Indhentning af prøver med bremset, accelereret og omvendt Aging i Honey Bee Model

Summary

I honningbi arbejdere, aldring afhænger social adfærd snarere end på den kronologiske alder. Her viser vi, hvordan arbejder-typer med meget forskellige aldring mønstre kan indhentes og analyseres for cellulær degeneration.

Abstract

Samfund meget sociale dyr har enorme levetidsspecifikationerne forskelle mellem nært beslægtede individer. Blandt de sociale insekter, honningbien er den bedste etablerede model til at studere, hvordan plasticitet i levetid og aldring skyldes sociale faktorer.

Arbejderen kaste af honningbier omfatter sygeplejerske bier, som er tilbøjelige yngel og finsnittere bier, der indsamler nektar og pollen. Tidligere arbejde har vist, at hjernens funktioner og flyveegenskaber senesce hurtigere i finsnittere end i sygeplejersker. Dog kan hjernefunktioner komme sig, når finsnittere vende tilbage til plejeopgaver. Sådanne mønstre af accelereret og omvendt funktionelle degeneration er knyttet til ændrede metaboliske ressource niveauer af ændringer i protein overflod og immunforsvar. Vitellogenin, en æggeblomme protein med tilpassede funktioner i hormonal kontrol og cellulære forsvar, kan tjene som en vigtig lovgivningsmæssig element i et netværk, der styrer de forskellige aldring dynamik i arbejdstagere.

Her beskriver vi, hvordan fremkomsten af ​​sygeplejersker og grøntmaskiner kan overvåges, og manipuleret, herunder tilbageførsel fra typisk kortlivede finsnittere i længere levetid sygeplejersker. Vores repræsentative resultater viser, hvordan personer med lignende kronologiske alder differentierer til finsnittere og sygeplejerske bier under eksperimentelle betingelser. Vi eksemplificere hvordan adfærdsmæssige tilbageførsel fra finsnittere tilbage til sygeplejersker kan valideres. Sidste viser vi, hvordan forskellige cellulære ældning kan vurderes ved at måle ophobningen af ​​lipofuscin, en universel biomarkør for ældning.

For at studere mekanismer, der kan forbinde sociale påvirkninger og aldring plasticitet, denne protokol giver et standardiseret værktøj sæt til at erhverve relevant prøvemateriale, og for at forbedre sammenlignelighed blandt fremtidige undersøgelser.

Introduction

De komplekse colony strukturer meget sociale dyr opretholdes gennem interaktion mellem en reproduktiv kaste, og en hjælper kaste af typisk ikke gengive medarbejdere med forskellige sociale opgave adfærd. I de forskellige arbejdere, specifikke fysiologiske tilpasninger muliggøre distinkte sib pleje adfærd, og er også knyttet til ekstreme levetidsspecifikationerne forskelle. Honningbier og muldvarp rotter repræsenterer de bedst udviklede dyremodeller for at undersøge, hvordan socialitet er knyttet til mønstre af accelereret, ubetydelig eller omvendt aldring ^1-3.

I honningbi kolonier, er en enkelt æglægning dronning bistået af tusinder af arbejdere, der har tendens yngel, foder til mad, og engagere sig i bevogtning, varmeregulering eller hygiejniske adfærd ^4. Blandt disse arbejdstagere er de ekstremt kortlivede finsnittere, sygeplejerske bier med mellemliggende og vinter (diutinus) bier med længste livslængde. Individer, er dog ikke permanent bundet til en bestemt worker-type, men vise en fleksibel adfærdsmæssige ontogeny: de ændre fra én social opgave adfærd til en anden ("tidsmæssige kaster"). Callow bier kan skifte til yngel tendens sygeplejerske bier, som i sidste ende kan ændre sig til udenfor fouragering. Dog kan callow reden bier også forvandle længste levetid vinter bier, og kortlivede finsnittere kan endda vende tilbage i typisk længere levetid sygeplejersker. Arbejdstagere med ekstrem (vinter bier) og mellemprodukt (sygeplejerske bier) levetid har veludviklede produktion og lagring organer mad med rigelige ressourcer - i modsætning til kortlivede finsnittere (revideret i ^1,5). Imidlertid, at reguleringen af de enkelte levetid går ud over enkle ændringer i en persons ressource balance er foreslået af forskning på en æggeblomme protein, som har forskellige tilpassede funktioner i den ikke-reproducerende arbejdstager kaste, såsom gelé produktion ^6, hormonel kontrol ^7, immun ⁸ og antioxidant forsvar ^9.

