Summary
Nous décrivons la fabrication de pastilles comprimées d'hormones, ainsi que l'implantation chirurgicale sous-cutanée à des souris. Cette stratégie peut être combinée avec la croissance de xénogreffes de cellules et de tissus sous la capsule rénale de souris nudes athymiques pour évaluer la carcinogenèse hormonale et la régulation de la croissance bénigne de la prostate.
Abstract
Nouvelles thérapies pour les deux maladies courantes de la prostate, le cancer de la prostate (AEPA) et l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP), dépendent de façon critique sur les expériences évaluant leur régulation hormonale. Hormones stéroïdes sexe (notamment les androgènes et oestrogènes) sont importants dans érythroblastopénie et l'HBP; nous sondons leurs rôles respectifs dans l'induction de la croissance de la prostate et la cancérogenèse chez la souris avec des expériences à l'aide de pastilles d'hormones compressés. Hormones et / ou de drogues pastilles sont facilement fabriqués avec une presse à pellets, et chirurgicalement implantés dans le tissu sous-cutané de l'hôte chez les souris mâles. Nous décrivons également un protocole pour l'évaluation de la carcinogenèse hormonale sous-cutanée en combinaison avec l'hormone culot implantation de recombinants xénogreffe de cellules de la prostate sous la capsule rénale de souris immunodéprimées. En outre, l'hormone sous-cutanée culot implantation, en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de tissu de BPH, est utile pour mieux comprendre la régulation hormonale de prost bénignemangé la croissance, et de tester de nouvelles thérapies ciblant sexe stéroïde voies hormonales.
Introduction
Cancer de la prostate (AEPA) et l'hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) sont des fardeaux pour la santé. L'érythroblastopénie est le deuxième cancer d'organe solide la plus fréquente chez les hommes et une cause majeure de cancer liés mort 1. L'HBP est également très fréquente chez les hommes plus âgés, et il est estimé que la manifestation clinique de l'HBP, la baisse des symptômes des voies urinaires (TUBA), aura une incidence sur 50-90% des hommes 2. Alors que les androgènes et oestrogènes sont connus pour être important dans érythroblastopénie et BPH, notre compréhension des mécanismes hormonaux qui sous-tendent la carcinogenèse et la croissance reste incomplète 3,4. Modèles animaux simples et dociles génétiquement sous-tendent les études qui permettront de répondre à ces priorités dans la recherche de la prostate. Dans hormones maladies sensibles tels que l'érythroblastopénie et l'HBP, l'utilisation de sous-cutanée, la lenteur des pastilles d'hormones de libération, isolément ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe (le transfert de cellules, de tissus ou d'organes d'une espèce à une autre) dans le immunocompSouris hôte romised, fournit un procédé simple et reproductible pour l'étude de la régulation hormonale de la croissance et de la cancérogenèse.
Sous-cutanée hormone culot implantation est une technique simple et reproductible pour étudier la régulation hormonale de la carcinogenèse et la croissance bénigne de la prostate 5. Implantation sous-cutanée de souris mâles adultes avec 25 mg de testosterone (T) et 2,5 mg de 17β-estradiol (E 2), provoque une augmentation dans le sérum E 2 et diminution progressive de la T, de recréer l'environnement hormonal dynamique de l'homme vieillissant 5,6. En outre, ce modèle reprend la plupart des caractéristiques cliniques de l'HBP-TUBA 5,7. D'autres méthodes d'administration d'hormones comprennent l'administration orale / de gavage ou par injection intrapéritonéale, qui causent une détresse à l'rongeur, sont moins cohérentes dans la prestation de la même quantité de médicament dans le temps, et sont plus de main-d'œuvre d'une implantation chirurgicale d'un temps. D'autres modes de sous-cutanées hormone et / ou l'administration de médicaments comprennent les capsules de Silastic 8. Alors que nous avons aussi l'expérience avec l'utilisation de capsules de Silastic, granulés compressés sont favorisés pour leur facilité d'utilisation et la reproductibilité. En outre, les taux de pastilles d'hormones comprimé à libération mieux imiter les rapports dynamiques sexuelles stéroïdes hormonaux observés chez les hommes vieillissants 5,7.
