivede nitter til lengre levetid sykepleiere. Våre representative resultatene viser hvordan personer med lignende kronologisk alder differensiere i nitter og sykepleier bier under eksperimentelle forhold. Vi eksemplifisere hvordan atferds reversering fra fins tilbake til sykepleiere kan valideres. Sist, viser vi hvordan ulike cellealdring kan vurderes ved å måle akkumulering av lipofuscin, en universell biomarkør av senescence.

For å studere mekanismer som kan lenke sosiale påvirkninger og aldring plastisitet, gir denne protokollen et standardisert verktøy satt til å tilegne seg relevant prøvemateriale, og for å forbedre data sammenlignbarhet blant fremtidige studier.

Introduction

Komplekset koloni strukturer av svært sosiale dyr opprettholdes gjennom et samspill av en reproduktiv kaste, og en hjelper kaste av typisk ikke-reproduserende arbeidstakere med ulike samfunnsoppdrag atferd. I de ulike arbeidstakere, bestemte fysiologiske tilpasninger aktivere forskjellige sib omsorg atferd, og er også knyttet til ekstreme levetids forskjeller. Honningbier og muldvarp rotter representerer de best utviklede dyremodeller for å studere hvordan sosialitet er knyttet til mønstre av akselerert, ubetydelig eller reversert aldrings ^1-3.

I honningbie kolonier, er et enkelt egg-legging dronning assistert av tusenvis av arbeidere som har en tendens stamfisk, grovfôr for mat, og engasjere seg i vakt, termoregulering eller hygieniske atferd ^fire. Blant disse arbeiderne er ekstremt kortvarig fôrhøstere, sykepleier bier med middels og vinter (diutinus) bier med lengste lifespans. Individer imidlertid ikke er fast bundet til en viss worker-type, men vise et fleksibelt atferds ontogenetiske: de skifter fra en sosial oppgave atferd til en annen ("time kastene"). Callow bier kan endre til stamfisk tending sykepleier bier, som til slutt kan endre seg til utenfor beite. Imidlertid kan callow reir bier også forvandle seg lengst levetid vinter bier, og kortlivede nitter kan selv gå tilbake til normalt lengre levetid sykepleiere. Arbeidere med ekstrem (vinter bier) og middels (sykepleier bier) levetid har velutviklede matproduksjon og lagrings organer med store ressurser - i motsetning til kortlivede nitter (anmeldt i ^1,5). Imidlertid, at reguleringen av individuelle levetid går utover enkle endringer i et individs ressursBalansen antydet ved forskning på en plommeprotein, som har ulike tilpassede funksjoner i den ikke-reproduserende arbeideren kasten, slik som gele produksjon ^6, hormonell kontroll ^7, immun ⁸ og anti-oksydant i feltet ^9..

Mønstre av functional nedgang (senescence) speil livsløp forskjeller mellom arbeidstakere, som ble etablert for lukte, og også for andre hjerne eller motoriske funksjoner ^10-13. Nærmere bestemt, den betydelige nedgangen i lærefunksjon etter bare to uker med foraging samsvarer med en tilsvarende dødelighet progresjon i fôrhøstere ^14, i motsetning til den manglende påviselig nedgang (ubetydelig senescence) i langlivede vinter bier ^15.

For å identifisere de molekylære fingeravtrykk av fleksible aldring vi tilpasset etablerte eksperimentelle paradigmer som gir mulighet for å overvåke og manipulere aldring-type overganger ^8,16,17. Eksperimentere en informasjon om hvordan å få tak i prøver der virkningene av kronologisk alder og arbeidstaker-type spesifikke sosiale atferd på aldring kan separeres. Eksperiment 2 beskriver reversering av nitter med akselerert inn sykepleier bier med bremset aldrings dynamikk. Eksperiment 3 gir en tilnærming for sondering effekten av cellealdring ved Anatomical kvantifisering av en etablert biomarkør for cellulær aldring (lipofuscin) ^18.