Mønstre af functional tilbagegang (ældning) spejl levetidsspecifikationerne forskelle mellem arbejdstagerne, som fastlagt for olfaktoriske, og også for andre hjerne-eller motoriske funktioner ^10-13. Konkret det betydelige fald i læring funktion efter kun to ugers fouragering matcher et lignende dødelighed progression i finsnittere ^14, i modsætning til den manglende påviselig tilbagegang (ubetydelig degeneration) i langlivede vinter bier ^15.

At identificere de molekylære fingeraftryk af fleksibel aldring vi tilpasset etablerede eksperimentelle paradigmer, som giver mulighed for at overvåge og manipulere aldrende-type overgange ^8,16,17. Eksperiment 1 Sådan hentes prøver, hvor virkningerne af kronologisk alder og arbejdstager-type specifikke sociale adfærd på aldring kan adskilles. Eksperiment 2 beskriver tilbageførsel af finsnittere med accelererede ind i sygeplejerske bier med Langsommere aldring dynamik. Eksperiment 3 giver en tilgang til sondering effekter af cellulær ældning ved anatomical kvantificering af en etableret biomarkør for cellulær aldring (lipofuscin) ^18.

Protocol

1.. Afkobling Senescence fra kronologiske alder

Dette afsnit beskriver opsætningen af ​​fordoblingen kolonier, som består af en kohorte af identificerede enkeltpersoner, der deler samme kronologiske alder ("single aldersgruppe"), og en kohorte af reden bier. Samme alderen individer i det indre aldersgruppe i sidste ende vil adskille i forskellige arbejdstager-typer med forskellige aldring dynamik - det er sygeplejerske bier med aftaget, og finsnittere bier med accelereret funktionelle tilbagegang. Alle procedurer er beskrevet for en eksperimentel koloni. Vi tilråder dog, at udføre eksperimenter i mindst to koloni replikater så koloni effekter kan styres for (to-replikat-design).

