Summary
Vi beskriver fremstillingen av komprimerte hormon pellets, samt subkutan kirurgisk implantering i mus. Denne strategi kan kombineres med veksten av celler og vev xenografts under nedsatt kapsel av atymiske nakne mus for å evaluere hormonell karsinogenese og regulering av godartet prostatavekst.
Abstract
Nye behandlingsformer for to vanlige prostatasykdommer, prostatakreft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH), er kritisk avhengige eksperimenter evaluere deres hormonelle regulering. Sex steroidhormoner (spesielt androgener og østrogener) er viktig i PRCA og BPH, vi sondere sine respektive roller i indusere prostata vekst og karsinogenese hos mus med eksperimenter ved hjelp av komprimert hormon pellets. Hormon og / eller narkotika pellets er lett produseres med en pellet press, og implantert i det subkutane vevet av den mannlige mus vert. Vi beskriver også en protokoll for evaluering av hormonelle carcinogenesis ved å kombinere subkutan hormon pellet implantasjon med xenografting av prostata celle rekombinantar under nedsatt kapsel av immunsupprimerte mus. Videre subkutan hormon pellet implantering, i kombinasjon med nedsatt kapsel xenografting av BPH vev, er nyttig for å få en bedre forståelse hormonell regulering av godartet prostspiste vekst, og for å teste ut nye behandlingsformer rettet mot sex steroid hormon trasé.
Introduction
Prostatakreft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH) er betydelige helsemessige byrder. PRCA er den nest mest utbredte solid organ kreft hos menn og en ledende årsak til kreft dødsfall ett. BPH er også svært utbredt blant eldre menn, og det er anslått at den kliniske manifestasjon av BPH, nedre urinveissymptomer (LUTS), vil påvirke 50-90% av mennene to. Mens androgener og østrogener er kjent for å være viktig i PRCA og BPH, vår forståelse av de hormonelle mekanismer som ligger til grunn karsinogenese og veksten er fortsatt ufullstendig 3,4. Enkle og genetisk medgjørlig dyremodeller underbygge de studiene som vil løse disse prioriteringene i prostata forskning. I hormon responsive sykdommer som Erytroaplasi og BPH, bruk av subkutan, langsom frigjøring hormon pellets, alene eller i kombinasjon med nedsatt kapsel xenografting (overføring av celler, vev eller organer fra en art til en annen) inn i immunocompromised mus vert, gir en enkel og reproduserbar fremgangsmåte for å studere hormonelle regulering av vekst og carcinogenese.
Subkutan hormon pellet implantering er en enkel og reproduserbar teknikk for å studere hormonell regulering av karsinogenese og godartet prostata vekst i 5. Subkutan implantasjon av voksne mannlige mus med 25 mg testosteron (T) og 2,5 mg 17β-østradiol (E 2), fører til en økning i serum E 2 og gradvis reduksjon i T, gjenskape den dynamiske hormonelle miljøet i aldrende menn 5,6. I tillegg sammenfatter denne modellen mange av de kliniske symptomene på BPH-LUTS 5,7. Alternative metoder for hormon administrering inkluderer oral / gavage administrering eller intraperitoneal injeksjon, noe som forårsaker ubehag for gnagere, er mindre konsistent i å levere den samme mengde av medikament over tid, og er mer arbeidskrevende enn en engangs kirurgisk implantering. Andre subkutane moduser for hormone og / eller levering av legemidler omfatter Silastic kapsler åtte. Mens vi har også erfaring med bruk av Silastic kapsler, er komprimert pellets favoriserte for sin brukervennlighet og reproduserbarhet. Videre utslippsrater på komprimert hormon pellets bedre etterligne de dynamiske sex steroid hormon intervallene som observeres i aldring menn 5,7.
Siden utviklingen av genetisk immunkompromitterte mus, har tallrike in vivo-modellsystemer som omfatter xenografting teknikker blitt utviklet for studiet av en rekke normale og syke vev. Det er flere grunnleggende kategorier av xenografting. Tissue xenografts består av et lite stykke av intakt vev, som kan være en vanlig struktur, ondartet tumor, eller godartet vekst. Szot et al. (2007) har nylig opplyst nedsatt kapsel xenografting av bukspyttkjertelen holmer ni. Aamdal et al. (1985) beskrev nedsatt kapsel xenografting av 27 menneske kreftcellelinjer i immunocompromised mus vert 10. Grafts kan også være sammensatt av en eneste udødeliggjort cellelinje (kreft eller ikke-tumorigen), eller kan bestå av en udødeliggjort cellelinje kombinert med celler isolert fra mesenchyme (celle rekombinant graft).