Protocol

En. Decoupling Senescence fra kronologisk alder

Denne delen beskriver oppsettet av doble kohort kolonier, som består av en kohort av identifiserte individer som deler samme kronologiske alder ("single årskullet") og en kohort av reir bier. Samme alderen individer av singelen årskullet vil til slutt dele opp i forskjellige arbeider-typer med ulike aldring dynamikk - disse er sykepleier bier med bremset og nitter, bier med akselerert funksjonelle nedgang. Alle fremgangsmåter er beskrevet for en eksperimentell koloni. Vi anbefaler imidlertid å utføre eksperimenter i minst to koloni replikater slik at koloni effekter kan kontrolleres for (to replikat-design).

1. Forbereder hive boksene for de doble kohort kolonier: Forbered en vanlig hive boksen som mottar to mat kammer med honning, en annen mat kam med pollen, og to tomme kammer. Sørg for å finne en parret dronning samt en donor koloni med mer enn 3000reir bier. Begge vil bli introdusert senere (1,3).
2. Innhenting og merking personer med samme kronologiske alder: Samle kammer med forseglet stamfisk som er i ferd med å dukke opp. For ett replikat forvente å samle kammer med totalt 3.000-5.000 avkortet stamfisk celler. For hver replikere bruke en balansert mengde av stamfisk fra minst tre forskjellige hive kilder for å unngå skjeve fordelinger av mors genotyper (hive opprinnelse).
   1. Plasser rogn kammer i en inkubator innstilt på 34 ° C med 60 til 70% relativ fuktighet. Sørg for å lagre kammer på en slik måte at nye stamfisk ikke kan unnslippe.
   2. La bier dukke opp i to dager og markere disse biene med en liten lakk-koden på thorax (f.eks Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co Ltd). Malingen mark vil tillate identifisere biene av singelen årskullet (dag veksten), og for å skille dem fra andre replikere kolonier.
3. Sette opp en dobbel kohort koloni, som inkluderer kohort av jegdentified, enslige alders bier: På dagen unge bier er merket, samle ca 2,500-3,000 reir bier fra en donor koloni (sammenlign seksjon 1 i diskusjon.), og legge disse umerkede bier til strukturen boksen som ble utarbeidet før (se trinn 1.1). De sistnevnte individer vil utgjøre den uidentifiserte reir bee kohort.
   1. Legg dronningen, som vil være utgangspunktet begrenset til en dronning bur (kommersielt tilgjengelig). Tett bur med spiselig godteri (f.eks Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Tyskland) for å gjøre arbeideren bier sakte slipper dronningen.
   2. Legg det nylig oppståtte og merket bier, som vil utgjøre den eneste årskullet. Disse biene er de eneste merkede individer, og er fokus gruppe for alle de følgende trinn.
4. Overvåking beite utbruddet og merking nitter: Å vurdere utbruddet og dynamikken i sykepleier-til-forager overgang i én årskullet, overvåke den demografiske utviklingen av foraging aktivitet eveldig annen dag for hver koloni. Begynn å telle fem dager etter kolonier ble satt opp (fig. 1).
   1. Telle det totale antall bier tilbake fra beite fly (inngang teller) innen 3 x 20 min observasjonsperioder til faste tider. Sørg for å ikke telle bier i perioder med orienterings fly (se diskusjon).
   2. Når inngangs tellinger indikerer betydelig foraging aktivitet for å starte (> 100 inngangs teller / dag), begynner merkenitter. For å gjøre dette, nitter av singelen årskullet (enkelt merkede individer) mottar et nytt maling mark ved retur fra sine første beite flyreiser. Denne malingen mark vil spesifisere den dagen beite utbruddet, og vil tillate å senere identifisere foraging alder for hver forager.
   3. Gjenta daglige markeringer før et tilstrekkelig antall bier har vært merket. For å estimere et tilstrekkelig antall merkede nitter, forventer et hentefrekvens på ikke mer enn 5-10% etter disse biene hadde vært alderen, vanligvis etter 14 dagerbeite.
5. Prøvetaking: Siden alle i utgangspunktet merket bier har en lignende kronologisk alder, kan alder-matchet grupper av sykepleiere og gamle nitter samles samtidig, når nitter har foraged i ≥ 14 dager.
   1. Enkelt merkede sykepleier bier er samlet innenfor strukturen, og er identifisert av sykepleie atferd (fôring og rengjøring av larver med hoder satt ned i åpne stamfisk celler).
   2. Doble merket nitter er også hentet innen strukturen før daglig foraging aktiviteten begynner.
   3. Samle bier i bur (rør, bokser) som gir tilstrekkelig ventilasjon, og holder mørke før videre behandling. Alternativt, for transcriptomic, epigenetisk eller proteomikk studier, direkte knipse fryse bier i flytende nitrogen. Samle balanserte antall individer fra alle testgrupper og replikere kolonier.