1. Forberedelse hive kasser til fordoblingen kolonier: Forbered en regulær hive boks, der modtager to fødevarer kamme med honning, en anden fødevare kam med pollen, og to tomme kamme. Sørg for at finde en parret dronning samt en donor koloni med mere end 3.000reden bier. Begge vil blive introduceret senere (1.3).
2. Indhentning og mærkning personer med lignende kronologiske alder: Saml kamme med forseglet yngel, der er ved at dukke op. For én replikat forventer at samle kamme med i alt 3.000-5.000 udjævnede yngel celler. For hver replikere bruger en afbalanceret mængde af yngel fra mindst tre forskellige hive kilder til at undgå skæve fordelinger af maternelle genotyper (hive oprindelse).
   1. Placer yngel kamme i en inkubator indstillet til 34 ° C med 60-70% relativ fugtighed. Sørg for at opbevare kamme på en sådan måde, at nye kuld ikke kan undslippe.
   2. Lad bier dukke op i to dage og markere disse bier med en lille maling tag på brystkassen (f.eks Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co Ltd). Malingen mærket vil tillade identifikation af bier på enkelt aldersgruppe (dagen for fremkomst), og til at skelne dem fra andre replikere kolonier.
3. Opsætning af en dobbelt kohorte koloni, som omfatter den kohorte, jegdentified, Single Alder bier: På dagen unge bier er blevet markeret, indsamle omkring 2.500-3.000 reden bier fra en donor koloni (sammenlign § 1 i diskussionen.), og tilføje disse umærkede bier til bikuben boks, der blev udarbejdet før (se trin 1.1). Sidstnævnte personer vil udgøre den uidentificerede reden bi kohorten.
   1. Føj dronningen, som vil blive omgang begrænset til en dronning bur (fås i handelen). Forsegl bur med spiselige slik (f.eks Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Tyskland) for at gøre bier langsomt frigive dronningen.
   2. Tilsæt nyopstået og mærket bier, som vil udgøre en enkelt aldersgruppe. Disse bier er de eneste afmærkede individer, og er fokusgruppen for alle de følgende trin.
4. Overvågning fouragering debut og mærkning finsnittere: At vurdere debut og dynamikken i sygeplejerske-til-forager overgang i enkelt aldersgruppe, overvåge demografiske udvikling af fouragering aktivitet emeget anden dag for hver koloni. Begynde at tælle fem dage efter kolonier blev indstillet (figur 1).
   1. Tæl det samlede antal bier vender tilbage fra fouragering flyvninger (indgangen tællinger) inden for 3 x 20 min observationsperioder på faste tidspunkter. Sørg for ikke at tælle bier i perioder orientering flyvninger (se diskussionen).
   2. Når indgangen tæller indikerer betydelig fouragering aktivitet at påbegynde (> 100 indgangspartier tællinger / dag), begynder mærkning finsnittere. At gøre det, finsnittere det indre aldersgruppe (single markerede individer) modtager et andet maling mark ved returnering fra deres første fouragering flyvninger. Denne maling mærket vil angive den dag fouragering debut, og vil gøre det muligt at senere identificere fouragere alder for hver forager.
   3. Gentag daglige markeringer indtil et tilstrækkeligt antal bier har markeret. Til at estimere et tilstrækkeligt antal afmærkede finsnittere, forvente en hentning sats på ikke mere end 5-10% efter disse bier var blevet ældet, typisk efter 14 dagesfouragere.
5. Sampling: Da alle oprindeligt markerede bier har en lignende kronologiske alder, kan aldersmatchede grupper af sygeplejersker og gamle finsnittere indsamles samtidigt, når finsnittere har foraged i ≥ 14 dage.
   1. Enkelte markante sygeplejerske bier indsamles inden bikuben, og er identificeret ved sygepleje adfærd (fodring og rengøring af larver med hoved sat ned i åbne yngel celler).
   2. Dobbelt markerede finsnittere indsamles også i bikuben før daglige fouragering aktivitet begynder.
   3. Saml bier i bure (rør, kasser) tilstrækkelig ventilation, og holde mørke, indtil yderligere behandling. Alternativt for transkriptom, epigenetiske eller proteom undersøgelser, snap direkte fryse bier i flydende nitrogen. Saml afbalancerede antal personer fra alle testgrupper og kopiere kolonier.

2. Tilbageførsel af Arbejdstagere med Rapid til Arbejdstagere med Langsommere Aging ved Ændring af Hive demografi </ P>

Dette afsnit beskriver, hvordan tilbageførsel fra arbejdstagere med accelereret ældning (finsnittere) til arbejdstagere med langsommere aldring (sygeplejerske bier) udføres. Sådanne adfærdsmæssige vending induceres, når finsnittere oplever en mangel på sygeplejerske bier, som normalt engagere sig i yngelplejen. Den reversion procedure vil adskille en enkelt koloni replikere i to bistader: en bistade med fraktion sygeplejersken bee ("sygeplejerske-afledt") og en anden med den fraktion forager ("forager-afledt"). Efter en vellykket vending, mulige symptomer på plast og vendes aldring kan studeres i det indre aldersgruppe med reverterede arbejdstagere, fortsættende finsnittere, fortsættende sygeplejerske bier og nyansatte finsnittere. Som før, identificerede bier i det indre aldersgruppe, ikke kohorte af uidentificerede reden bier, udgør den eksperimentelle fokusgruppe.