Depuis le développement des souris génétiquement immunodéprimé, de nombreux systèmes de modèle in vivo en incorporant des techniques de la xénogreffe ont été mis au point pour l'étude d'une grande variété de tissus normaux et malades. Il existe plusieurs catégories de base de la xénogreffe. xénogreffes de tissus sont constitués d'un petit morceau de tissu intact, ce qui peut être une structure normale, une tumeur maligne ou bénigne croissance. Szot et al. (2007) ont récemment éclairé rénale capsule xénogreffe d'îlots pancréatiques 9. Aamdal et al. (1985) a décrit la capsule rénale xénogreffe de 27 lignées cellulaires de cancer humain en imsouris munocompromised accueille 10. Greffons peuvent aussi être composés d'une seule lignée cellulaire immortalisée (cancéreuse ou non tumorigènes), ou peuvent être constitués d'une lignée cellulaire immortalisée combiné avec des cellules isolées à partir de mésenchyme (greffe de cellules recombinantes).
Nous privilégions la xénogreffe de recombinants de cellules de sonder les rôles respectifs de stroma et de l'épithélium dans le développement d'érythroblastopénie et BPH. Cunha et al. (1980) a été le premier à signaler que lorsque les adultes murin épithélium de la vessie est combiné avec embryonnaire mésenchyme urogénital des sinus (UGM) et xénogreffes sous la capsule rénale d'hôtes souris mâles, le tissu se développe en structures ressemblant prostate acini 11. Norman et al. (1986) a montré que la souris adulte prostate canalaire épithélium et UGM, lorsqu'il est combiné à des recombinants de tissus, connaissent une croissance canalaire et la morphogenèse de ramification 12. Hayward et al. (1988) a montré que l'épithélium de la prostate humain répond à inductifs m fœtaleesenchyme de la même façon 13. Un modèle hormonal de la carcinogenèse de la prostate, en combinant la lignée de cellules épithéliales de prostate humaine immortalisée BPH-1 avec UGM, a d'abord été rapporté par Wang et al. 14 (2001) et a été largement utilisé dans notre laboratoire 15. Ce modèle est bien adapté pour la compréhension de la progression érythroblastopénie parce épithélium bénigne de la prostate se transforme en maladie métastatique, la modélisation avancée érythroblastopénie chez l'homme 5. Parce que les composants spécifiques peuvent être manipulées génétiquement, cellule greffe recombinant est particulièrement utile comme une approche pour évaluer les interactions stroma-épithéliales.
Autres sites appropriés pour la xénogreffe sont intradermique, sous-cutanée et lieux orthotopiques 16. Selon le procédé de l'intérêt du tissu et de la maladie, ceux-ci peuvent être d'autres méthodes appropriées. Pour l'étude de la carcinogenèse hormonale de la prostate et de la réglementation de tumeur bénigne, nous choisissons la capsule rénalesite pour xénogreffe en raison de ses supérieurs greffe prenne taux, l'approvisionnement en sang en abondance, et la capacité à implanter un plus grand nombre de xénogreffes dans un seul site confiné 16. De plus, la manipulation hormonale de la souris de l'hôte qui donne lieu à une atrophie de la prostate limite l'utilisation de la prostate greffe orthotopique 16.
Ce protocole définit les techniques de fabrication comprimé hormone / médicament culot et l'implantation chirurgicale, de même que la capsule rénale xénogreffe de greffes de cellules et de tissus de la prostate humaine. Ensemble, ces techniques fournissent un dosage sensible pour déterminer si une souris génétiquement modifiée est plus sensible à l'érythroblastopénie et / ou à la BPH initiation de souches témoins. Xénogreffe est une technique puissante pour l'évaluation in vivo du potentiel des cellules expérimentales pour développer histologique et les caractéristiques moléculaires des tumeurs malignes, ainsi que d'un essai pour de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une large variété de maladies bénignes et malignes.
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Protocol
Une. Préparation de comprimé d'hormone / Drug Pellet
- Cette procédure doit être effectuée sous une hotte de sécurité chimique tout en portant une blouse de laboratoire, des gants, un masque, des lunettes de sécurité, et le chapeau. Pour éviter toute contamination croisée, il est essentiel que l'équipement de fabrication de granulés est nettoyé à fond avec de l'éthanol 70% avant et après la fabrication de chaque type de pastille.
- En utilisant une échelle d'analyse et de peser papier, mesurer la quantité désirée de poudre d'hormone / médicament. Environ 5% de matière supplémentaire est recommandé pour accueillir perte pendant le pressage.