2. Tilbakeføring av arbeidstakere med Rapid å Arbeidere med Redusert aldring ved å endre Hive er Demografi </ P>

Denne delen beskriver hvordan reversering fra arbeidere med akselerert aldring (nitter) til arbeidstakere med bremset aldring (sykepleier bier) er utført. Slike atferds reversering er indusert, når fins oppleve en mangel på sykepleier bier, som normalt deltar i stamfisk omsorg. Den reversion prosedyren vil separere en enkelt koloni replikere i to hives: en bikube med sykepleier bie fraksjon ("sykepleier-avledet"), og en annen med den forager fraksjon ("forager-avledet"). Etter vellykket tilbakeføring, mulige symptomer på plast og reversert aldring kan studeres i enkelt årskullet med hjemfalte arbeidstakere, fortsetter fôrhøstere, fortsetter sykepleier bier og nyrekruttnitter. Som før, identifiserte bier av singelen årskullet, ikke kohort av uidentifiserte reir bier, utgjør den eksperimentelle fokusgruppe.

1. Forberedelse: Repliker elveblest med sykepleiere (singel merket) og fôrhøstere (dobbel merket) blir gjort tilgjengelig som beskrevet i forrige avsnitt. Sørg for å ikke begynne hjemfall med mindre enn 500 merkede nitter per replikere koloni for å sikre tilstrekkelig henting etter at hjemfall er fullført.
   1. For sikker identifisering av testgruppene etter reversering er det avgjørende at hele forager befolkningen i den opprinnelige strukturen har vært preget av før hjemfall. Denne fremgangsmåten er beskrevet for en replikat.
   2. Dagen før hjemfall, forberede en ekstra hive boksen for forager-avledet bikube (se trinn 1.1). Finn to dronninger og to stamfisk kammer fra donor elveblest. Før overføring til de eksperimentelle kolonier børste bort alle voksne bier fra disse kammer. Ett bur dronning (se trinn 1.3) og en stamfisk kam vil erstatte dronning og stamfisk kammer i den opprinnelige strukturen boksen. Det andre settet med dronning og stamfisk kam vil bli brukt neste dag for den nye strukturen boksen. Lignende tildeling av nye stamfisk kammer og fremmede dronninger for både den opprinnelige og den nye strukturen er bedt om å sørge for at skilt nitter og sykepleiers vil like opplevelsen endret hive signaler ("hive smell").
2. Hjemfall: I morgen, like før hjemfall, tilsett bur dronningen og stamfisk kam til den nye boksen som skal motta forager-avledet brøkdel. Vent til peak foraging tid begynner. Deretter flytter den opprinnelige kolonien med merkede nitter og sykepleier bier minst 100 m unna fra den opprinnelige plasseringen.
   1. På den opprinnelige plasseringen, satt opp den nye boksen for forager-avledet bikube med stamfisk og dronningen bare.
   2. Nitter vil forlate forstuet opprinnelige hive boksen, og dra tilbake til den opprinnelige plasseringen. Tillat fins å gå tilbake til den opprinnelige plasseringen for to timer for å oppnå neste å fullstendig skille mellom forager befolkningen fra reir bier.
   3. Så, for å avslutte separasjon, stenge av den opprinnelige, nå "sykepleier-avledet" bikube, og overføre den til en bigård minst 3 km unna.
3. Hive vedlikehold og overvåking for vellykket sosial oppgavereversering: Sjekk de eksperimentelle elveblest regelmessig for sunn, åpen stamfisk.
   1. I løpet av de første dagene etter koloni manipulasjon erstatte uten tilsyn og død stamfisk for å redusere potensiell patogen belastning.
   2. For å validere vellykket tilbakeføring innenfor forager-avledet bikube, ta bilder av stamfisk kammer før innføring disse, og igjen når kammer erstattes eller når hjemfalls eksperimentet er fullført (figur 2). Områder med tidligere Uncapped gruble og med åpent, levende stamfisk er pålitelige markører for sykepleie aktivitet i nitter-avledet kolonier.
4. Prøvetaking: Fysiologiske effekter som følger sosiale reversering kan oppdages 3-8 dager etter nitter og sykepleiere ble separert.
   1. Vi anbefaler prøvetaking alle testgruppene, dvs. hjemfalte arbeidere og viderenitter (forager-avledet bikube), samt videre sykepleiere og nylig rekruttert nitter (sykepleier-avledet hive) 8 dager etter reversering er initiert.
   2. ColLect prøver som er beskrevet i trinn 1.5.