1. Forberedelse: Gentagne stader med sygeplejersker (enkelt-mærket) og finsnittere (dobbelt markeret) bliver stillet til rådighed som beskrevet i det foregående afsnit. Sørg for ikke at begynde reversion med mindre end 500 afmærkede finsnittere pr måleglas koloni for at sikre tilstrækkelig genfinding efter tilbagevenden er afsluttet.
   1. Til sikker identifikation af testgrupper efter vending er det afgørende, at hele forager befolkningen i den oprindelige hive har været præget af før tilbagefald. Følgende fremgangsmåde er beskrevet for en gentagelse.
   2. Dagen før reversion, forberede en ekstra bistade kasse for forager-afledte hive (se trin 1.1). Find to dronninger og to yngeltavler fra donor bistader. Før overførsel til de eksperimentelle kolonier børste væk alle voksne bier af disse kamme. Et bur dronning (se trin 1.3) og én yngel kam vil erstatte dronning og yngeltavler i den oprindelige hive kassen. Det andet sæt af dronning og yngel kam vil blive brugt næste dag for den nye hive kassen. Tilsvarende tildelingen af ​​nye yngel kamme og fremmede dronninger for både den oprindelige og den nye hive tilrådes at sørge for, at adskilte finsnittere og sygeplejerskes vil ligeledes oplevelse ændrede hive signaler ("hive lugt").
2. Reversion: I morgen, lige før reversion, tilsæt bur dronning og yngel kam til den nye boks, der vil modtage fraktionen forager-afledte. Vent til peak fouragering tid begynder. Flyt derefter den oprindelige koloni med afmærkede finsnittere og sygeplejerske bier på mindst 100 m væk fra den oprindelige placering.
   1. På den oprindelige placering, skal du opsætte nye boks for forager-afledte hive med yngel og kun dronning.
   2. Finsnittere vil forlade forvredet oprindelige hive kasse, og hovedet tilbage til den oprindelige placering. Tillad finsnittere at vende tilbage til den oprindelige placering i 2 timer for at nå ud til at fuldføre adskillelsen af ​​forager befolkningen fra reden bier.
   3. Så, for at afslutte adskillelsen, lukke den oprindelige, nu "sygeplejerske-afledte" hive, og overføre det til en bigård på mindst 3 km væk.
3. Hive vedligeholdelse og overvågning for en vellykket social opgavevending: Kontroller de eksperimentelle bistader regelmæssigt for sund, åben yngel.
   1. I de første dage efter koloni manipulation erstatte uden opsyn og døde yngel for at reducere potentiel patogen belastning.
   2. For at validere vellykket vending i forager-afledte hive, tage billeder yngeltavler før indføre disse, og igen når kamme udskiftes, eller når reversion forsøget er afsluttet (figur 2). Områder med tidligere ikke-reducerede yngel og med åbent, levende yngel er pålidelige markører for sygepleje aktivitet i finsnittere-afledte kolonier.
4. Prøveudtagning: Fysiologiske virkninger, der ledsager den sociale vending kan detekteres 3-8 dage efter finsnittere og sygeplejersker blev adskilt.
   1. Vi rådgiver prøveudtagning alle testgrupper, dvs reverterede arbejdstagere og fortsatte finsnittere (forager-afledt hive), samt fortsatte sygeplejersker og nyansatte finsnittere (sygeplejerske-afledt hive) 8 dage efter vending påbegyndes.
   2. ColLect prøver som beskrevet i trin 1.5.

3. Analyserer Worker-typespecifikke Cellular senescens Patterns af Kvantificering af Lipofuscin

Lipofuscin er en universel biomarkør for cellulær degeneration. Som en iboende ophobning produkt, kan lipofuscin specifikke autofluorescens (emission _max = 530-650 nm) anvendes til detektering ^18.