- Certains médicaments nécessitent des hormones / un agent de liaison ou agent de remplissage, qui est mélangé avant d'un culot fabrication. Par exemple, pour la fabrication d'une pastille de 2,5 mg de 17β-estradiol, l'hormone combiner avec 22,5 mg de cholestérol, ce qui résulte en une pastille de 25 mg.
- Soigneusement transférer en jeu de matrices, lieu dans la presse et poussez le levier fermement pour comprimer culot. Utilisez une pression constante pour maintenir constante la surface sontà un rapport en volume.
- Suivant inverser le porte-matrice et pousser le levier vers le bas à nouveau pour libérer le culot.
- Inspectez culot de l'intégrité et de déterminer si la masse finale est à portée souhaitée. Une plage acceptable est une différence de ± 5% de la masse finale (par exemple, une plage acceptable pour une pastille de 25 mg est de 23,8 à 26,3 mg).
- Pellets peuvent être faites avant la chirurgie et stockés (conditions et la durée de stockage dépend de la stabilité de l'hormone ou médicament utilisé dans la fabrication de granulés). pastilles d'hormones peuvent être achetés comme une alternative à la fabrication culot. Achat granulés évite l'utilisation de médicaments de qualité inférieure pharmaceutiques car ils seront formulées et aggravés.
2. Préparation de cellules recombinantes xénogreffes
- Récolte et culture primaire souris mésenchyme urogénital (UGM) des cellules stromales de moins de 4 semaines avant d'être recueilli pour le comptage.
- Culture des lignées cellulaires immortalisées épithéliale de la prostate dans le fash habituelion et de recueillir pour le comptage. Pour cet exemple, la préparation de greffons cellulaires recombinantes par mélange de 100 000 cellules HPB-1 épithéliales par greffage avec 250 000 cellules stromales UGM par greffage en suspension.
- cellules à granules ensemble et re-suspendre suffisamment Type neutralisé une queue de rat collagène pour faire nombre désiré de greffons, chacun dans un volume de 25 pi à 50 pi.
- Réglez greffes recombinants à 37 ° C pendant 15 minutes et puis couvrir avec un milieu de croissance pour le stockage à 37 ° C pendant jusqu'à 48 heures avant la greffe.
3. Préparation de xénogreffes de tissus
- Maintenir les précautions universelles pour pathogènes à diffusion hématogène pendant l'obtention de tissus et de la procédure chirurgicale. Après l'approbation du comité d'examen institutionnel et consentement éclairé, obtenir des tissus de la prostate frais de résection chirurgicale. Pour les études de la croissance de la BPH, les tissus peuvent être récoltées à partir de la résection transurétrale de la prostate ou de prostatectomie procédures simples. Xénogreffes primaires d'érythroblastopénie ou prost bénignemangé tissu peut être obtenue à partir d'échantillons de prostatectomie radicale.
- Magasin récolté tissu dans les médias de cellules tamponnées isotoniques ou une solution saline normale sur la glace. En fonction des conditions de tissus et de stockage, les échantillons peuvent être stockés pendant jusqu'à 24 heures avant la préparation de greffons tissulaires. La pratique courante consiste à diviser l'échantillon en trois morceaux, avec une partie fixe dans le formol et systématiquement traités pour l'histologie, une pièce congelé instantanément pour l'analyse moléculaire et une pièce divisée en xénogreffes de tissus (1-3 mm en taille).
4. Préparation du feu poli verre pipette
- Le port de gants résistants aux lunettes de protection, blouse de laboratoire et de la chaleur, le lieu verre Pasteur pointe de la pipette dans le bec Bunsen flamme à un angle d'environ 60 ° pour commencer.
- Gardez un, léger mouvement constant à la pipette de manière à éviter les points chauds.
- Dessiner la pointe fine et feu-polissez l'objectif étant une fin légèrement incurvé avec une forme arrondie, fermée pointe. 5. Préparation des instruments et bloc opératoire
- Autoclave tous les instruments. Avant la chirurgie, inspecter tous les instruments, en prenant soin de maintenir un champ stérile.
- Mettre en place la zone chirurgicale stérile avec des coussins absorbants, dissection étendue, nez anesthésie cône, des instruments chirurgicaux et lampe de chauffage dirigé vers la zone de travail. Pour stériliser dans des outils entre les souris, préchauffer stérilisateur à billes.
- Assembler et appareils d'anesthésie d'essai; peser évacuation de gaz.