Tre. Analysere Worker-type spesifikke Cellular senescence Patterns av Kvantifisering av lipofuscin

Lipofuscin er en universell biomarkør av mobilnettet senescence. Som en iboende opphopning produkt, kan lipofuscin spesifikke autofluorescens (emisjon _maks = 530 til 650 nm) benyttes for deteksjon ^18.

1. Disseksjon og fiksering: Chill bier på is inntil urørlig, fjerne og dissekere ut ønsket vevsprøve.
   1. Overfør til fikser (4% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann, PBS, pH 7,2) for inkubering over natten ved 4 ° C.
   2. Vask prøvene 3 ganger i PBS.
2. Tissue bearbeiding og montering: Skjær vevsprøver i seksjoner med ikke mer enn 40 mikrometer tykkelse, for eksempel ved å bruke en vibrerende blad mikrotom, f.eks Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Tyskland).
   1. Monter seksjoner på mikroskopiske lysbilder i 50% glyserol (PBS). For langtidslagring tetningshus slips med neglelakk.
3. Bilde oppkjøpet: Å oppdage lipofuscin, foreslår vi at du bruker en laserskanning confocal mikroskop som gir laserlinjer med λ = 514, 561nm eller lignende for eksitasjon, og med detektoren båndbredde satt til 570-650 nm.
   1. For bedre identifisering av lipofuscin, inkluderer en andre kanal, og gjør en samtidig scan på kortere bølgelengde spektra (eksitasjon = 405 nm, utslipp = 410-450 nm). Den lengre bølgelengde kanalen vil avdekke begge, granulær lipofuscin, men også uspesifikk "bakgrunn" som følge av autofluorescent trachea og andre ikke-granulære strukturer. Den andre, kortere bølgelengde kanal vil kun avsløre uspesifikk autofluorescence, men ikke lipofuscin. Dermed kan lipofuscin identifikasjon være facili tated ved å sammenligne signalene i begge kanaler, og bare en av dem avslørende granulene med lipofuscin spesifikk fluorescens.
   2. For erverv av høyoppløselige bilder bruker en objektiv med 40x forstørrelse eller høyere, og helst en numerisk apertur på 1,25 eller høyere. Scan bildet stabler med dimensjoner på ca 100 x 100 x 10 mm ^3. Hvert individ og vevsprøve må være representert med flere bilde stabler.
   3. For å redusere intra-individuelle og interindividuell variasjon forårsaket av teknisk variasjon, alltid holde laser makt og detektor følsomhet konstant.
   4. For å redusere skjevhet ved dag-til dag tekniske variasjoner skanne like prøvenummer av alle testgrupper i hver av de flere skanning økter.
4. Bildebehandling: Bruk programvarepakker med moduler som gir mulighet for avansert behandling av mikroskopiske bildestakker, for eksempel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generere en 2D maksimal projeksjon for hver av de 3D bildestakker.
   2. Påfør en Gauss filter med en beskjeden kjerne størrelse for å dempe høyfrekvent støy, og å bevare strukturer med dimensjoner på lipofuscin granulat.
   3. Flett både fargekanalene for å lette identifiseringen av lipofuscin (se trinn 3.2).
5. Bilde analyser: Sørg for at faget utføre de kvantifisering trinn vil være blind for å teste gruppeidentitet.
   1. For alle bildene, velger du først en region av interesse (ROI) som dekker de relevante strukturer, og har tilsvarende dimensjoner som ROIs fra andre bilder.
   2. Deretter velger du ønsket antall lipofuscin granulat som representerer hver ROI. Når du velger lipofuscin granulater innenfor en ROI, vil anvendelsen av disse reglene redusere subjektive bias.
      1. Velg en konsekvent plassering for å velge den første Granule. Dette kan være, for eksempel, vil den venstre kant av en ROI, og granule som er nærmest kanten alltid være den første valg.
      2. En etter en, er granulat valgt som er nærmest til forrige valg (neste nabo).
      3. Når du velger den neste nabo, flytter bare inn i én retning, for eksempel bare søke rett fra forrige valg. Denne regelen forhindrer at utvalget er dominert av tilfeldige klynger av tettpakkede granulat.
      4. Når utvalget er fullført, vurdere størrelsen på hver lipofuscin partikkel ved å skissere og måle de respektive granule-området. Bruk egnede statistiske tester for å sammenligne individer av de forskjellige testgrupper.