1. Dissektion og fiksering: Chill bier på is indtil ubevægelig, fjerne og dissekere den ønskede vævsprøve.
   1. Overfør i fiksativ (4% paraformaldehyd i phosphatpufret saltvand, PBS, pH 7,2) til inkubering natten over ved 4 ° C.
   2. Vask prøverne 3 gange i PBS.
2. Vævsbehandling og montering: Skær vævsprøver i sektioner med ikke mere end 40 um tykkelse, for eksempel ved hjælp af en vibrerende klinge mikrotom, fx Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Tyskland).
   1. Monter sektioner på mikroskopiske objektglas i 50% glycerol (PBS). For langtidsopbevaring tætningsdækslet glider med neglelak.
3. Billede erhvervelse: At påvise lipofuscin, foreslår vi, ved hjælp af en laser scanning konfokal mikroskop der giver laserlinjer med λ = 514, 561nm eller lignende for excitation og med detektoren båndbredde sat til 570-650 nm.
   1. For bedre identifikation af lipofuscin, indeholde en anden kanal, og gør en samtidig scanning på kortere bølgelængde spektre (excitation = 405 nm, emission = 410-450 nm). Jo længere bølgelængde kanal vil afsløre både granulære lipofuscin, men også uspecifik "baggrund" på grund af autofluorescerende luftrøret og andre ikke-granulære strukturer. Den anden kortere bølgelængde kanal vil kun afsløre uspecifik autofluorescens, men ikke lipofuscin. Således kan lipofuscin identifikationen være lette tated ved at sammenligne de signaler i begge kanaler, med kun én af dem afslører granulatet med lipofuscin specifik fluorescens.
   2. Ved køb af billeder med høj opløsning anvender et objektiv med 40X forstørrelse eller højere, og helst en numerisk apertur på 1,25 eller højere. Scan billede stakke med dimensioner på ca 100 x 100 x 10 mM ^3. Ethvert individ og vævsprøve skal repræsenteres af flere billedfiler stakke.
   3. For at reducere intraindividuelle og inter-individuel variation forårsaget af teknisk variation, altid holde laser magt og detektor følsomhed konstant.
   4. For at reducere skævhed ved dag-til dag tekniske variationer scanne numre lige prøve af alle test grupper i hver af de flere scanning sessioner.
4. Billedbehandling: Brug software-pakker med moduler, der giver mulighed for avanceret behandling af mikroskopiske billedstakke, for eksempel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generer en 2D maksimal projektion for hver af 3D-billedet stakke.
   2. Anvende en Gauss filter med en beskeden kerne størrelse for at dæmpe højfrekvente støj, og for at bevare strukturerne med dimensionerne lipofuscin granulat.
   3. Flet begge farvekanaler at lette identifikationen af ​​lipofuscin (se trin 3.2).
5. Billede analyser: Sørg for, at emnet udfører kvantificering skridt vil være blind for at teste gruppe identitet.
   1. For alle billeder, skal du først vælge en region af interesse (ROI), der dækker de relevante strukturer, og har samme dimensioner som den ROIs fra andre billeder.
   2. Vælg derefter det ønskede antal lipofuscin granulat, der repræsenterer hver ROI. Når du vælger lipofuscin granulat inden for et ROI, vil anvendelsen af ​​følgende regler reducere subjektive forudindtagethed.
      1. Vælg en konsekvent placering til valg af første granulatle. Dette kan være, for eksempel, vil den venstre kant af en ROI og granulatet, der er tættest på kanten altid være det første valg.
      2. Den ene efter den anden, granulat vælges der er tættest på det forrige valg (næste nabo).
      3. Når du vælger den næste nabo, bevæge sig i én retning, for eksempel kun at søge lige fra det forrige valg. Denne regel forhindrer, at udvælgelsen er domineret af lejlighedsvise klynger af tætpakkede granulat.
      4. Når valget er gennemført, vurdere størrelsen af ​​hver lipofuscin partikel ved at skitsere og måle den respektive granulat området. Brug passende statistiske test til at sammenligne individer af de forskellige testgrupper.