- En utilisant les micro-ondes, tampons de cire de chaleur pour un maximum de 5 min (par incréments de 1 min, le pétrissage de la plaquette de cire afin de combiner fondu et fondue de cire) à 70-80% de la puissance, jusqu'à ce que toute la cire est uniformément fondu. Par le toucher, assurer le pad n'est pas trop chaud et de lieu dans le vide récupération de rongeur cage.
- Don équipement de protection individuelle pour les interventions chirurgicales, y compris les rongeurs masque chirurgical, bonnet, gants et blouse.
- Toutes les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées avec l'approbation des comités de protection des animaux dans les institutions et l'utilisation. Avant l'induction de l'anesthésie, observer la souris pour assurer la santé et le bien-être.
- Placez la souris dans la chambre pour l'induction de l'anesthésie isoflurane à 3-5%. Lorsque l'animal a cessé de bouger et la fréquence respiratoire a diminué, transfert à cône en position couchée, et maintenir une anesthésie à 1-3%.
- Si nécessaire, utilisez une tondeuse pour raser le dos de la souris. Ce n'est pas nécessaire lors de l'utilisation des souris athymiques nude (nu / nu).
- Appliquer une pression ferme sur la sangle de la patte arrière élargie pour évaluer l'adéquation de l'anesthésie. Si la souris répond à la pression, plus de temps est nécessaire pour l'anesthésie de prendre effet. Si nécessaire, ajuster le débit anesthésie légèrement pour atteindre une anesthésie adéquate.
- Lorsque la souris est anesthésiée manière adéquate, à désinfecter le site opératoire chirurgical avec de l'iode (Bétadine) en solution suivie d'70% d'alcool.
- Don Les gants et une blouse stérile; appliquer des champs stériles sur le site chirurgical. Soulevez la peau du dos avec une paire de pince à griffes, et en utilisant les ciseaux grossiers faire une incision médiane dorsale cm 2-3.
- Utilisation de ciseaux mousses ou une sonde, séparer le derme sous-jacent à partir de la paroi du corps (des deux côtés de l'incision pour le greffage ou bilatérale sur une face pour le greffage unilatéral).
- Repositionner la souris en position latérale, et identifier l'emplacement du rein par la visualisation du profil rénal à travers la paroi musculaire. En appliquant une pression manuelle douce avec le pouce et l'index sur l'abdomen peut aider à visualiser les organes internes.
- En utilisant des ciseaux fins de l'iris, et en prenant soin d'éviter les gros vaisseaux et les nerfs de la colonne vertébrale, faire une incision de 1 cm dans le mur corps parallèle à la colonne vertébrale. Élargir cette incision de 1,5-2,0 cm (un peu plus long que le grand axe du rein) en ouvrant doucement les ciseaux plus large après les plaçant dans l'incision initiale.
- Extérioriser le rein en appliquant une légère pression à l'extérieur de la paroi du muscle de part et d'autre du rein à l'aide de l'index et du pouce. Tuck bords de la peau au-dessous du rein extériorisé, qui repose sur la paroi du corps. Alors que le rein est extériorisé, maintenir l'hydratation de la capsule rénale en appliquant une solution saline stérile.
- Utilisation fines # 5 forceps soulevez doucement la capsule rénale de parenchyme du rein et avec un scalpel fin, faire une incision mm 2 -4 dans la capsule. La taille de l'incision est déterminée par la taille de la greffe, mais doit être minimisée afin de maintenir l'intégrité de la capsule.
- Manipuler une pipette Pasteur en verre qui a été établi mince et poli-feu avec une extrémité fermée arrondie sous la capsule tangentielle à la surface du rein. Ouvrez doucement une petite poche de la capsule pour les greffes, en utilisant le plus grand soin de ne pas endommager le parenchyme rénal.
- L'arête de coupe de la capsule du rein est soulevé avec les fines pinces, et le greffon is insérée dans la poche sous la capsule en utilisant la pipette en verre poli au feu. Plusieurs greffons peuvent être placés sous la capsule rénale et uniformément espacés sur la surface du rein.
- Si, au cours du greffage, la capsule se déshydrate, il doit être humidifiée par l'application d'une solution saline stérile.
- Lorsque le greffage est terminée, soulever légèrement les côtés de l'incision de la paroi musculaire de remplacer le rein en arrière dans la cavité du corps. Observez que les greffes ne glissent pas de sous la capsule.