Vi favorisere xenografting av celle rekombinantar å sondere de respektive rollene til stroma og epitel i utviklingen av PRCA og BPH. Cunha et al. (1980) var den første til å rapportere at når voksen murine blære epitel er kombinert med embryonale urogenitale sinus mesenchyme (UGM) og xenografted under nedsatt kapsel av hannmus verter, utvikler vevet inn i strukturer som ligner prostata acini 11. Norman et al. (1986) viste at voksne mus prostata ductal epitel og UGM, når kombinert i vev rekombinantar, gjennomgå ductal vekst og forgrening morphogenesis 12. Hayward et al. (1988) viste at menneskelig prostata epitel reagerer på Induktive foster mesenchyme på en lignende måte 13. En hormonell modell av karsinogenese i prostata, ved å kombinere den udødeliggjort human prostata epitelisk cellelinje BPH-en med UGM, ble først rapportert av Wang et al. 14. (2001) og har vært brukt i stor utstrekning i vårt laboratorium 15.. Denne modellen er godt egnet for å forstå PRCA progresjon fordi benign prostatahyperplasi epitel forvandles til metastatisk sykdom, modellering avansert PRCA hos mennesker fem. Fordi enkelte komponenter kan være genetisk manipulert, er spesielt nyttig som en metode for å evaluere stromal-epitelial celle interaksjoner rekombinant poding.
Andre områder egnet for xenografting er intradermal, subkutan og ortotopiske steder 16. Avhengig av vev og sykdomsprosessen av interesse, kan disse være egnede alternative tilnærminger. For studiet av prostata hormonell karsinogenese og godartet vekst regulering, velger vi den nyre kapselstedet for xenografting på grunn av sin høyere pode ta sats, rikelig blodtilførsel, og evne til å implantere et større antall xenografts til ett begrenset område 16. Videre begrenser hormonell manipulering av verts mus som resulterer i prostata atrofi bruk av prostata orthotopic poding 16..
Denne protokollen beskriver teknikker for komprimert hormon / medikament pellet fremstilling og kirurgisk implantering, så vel som nedsatt kapsel xenografting av human prostataceller og vev grafts. Sammen utgjør disse teknikkene gir en følsom analyse for å bestemme om en genetisk modifiserte mus er mer utsatt for Erytroaplasi og / eller BPH initiering enn kontrollstammer. Xenografting er en kraftfull teknikk for in vivo-evaluering av potensialet for eksperimentelle celler til å utvikle histologisk og molekylære trekk ved ondartet sykdom, så vel som et assay for nye behandlingsstrategier for et bredt utvalg av godartede og ondartede sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av komprimert hormon / Drug Pellet
- Denne prosedyren bør gjøres i en kjemisk sikkerhetshette mens iført en laboratoriefrakk, hansker, maske, vernebriller, og panser. For å unngå kryss-smitte, er det avgjørende at pellet making utstyr er grundig rengjort med 70% etanol før og etter produksjon av hver type pellet.
- Ved hjelp av en analytisk skala og veie papir, måle ønsket mengde hormon / narkotika pulver. Omtrent 5% ekstra materialet er anbefalt å imøtekomme tap under pressing.
- Noen hormoner / legemidler krever et bindemiddel eller fyllstoff, som blandes før pellet fremstilling. For eksempel, for å fremstille en 2,5 mg pellet av 17β-østradiol, kombiner hormonet med 22,5 mg kolesterol, noe som resulterer i en 25 mg pellet.
- Forsiktig i die sett, plass under trykk og skyv spaken hardt ned å komprimere pellet. Bruk i samsvar trykk for å opprettholde konstant overflate finnesen til volumforhold.
- Neste reversere die holderen og skyve spaken ned igjen for å frigjøre pellet.
- Inspiser pellet for integritet og avgjøre om endelig masse er innenfor ønsket område. Et akseptabelt område er ± 5% forskjell i den endelige masse (for eksempel, er et akseptabelt område for en 25 mg pellet 23,8 til 26,3 mg).