Representative Results

Protokol afsnit 1 og 2 detaljer, hvordan testgrupper kan fås til at studere attributter accelereret, bremset og vendt aldring i kolonier med en enkelt aldersgruppe. At overvåge arbejdstager-typen differentiering, der ledsager den normale ontogeny vi vurderet finsnittere tæller ("indgangen tæller") i 6 kolonier (figur 1, sammenligne afsnit 1). Graferne viser, at en betydelig ændring fra sygeplejerske til forager staten typisk ikke overholdes før individer er mere end 10 dage gamle. Markant variation i finsnittere tællinger blev observeret med hensyn til timingen af ​​fouragering debut blandt de forskellige kolonier, og som en markant dag-til-dag variation inden for hver koloni. Bortset fra koloni specifikke demografiske faktorer, såsom forskellige kuld belastning er meget variation forklares ved skiftende vejrforhold (Tidspunkter markeret med rødt i figur 1). Tæt monitorering af fouragering dynamik derfor tilrådes at optimere mærkning og indsamling indsats durning eksperimentet.

Den omvendte ontogeny (afsnit 2) fra fouragere tilbage til plejeopgaver kan valideres ved at inspicere yngeltavler, der er indført i kolonierne finsnittere-afledte (se trin 2.2 og 2.3). For tre gentagelser 2A, C, og E-show yngeltavler før indføring i finsnittere afledte kolonier. Figurerne 2B, D og F viser de respektive kamme efter fjernelse. Pletter af nyligt udjævnede yngel, sunde larver og øget pollen opbevaring omkring yngel celler indikerer, at tidligere finsnittere nu lykkedes havde udført typisk reden, herunder plejeopgaver.

Lipofuscin (afsnit 3) er et stærkt konserveret symptom på cellulær degeneration, og kan let vurderes for post-eksperimentelle analyser i de forskellige bi væv. Figur 3 kontraster lipofuscin ophobning, målt som kornstørrelse (figur 3E), i hypopharyngeal kirtler alder matchede sygeplejerske ennd finsnittere bier. Forskellen i kronologisk alder mellem de to unge, og de to gamle grupper var ≥ 17 dage, med kun én gruppe (finsnittere) bruge disse ≥ 17 dage med eksterne flyvning og indsamling mad-aktiviteter. Repræsentative mikroskopiske billeder (figur 3A-D) viser øget lipofuscin ophobning kun for gruppen af ældre finsnittere efter mere end 17 dage fouragering (figur 3D), ikke for ældre sygeplejerske bier af samme kronologiske alder (37-43 dage figur 3B) . En to-faktoriel ANOVA med den faste hovedfaktorer arbejdstager-type (finsnittere, sygeplejersker) og aldersforskel (Δage ≥ 17 dage) afslørede betydelige virkninger for arbejdstagernes-type, alder forskel, og samspillet mellem de to faktorer (F _type = 33,67, P <0,001; F _Δage = 21,93, P <0,001, F _{type x Δage} = 22.07, P <0,001). Post-hoc test, kun Imidlertid viste signifikante effekternår kontrasterende ældre finsnittere (≥ 17 dage med fouragering) til yngre finsnittere, eller til begge sygeplejerske grupper (PF 17d vs F _1d/N1d/N17d <0,001, Fishers LSD, figur 3E). Ingen forskel blev påvist blandt de tre sidstnævnte grupper, herunder kronologisk unge og gamle sygeplejerske grupper (alle test med P> 0,5, Fishers LSD, Figur 3E). Dette antyder, at lipofuscin ophobning afhænger finsnittere særlige aktiviteter (fouragerer alder), snarere end at være funktion af kronologiske alder kun per se.