- Fermez la paroi musculaire avec une seule suture (4-0, FS-2 vicryl suture). L'intervention chirurgicale peut être répété sur le rein controlatéral par le repositionnement de la souris.
- Lorsque le greffage est terminée, la souris peut subir sous-cutanée culot implantation au cours de la même intervention chirurgicale (Voir Protocole étape 7).
- En utilisant une pince à griffes, alignez les bords de l'incision de la peau et appliquer 2-3 des agrafes chirurgicales pour fermer l'incision. Administrer l'analgésie (nous utilisons 5-10 mg / kg carprofen utilisant une injection sous-cutanée) et placez la souris dans la position couchée sur le côté dans la cage de récupération. Assurer le maintien de la température du corps avec de la chaleur provenant d'une lampe ou un coussin chauffant. Observer pour une restauration complète de la souris, ce qui devrait se produire en moins de 15 minutes.
- Souris devraient être observés pour le 24 heures suivant les signes de la douleur post-opératoire, le saignement et / ou d'autres complications. Inspectez régulièrement incision chirurgicale des signes d'infection.
- Retirer des agrafes avec dispositif d'attache de la plaie de l'ablation chirurgicale 7-14 jours après la chirurgie.
- Répétez les étapes 6.1-6.5 de capsule rénale xénogreffes intervention chirurgicale.
- Soulevez la peau du dos avec une paire de pinces de la peau, et en utilisant les ciseaux grossiers faire une incision médiane dorsale cm 1-2.
- Avec des ciseaux émoussés ou une sonde, séparer le derme sous-jacentes de la paroi du corps dans une direction crânienne.
- En utilisant des pinces de la peau,soulevez doucement l'aspect crânienne de l'incision de la peau, et tenant le culot de l'hormone doucement avec droites, pinces dentelées, insérer le culot et libérer à la peau du cou, dans la poche que vous avez créé avec la sonde émoussée.
- Répétez les étapes 6.18 à 6.20 de la capsule rénale xénogreffes intervention chirurgicale. Si vous effectuez sous-cutanée culot implantation uniquement, utilisez une pince chirurgicale plaie à refermer l'incision chirurgicale.
6. Intervention chirurgicale: Capsule rénale xénogreffe
7. Intervention chirurgicale: sous-cutanée Pellet Implantation
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Representative Results
En fonction de l'hypothèse à tester, capsule rénale xénogreffe de recombinants de tissus ou de cellules peut être effectuée en vase clos ou sous-cutanée en combinaison avec l'hormone culot implantation. Un schéma d'une expérience hypothétique combinant rénale expérience capsule de xénogreffe sous-cutanée de l'hormone culot implantation est illustrée sur la figure 1. Une variété de substances pulvérulentes et / ou cristallins peut être utilisé dans la fabrication de pastilles comprimées avec la presse à pellets. Figure 2 montre 25 mg, 12 mg et 6 mg de pastilles comprimées d'hormones.
La figure 3 montre un exemple de la pipette en verre poli au feu utilisé pendant la procédure chirurgicale. Plusieurs passages d'une pipette Pasteur en verre par un bec Bunsen flamme entraînent une pointe polie au feu, arrondi qui est utilisé pour créer une poche pour les greffes sous la capsule rénale et de manipuler les greffes sous la capsule rénale.
ntent "> Comme le montre la figure 4, des xénogreffes de tissus primaires provenant de patients atteints de HBP, complété avec de la testostérone exogène (25 mg de pastilles sous-cutanée) pour simuler le milieu hormonal humain mâle, à survivre et à l'architecture tissulaire est conservé (Figure 4A). également représenté sur la Figure 4, rénale capsule greffage peut être utilisé pour évaluer la carcinogenèse hormonale. recombinants cellulaires contenant l'épithélium prostatique bénigne (BPH-1) et mésenchyme urogénital inductif (UGM) cultivés dans des souris non traitées forment des tumeurs bénignes (figure 4B). est de même greffés, cultivés en un hôte qui a reçu des pastilles d'hormones sous-cutanées de 25 mg et 2,5 mg T E 2 pendant quatre mois, se développe dans la prostate cancer qui envahit la capsule rénale (figure 4C) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figure 1. Schéma de la xénogreffe de la capsule rénale et culot procédure d'implantation. Capsule rénale xénogreffe est réalisée par l'intermédiaire d'une approche de la ligne médiane dorsale. Au cours de la même intervention chirurgicale, la souris est implanté chirurgicalement avec libération lente hormone comprimé sous-cutanée et / ou des pastilles de médicament dans la région du cou nuque.