Representative Results

Protokoll § § 1 og 2 detalj hvordan testgrupper kan fås til å studere egenskapene til akselerert, bremset og snudd aldring i kolonier med en enkelt årskullet. For å overvåke arbeidstaker-type differensiering som følger den normale ontogenetiske vi vurdert nitter, tellinger ("inngangs teller") for seks kolonier (Figur 1, sammenligne seksjon 1). Grafene viser at betydelig endring fra sykepleier til forager staten er vanligvis ikke observert før individer er mer enn 10 dager gammel. Merket variasjon i nitter, teller ble observert med hensyn til timingen av foraging utbruddet mellom ulike kolonier, og som en markert dag-til-dag variasjon innenfor hver koloni. Bortsett fra koloni spesifikke demografiske faktorer, som for eksempel ulike stamfisk belastning, er mye variasjon forklares med skiftende værforhold (tidspunkter er merket med rødt i figur 1). Tett oppfølging av beite dynamikk derfor anbefales å optimalisere merking og innsamling innsats during eksperimentet.

Den reverserte ontogenetiske (§ 2) fra foraging tilbake til sykepleieroppgaver kan valideres ved å inspisere stamfisk kammer som er innført i de finsnitter-avledet kolonier (se trinn 2,2 og 2,3). For tre gjentak figurene 2A, C og E viser stamfisk kammer før innføring i nitter-avledet kolonier. Figures 2B, D og F viser de respektive kammer etter fjerning. Flekker av nylig avkortet stamfisk, sunn larver, og økt pollen lagring rundt stamfisk celler indikerer at tidligere nitter nå hadde vellykket utført typisk hekker, inkludert sykepleieroppgaver.

Lipofuscin (seksjon 3) er en høyt konservert symptom på mobilnettet senescence, og kan lett vurderes for post-eksperimentelle analysene i de ulike bee vev. Figur 3 kontraster lipofuscin akkumulering, målt som kornstørrelse (Figur 3E), i hypopharyngeal kjertler alder matchet sykepleier ennd nitter, bier. Forskjellen i kronologisk alder mellom de to unge og de to gamle gruppene var ≥ 17 dager, med bare én gruppe (fôrhøstere) tilbringer disse ≥ 17 dager med utenfor fly og mat samling aktiviteter. Representative mikroskopiske bilder (Tall 3A-D) viser økt lipofuscin opphopning bare for den gruppen av eldre nitter etter mer enn 17 dager av beite (Figur 3D), ikke for eldre sykepleier bier av samme kronologiske alder (37-43 dager; Figur 3B) . En to-faktor ANOVA med den faste hovedfaktorer arbeidstaker-type (fôrhøstere, sykepleiere) og aldersforskjellen (Δage ≥ 17 dager) viste signifikante effekter for arbeidstaker-type, aldersforskjellen og samspillet mellom begge faktorer (F _type = 33.67, P <0,001; F _Δage = 21.93, P <0,001, F _{typen x Δage} = 22.07, P <0,001). Men, post-hoc tester viste signifikante effekter barenår kontrast eldre nitter (≥ 17 dager med beite) til yngre nitter, eller til både sykepleier grupper (PF 17d vs F _1d/N1d/N17d <0,001, Fishers LSD, figur 3E). Ingen forskjell ble oppdaget blant de tre sistnevnte gruppene, inkludert kronologisk unge og gamle sykepleier grupper (alle tester med P> 0,5, Fishers LSD, Figur 3E). Dette tyder på at lipofuscin opphopning avhenger nitter, bestemte aktiviteter (foraging alder), snarere enn å være funksjon av kronologisk alder bare per se.