Figur 1. Worker-typen differentiering under normal ontogeny. Grafen viser indgangen tællinger af finsnittere vender tilbage fra fouragering flyvninger tælles i 6 forskellige kolonier begynder 5 dage efter de er etableret (for detaljer sammenligne Protocol afsnit 1.4). Betydelig overgang fra nest at fouragere aktiviteter blev først observeret, når afmærkede individer af den enkelte aldersgruppe var omkring 10 dage gammel. Varierende pister til de kumulative indgangen tæller indikerer, at dynamikken i sygeplejerske bee til forager overgang variere mellem kolonier, og er påvirket af klimatiske faktorer. For eksempel, på dage med regn og mindre end to timer af fouragering, stigningen i indgangen tæller typisk fladet ud (datapunkter i rødt).

Figur 2. Validering adfærdsmæssige reversion. At teste om finsnittere med succes har vendt tilbage til plejeopgaver, vi sammenlignet yngeltavler før de blev indført i finsnittere afledte nældefeber, og efter at de blev fjernet fra disse bistader. Repræsentative billeder viser yngeltavler før introduktion (A, C, E) ogefter fjernelse (B, D, F) fra tre forskellige finsnittere afledt nældefeber, hhv. Brood pleje af tidligere finsnittere bier er angivet med et stigende antal af celler med udjævnede kuld (B, D, F, sort pil, indsat i D), vedvarende overlevelse af larver i åbne celler (rød pil) og øget lagring af pollen tæt på yngel celler (hvid pil). Bemærk, at finsnittere-afledte kolonier oprindeligt er typisk mindre effektive i tendens yngel end sygeplejerske-afledte kolonier. Dette kan føre til højere larvernes dødelighed i finsnittere-afledte kolonier. Billeder i B, D, blev F taget 5, 4 og 7 dage efter yngel kamme blev indført i finsnittermodeller-afledte kolonier.

Figur 3. Ophobning af lipofuscin, en biomarkør for celleular degeneration, kan indikere arbejdstager-specifikke væv forringelse. Repræsentative mikroskopiske billeder af hypopharyngeal kirtler i unge (A) og gamle sygeplejerske bier (B), såvel som i alders-matchede finsnittere bier med ≥ 1 dag (C), henholdsvis ≥ 17 dage fouragering erfaring (skala bar i A = 20 mM). Lipofuscin ophobning blev målt som kornstørrelse, og er givet som medianer og kvartiler for N = 5 personer for hver alder og arbejdstager-type (E). Fouragere i 17 dage resulterede i signifikant lipofuscin ophobning, mens den samme periode ikke førte til lipofuscin ændringer i sygeplejerske bier (for statistik se resultater).

Discussion

Vi her vedtage tidligere beskrevet nærmer ^{8,16,17,19,20,} og integrere dem i en enkelt arbejdsgang, der vil gøre det lettere at studere fleksibel aldring i honningbier. Vores mål er at give forskere, der er novice til dette område med et standardiseret værktøj sæt til at indhente relevante prøvemateriale, og for at forbedre eksperimenterende reproducerbarhed mellem forskellige forskerhold. Mens vores procedurer er forenklet og kræver ikke særligt udstyr som i tidligere beskrivelser (sammenlign for eksempel ^8), er nogle foranstaltninger for forsigtighed tilrådes og opsamles nedenfor.

Afkobling ældning fra kronologiske alder. En mest kritiske aspekt er at undgå falsk identifikation af finsnittere bier under den indledende bekræftelse af fouragering adfærd ^(2. mærkning). Derfor, når finsnittere der skal overvåges ("indgangen tæller") eller markeret, behøver strengt undgå daglige perioder med orientering flyvninger. I disse perioder mange pre-foraging stage bier vil afvige fra eller indtaste bikuben. Disse bier vises ikke typiske fysiologiske egenskaber af modne finsnittere, men opbygge en rumlig kort af hive omgivelser ved hjælp af let identificerbare cirkulære flyvning mønstre ^21.

Mens de fleste bier skifte til fouragere med en alder af 2 uger og ældre, er sporadisk fouragering bemærket allerede i en meget ung alder (Figur 1). Ekstremt fremmelige finsnittere udvikle typisk direkte fra Callow reden bier uden at have passeret gennem sygeplejersken scenen. Hvis du ikke vil omfatte personer med en sådan afvigende ontogeny (sammenligne ²² og referencer deri), er personer, der begynder fouragering med en alder af 10 dage eller derunder ikke i betragtning til yderligere analyser.