Figure 2. Exemples de pastilles d'hormones comprimés fabriqués avec le présent protocole. A. 12 mg granulés. B. 6 mg granulés. C. 25 mg granulés.
Figure 3. Fire-poli pipette Pasteur en verre. L'pipette fini est courbe, avec une pointe lisse arrondie apte à créer une cloqueet pour la xénogreffe sous la capsule rénale. La pipette est également utilisé pour manipuler le greffon sous la capsule rénale.
Figure 4. Exemple de xénogreffes de capsule rénale. A. xénogreffes de tissus (pointes de flèche) de tissu de BPH humain sont cultivées pendant un mois sous la capsule rénale d'une souris mâle nu. L'hôte de la souris est additionné de 25 mg de testostérone culot de simuler le milieu hormonal du mâle humain. B. cellulaires xénogreffes recombinants (têtes de flèche) contenant lignée humaine de la prostate des cellules épithéliales (BPH-1) et mésenchyme urogénital inductif (UGM) cultivées sous la rénale capsule d'une souris nude qui a été implanté avec des pas d'une pastille de l'hormone sous-cutanée pendant quatre mois. C. Cellule de xénogreffe recombinant contenant BPH-1 et UGM, cultivées sous la capsule rénale d'une souris nude qui a également subi subimplantation cutanée pastille de 25 mg de testostérone et 2,5 mg 17β-estradiol pendant quatre mois.
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Discussion
Ce document et le protocole décrit ici décrivent la fabrication de l'hormone comprimé et / ou granulés de drogue, et la procédure chirurgicale pour sous-cutanée culot implantation de souris. Selon la question de recherche à traiter, cette technique peut être réalisée individuellement ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de cellules de la prostate greffes recombinantes ou des xénogreffes de tissus de la prostate, qui sont des techniques largement utilisées dans la recherche de la prostate 17-19. Pris ensemble, ces techniques offrent une approche puissante pour étudier la cancérogenèse hormonale et régulation de la croissance bénigne de la prostate de l'homme et de la souris.
Fabrication Pellet est simple à réaliser, facilement reproductible, et nécessite un équipement limité. Elle peut être appliquée à diverses préparations d'hormones et de médicaments. Il est essentiel d'effectuer cette technique dans une hotte de sécurité chimique, et porter un équipement de protection individuelle approprié. Pour les expériences évaluant la carcinogenèse prostatique unee induction d'anticorps murins obstruction de la vessie, nous utilisons 25 mg et 2,5 mg T E 2 5,7,15. Ces doses sont choisies parce qu'elles produisent l'souhaitée en réponse in vivo et parce qu'elles créent des niveaux sériques d'hormones qui sont physiologiquement pertinent pour les mâles humains avec le processus de la maladie d'intérêt 6. moules à granules permettent différentes tailles de granulés à fabriquer, nous utilisons généralement 25 mg granulés pour évaluer la carcinogenèse et la croissance bénigne. Le choix de la taille des pastilles dépend de l'hypothèse à traiter, ainsi que la production de l'effet désiré, la production de taux circulants d'arrivée et la durée de l'expérience. Si médicament ou l'hormone est combiné avec un agent de liaison (tel que le cholestérol), nous recommandons un mélange homogène de l'hormone et de liant.
Selon l'étude, sous-cutanée culot implantation peut être réalisée suivant la castration de l'hôte mâle 15. Dans notre expérience,implantation de 25 mg de T provoque la rétro-inhibition de l'axe hypothalamo-hypophyso-testiculaire, l'inhibition de la sécrétion endogène. C'est pourquoi on choisit de comparer des souris traitées avec 25 mg de T pour simuler l'environnement de l'androgène humain de sexe masculin pour les mâles intacts, mais non traités, avec T la sécrétion endogène maintenu. Nous n'utilisons pas systématiquement une foule de castration en raison de la réponse atrophique de la prostate et de la prostate xénogreffes de retrait des androgènes.
Ce protocole décrit également la création d'une pièce d'équipement spécialisé pour rénale xénogreffe de capsule, la pipette Pasteur en verre poli-le-feu. Ceci peut être facilement réalisé avec l'équipement présent dans la plupart des laboratoires, ce qui entraîne un instrument chirurgical sur mesure que ce qui peut être fabriqué et stérilisé avant son utilisation dans la procédure chirurgicale. Le port de l'équipement de protection personnelle est importante pour assurer la sécurité du personnel lors de la création de la pipette en verre poli-feu.