Figur 1. Worker-type differensiering under normal ontogenetiske. Grafen viser inngangs tellinger av fins tilbake fra beite flyreiser regnes for seks forskjellige koloniene begynner fem dager etter at de ble etablert (for detaljer sammenligne Protocol avsnitt 1.4). Betydelig overgang fra nest til beite aktiviteter ble først observert da merkede individer av enkelt årskullet var ca 10 dager gammel. Varierende løyper for de kumulative inngangs opptelling at dynamikken i sykepleier bee til forager overgang skiller mellom koloniene, og påvirkes av klimatiske faktorer. For eksempel, på dager med regn og mindre enn to timer med beite, økningen i inngangs teller vanligvis flatet ut (datapunkter i rødt).

Figur 2. Validere atferds hjemfall. For å teste om nitter har blitt tilbakestilt til sykepleieroppgaver, vi sammenlignet stamfisk kammer før de ble introdusert i nitter-avledet elveblest, og etter at de ble fjernet fra disse elveblest. Representative bildene viser stamfisk kammer før innføringen (A, C, E) ogetter fjerning (B, D, F) fra tre forskjellige nitter-avledede strukturer, henholdsvis. Brood omsorg av tidligere nitter, bier er indikert med et økende antall celler med avkortet stamfisk (B, D, F, svart pil, innfelt i D), vedvarende overlevelse av larver i åpne celler (rød pil) og økt lagring av pollen nær stamfisk celler (hvit pil). Merk at nitter-avledet-kolonier i utgangspunktet er vanligvis mindre effektiv i tending stamfisk enn sykepleier-avledet kolonier. Dette kan føre til høyere larvedødelighet i nitter-avledet-kolonier. Bilder i B, D, F ble tatt 5, 4 og 7 dager etter rogn kammer ble innført i nitter-avledet kolonier.

Figur 3. Opphopning av lipofuscin, en biomarkør for celleular senescence, kan tyde på arbeidstaker-type spesifikke vev forverring. Representative mikroskopiske bilder av hypopharyngeal kjertler i ung (A) og gamle sykepleier bier (B), samt i alders matchet nitter, bier med ≥ 1 dag (C), henholdsvis ≥ 17 dager foraging erfaring (skala bar i A = 20 mikrometer). Lipofuscin akkumulering ble målt som kornstørrelse, og er gitt som median og kvartiler for N = 5 personer for hver alder og arbeidstaker-type (E). Beite for 17 dager resulterte i betydelig lipofuscin opphopning, mens i samme periode ikke førte til lipofuscin endringer i sykepleier bier (for statistikk se resultater).

Discussion

Vi her adoptere tidligere beskrevet nærmer ^{8,16,17,19,20,} og integrere dem i en enkelt arbeidsflyt som vil legge til rette for å studere fleksibel aldring i honningbier. Vårt mål er å gi forskere som er nybegynner i dette feltet med et standardisert verktøy satt til å innhente relevant prøvemateriale, og for å forbedre eksperimentell reproduserbarhet mellom ulike forskningsgrupper. Mens våre prosedyrer er forenklet og ikke krever spesialutstyr som i tidligere beskrivelser (sammenlign for eksempel ^8), er noen tiltak for forholdsregel anbefales, og er samlet under.

Decoupling senescence fra kronologisk alder. Et mest kritiske aspektet er å unngå falsk identifikasjon av nitter, bier under innledende bekreftelse på beite atferd (2 ^nd merking). Derfor, når fins skal overvåkes ("inngangs teller") eller merket, trenger strengt unngå daglige perioder med orienterings flyreiser. I disse periodene mange pre-foraging scene bier vil forlate eller komme inn i strukturen. Disse biene ikke vise typiske fysiologiske karakteristikker av modne nitter, men bygge opp et romlig kart av bikuben omgivelser med lett identifiserbare sirkulære flytur mønstre ^21.