For yderligere at undgå overrepræsentation af gammelklog finsnittere, vi ikke gør brug af klassiske "single kohorte kolonier", der kun af det indre aldersgruppe ^17,23 består. I stedet ved oprettelsenkolonier, vi tilføjer tilfældig reden bier ("rede bi kohorte") til markeret enkelt aldersgruppe (se trin 1.1 og 1.3). Da tilfældige reden bier er typisk ældre, kan de reducere presset på meget unge bier til at udvikle sig til en meget fremmelig finsnittere ^17. Sådanne dobbelte kohorte kolonier kan derfor bedre ligne en naturlig hive demografi med personer, der langsomt fremskridt fra sygepleje til fouragering.

Når langsigtet arbejdstager specifikke tilpasninger der skal undersøges, indsamle alle testgrupper uden fouragering timer. Det tilrådes at reducere fordomme med mere akutte metaboliske tilpasninger som følge af de seneste bevægeapparatet aktiviteter, for eksempel udmattende flyvning.

Tilbageførsel af arbejdstagere med hurtige til bremset aldring ved at ændre hive demografi. Efter finsnittere var fløjet tilbage til den oprindelige placering er det vigtigt at bevæge sig væk sygeplejersken-afledte hive (> 3 km). Dette er for at undgå, at præ-fouragering stadie bier rekrutteres og guidet til dengamle placering af andre bier gennem henholdsvis feromon kommunikation ^24.

For yderligere at forhindre enhver sygeplejerske eller andre pre-tilholdssteder individer ind i forager-afledte hive, anbefaler vi at holde med følgende regler: (I) Afslut adskillelse procedure før daglige orientering flyvninger begynde. (II) Forsøg Kun tilbageførsel på dage, hvor stærk fouragering aktivitet er observeret. (III) Under og efter den indledende translokation af den oprindelige hive, undgå unødvendige agitation af bier, behøver især ikke åbne bikuben.

I princippet mere kunstige opsætninger der begrænser finsnittere i en sygeplejerske-berøvet miljø også kan føre til tilbagevenden. Det er dog kun sådanne opstillinger har begrænset informationsværdi, da finsnittere-afledt fraktion erfaringer andre stressende miljøer, hvilket udelukker en direkte sammenligning med kontrolgrupper fra sygeplejerske-afledte kolonier.

Bekræftelse forskellige senescence mønstreved kvantificering af lipofuscin, en biomarkør for cellulær ældning. Her eksemplificeret vi lipofuscin vurdering med billeder og statistiske data hypopharyngeal kirtler fordi lipofuscin er lettest påvises i dette væv. Dette, mener vi, er vigtigt at hjælpe den uerfarne observatør oprettelse af de korrekte protokoller for mikroskopisk påvisning. Men i modsætning til andre væv, behøver hypopharyngeal kirtler vise betydelige apoptose og nekrose under sygeplejerske til finsnittere overgang ^25. Sådanne processer kan interagere med ophobning af degeneration markør, selvom vi ikke registrerer forhøjede niveauer af lipofuscin hos unge finsnittere, der for nylig havde ændret sig fra plejeopgaver (figur 3C, E). Men for at vurdere senescens foranstaltninger i andre bi væv, de mikroskopi-baserede metoder er beskrevet her kan nemt tilpasses.

Alternativt flowcytometrisk tilgange er mindre tidskrævende ^26. Mikroskopi-analyserhar den fordel, at cellulær aldring symptomer kan vurderes for forskellige regioner eller endog for celler inden for en enkelt organer ^27. For studier i hjernen og andre komplekse organer med rumlig heterogenitet i cellulær aldring ^28, vi anbefaler derfor at mikroskopi tilgang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000