Avant embarking sur l'une des procédures chirurgicales décrites dans le présent protocole, toutes les techniques doivent être examinés et approuvés par le comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. Les procédures chirurgicales effectuées chez les rongeurs ont besoin de formation et de la pratique dans les aspects techniques de la procédure, ainsi que les principes et la pratique de la technique aseptique. Pour une introduction à l'équipement et les techniques important dans ces procédures, nous vous recommandons personnel voir le manuscrit vidéo récemment rapporté par Prichett-Corning et al. (2011) 20. Nous vous recommandons également tous les employés reçoivent une formation pratique dans les interventions chirurgicales de rongeurs et une technique aseptique.
Dans notre laboratoire, ces procédures sont généralement effectuées avec deux membres du personnel. L'assistant chirurgical administre l'anesthésie, observe les animaux pendant la récupération, assiste le chirurgien des aspects non-stériles de la procédure et documente toutes les procédures. Le chirurgien maintient le champ stérile, administre une analgésiee effectue les procédures chirurgicales décrites dans le présent protocole. Avec une planification et une formation adéquate, l'intervention chirurgicale sous-cutanée hormone culot implantation est simple et facile à réaliser.
Il ya plusieurs considérations de conception expérimentale pour cellule xénogreffe recombinant. Comme avec toutes les expériences utilisant des lignées cellulaires immortalisées, la contamination est important de minimiser et détecter. Pour les expériences à l'aide de l'HBP une des lignées cellulaires, nous recommandons un numéro de passage faible (moins de 25). Pour contrôler les effets du stroma, nous utilisons les greffes ne contenant que des cellules BPH-1 pour un rein et les greffes contenant BPH-1 et UGM sur le rein controlatéral. Pour les expériences visant à répondre carcinogenèse hormonale, nous avons généralement une condition témoin non traité (la souris n'est pas implanté avec une boulette, ou est implanté avec une boulette de cholestérol). Les contrôles positifs (souris hôte est implanté avec T + E 2 pastilles) sont également importants lors de l'évaluation d'autres conditions that peut favoriser la carcinogenèse avec ce système de modèle. Selon la question de recherche à traiter, la durée de l'implantation de granulés et / ou la croissance de xénogreffes peut varier de quelques semaines à quatre mois; des expériences prévues à excéder quatre mois, nous vous recommandons de culot supplémentaire implantation de maintenir les niveaux d'hormones exogènes. Pour les expériences impliquant des xénogreffes de tissus bénins de la prostate, il est important de porter un équipement de protection adéquat, et de maintenir les précautions universelles pour pathogènes à diffusion hématogène. Tissu fraîchement récolté peut être stocké avant xénogreffes de 12-72 heures.
La technique chirurgicale pour rénale capsule xénogreffe nécessite une planification, la pratique et une certaine dextérité manuelle. Minimiser la durée de l'intervention chirurgicale, le maintien de la température du corps et la technique chirurgicale minutieuse peut atténuer la mortalité périopératoire et des complications chirurgicales. Le risque de décès péri-opératoire dans notre expérience augmente avec la durée de la suprocédure rgical, pour cette raison nous limitons l'intervention chirurgicale à plus de 20-25 min. Utilisation d'une lampe de chauffage et tampon de cire chauffée pendant la chirurgie et la récupération est idéal pour le maintien de la température du corps. Soins post-opératoires de routine est un autre aspect important de la réussite de cette technique. Souris doivent être observées lors de la récupération d'anesthésie, et le jour suivant la chirurgie des signes de douleur et de détresse. Administrer une analgésie appropriée pour minimiser la douleur postopératoire et la détresse.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Ricke, passés et présents. Nous remercions Calvin Patten, Jr., DVM et Brigitte Raabe, DVM, des commentaires utiles sur le protocole. Nous tenons à remercier le NIDDK, NCI, et NIEHS pour leur soutien financier pour ces études: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN est un stagiaire dans le Programme de formation scientifique médicale à l'Université de Rochester financé par le NIH GM07356 T32, le NIH sous Ruth L. Kirschstein Prix national F30DK093173 Service de recherche soutient également ce projet. CDV est soutenu par T32CA157322 et ABT est soutenu par T32ES007015 à l'Université de Wisconsin-Madison. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national des sciences médicales générales ou NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
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