Mens de fleste bier endre til beite med en alder av 2 uker og eldre, er sporadisk beite observert allerede ved svært ung alder (Figur 1). Ekstremt bråmoden fins typisk utvikle direkte fra Callow reir bier uten å ha passert gjennom sykepleier scenen. For å ikke inkludere personer med en slik avvikende ontogenetiske (sammenlign ²² og referanser deri), er enkeltpersoner som begynner beite med en alder av 10 dager eller mindre ikke vurdert for videre analyser.

For å unngå overrepresentasjon av bråmoden fins videre, trenger vi ikke gjøre bruk av klassiske "single kohort kolonier" som bare består av én årskullet ^17,23. I stedet, når du setter oppkolonier vi legger tilfeldig reir bier ("reir bee kohort") til markert enkelt årskullet (se trinn 1,1 og 1,3). Siden tilfeldige reir bier er vanligvis eldre, kan de redusere presset på svært unge bier til å utvikle seg til ekstremt veslevoksen nitter ^17. Slike doble kohort kolonier, derfor kan bedre ligne en naturlig bikube demografi med personer som sakte fremgang fra sykepleie til beite.

Når langsiktig arbeideren tilpasninger er å bli studert, samle alle testgrupper utenfor foraging timer. Dette anbefales å redusere skjevhet ved mer akutte metabolske justeringer på grunn av nylige bevegelsesaktiviteter, for eksempel utmattende flytur.

Tilbakeføring av arbeidstakere med rask til bremset aldring ved å endre strukturen demografi. Etter nitter hadde fløyet tilbake til den opprinnelige plasseringen er det viktig å bevege seg bort sykepleier-avledet bikube (> 3 km). Dette er for å unngå at pre-foraging scene bier blir rekruttert og ledet tilgamle plasseringen av andre bier, henholdsvis gjennom feromon kommunikasjon ^24.

For ytterligere å forhindre eventuelle sykepleier eller andre pre-foraging individer kommer inn i forager-avledet bikube, anbefaler vi å holde med følgende regler: (I) Avslutt separasjonsprosedyre før daglige orienterings flyreiser begynne. (II) bare forsøke reversering på dager da sterk foraging aktivitet er observert. (III) Under og etter den første translokasjon av den opprinnelige strukturen, unngå unødvendig uro av bier, trenger spesielt ikke åpne strukturen.

I prinsippet, mer kunstige oppsett som begrenser nitter i en sykepleier-belastede miljøet også kan føre til hjemfall. Men bare slike oppsett har begrenset informativ verdi som nitter-avledet fraksjons erfaringer andre stressende miljøer, og dermed utelukker en direkte sammenligning med kontrollgrupper fra sykepleier-avledet kolonier.

Bekrefte ulike senescence mønstreved kvantifisering av lipofuscin, en biomarkør av mobilnettet senescence. Her vi eksemplifisert lipofuscin vurdering med bilder og statistiske data av hypopharyngeal kjertler fordi lipofuscin er mest lett synlig i dette vevet. Dette mener vi er viktig for å hjelpe den uerfarne observatør sette opp de riktige protokoller for mikroskopisk påvisning. Men i motsetning til andre vev, trenger hypopharyngeal kjertler vise betydelig apoptose og nekrose i løpet sykepleier til nitter, overgang ^25. Slike prosesser kan samhandle med opphopning av senescence markør, selv om vi ikke påvise økte nivåer av lipofuscin i unge nitter som nylig hadde endret seg fra sykepleieroppgaver (Tall 3C, E). Men, for å vurdere senescence tiltak i andre bee vev, de mikroskopi-baserte metoder som er beskrevet her kan enkelt tilpasses.

Alternativt, flow-cytometriske tilnærminger er mindre tidkrevende ^26. Mikros-baserte analyserhar den fordelen at cellulære aldring symptomer kan vurderes for ulike regioner eller selv for celler innenfor en enkelt organer ^27. For studier i hjernen og andre komplekse organer med romlig heterogenitet i cellulær aldring ^28, vi anbefaler derfor mikros basert tilnærming.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000