- Pellets kan gjøres før kirurgi og lagret (forhold og lengde er avhengig av lagringsstabilitet av hormonet eller stoffet som brukes i pellet fremstilling). Hormon pellets kan kjøpes som et alternativ til pellets produksjon. Innkjøp pellets unngår bruk av ikke-farmasøytiske grade narkotika siden de vil bli formulert og forsterket.
2. Utarbeidelse av Cell Rekombinant xenografts
- Harvest og kultur muse urogenitale mesenchyme (UGM) stromale celler for mindre enn fire uker før de ble samlet inn for telling.
- Kultur udødelig prostata epitelial cellelinjer i den vanlige fashion og samle for telling. For dette eksempelet, forberede celle rekombinante grafts ved å blande 100 000 BPH-en epitelceller per pode med 250000 UGM stromale celler per pode i suspensjon.
- Pellet-celler sammen og re-suspendere i tilstrekkelig nøytralisert type 1 rottehale kollagen for å gjøre ønskede antall grafts, hver i et volum på 25 pl til 50 pl.
- Sett rekombinante grafts ved 37 ° C i 15 minutter og deretter dekke med vekstmedium for lagring ved 37 ° C i opp til 48 timer før poding.
Tre. Utarbeidelse av Tissue xenografts
- Opprettholde universelle forholdsregler for blodbårne patogener under vev innkjøp og kirurgisk prosedyre. Etter Institutional Review Board godkjennelse og informert samtykke, få frisk prostata vev fra kirurgisk reseksjon. For studier av BPH vekst, kan vev høstes fra transurethral reseksjon av prostata eller enkle prostatektomi prosedyrer. Primære xenografts av PRCA eller godartet prostspiste vev kan fås fra radikal prostatektomi prøver.
- Oppbevares høstet vev i isoton bufret celle media eller fysiologisk saltvann på is. Avhengig av vev-og lagringsforhold, kan prøvene oppbevares i inntil 24 timer før tilberedning av vev grafts. Vanlig praksis er å dele prøven i tre deler, med en del fast i formalin og rutinemessig behandlet for histologi og kul grafikk frosset for molekylær analyse og ett stykke videre delt inn i vev xenografts (1-3 mm i størrelse).
4. Utarbeidelse av brann polert glass Pipetter
- Iført vernebriller, laboratoriefrakk og varmebestandige hansker, sted glass Pasteur pipette spissen inn bunsenbrenner flamme på ca 60 ° vinkel for å starte.
- Holde en konstant, liten bevegelse til pipetten for å unngå hot spots.
- Tegn tynt tips og brann-polish med mål å være en litt buet ende med en avrundet, lukket tips. 5. Klargjøring av instrumenter og Kirurgisk Suite
- Autoklaver alle instrumenter. Før kirurgi, inspisere alle instrumenter, ta vare å opprettholde sterile feltet.
- Sett opp sterilt kirurgisk område med absorberende pads, disseksjon omfang, anestesi nese kjegle, kirurgiske instrumenter og varmelampe rettet mot arbeidsområdet. Å sterilisere verktøy i mellom mus, prewarm perle sterilisator.
- Montere og teste anestesi-apparater; veie gass åtseldyr.
- Ved hjelp av mikrobølge, varmevoks elektrodene i opp til 5 minutter (i 1 minutts intervaller, elting voks puten for å kombinere smeltet og ikke-smeltet voks) ved 70-80% kraft, inntil all voks er jevnt smeltet. Ved berøring, sikre puten ikke er for varmt og plass under den tomme gnager utvinning bur.
- Don personlig verneutstyr for gnagere kirurgiske prosedyrer, inkludert kirurgisk maske, panser, hansker og kappe.
- Alle prosedyrer som involverer forsøksdyr skal utføres med godkjenning av institusjonell dyr omsorg og bruke komiteer. Før induksjon av anestesi, observere musen for å sikre helse og trivsel.
- Plasser musen inn i kammeret for induksjon av isoflurananestesi på 3-5%. Når dyret har sluttet å bevege seg og respirasjonsfrekvens har gått ned, overføre til nese kjegle i liggende stilling, og opprettholde anestesi ved 1-3%.
- Om nødvendig, bruk clippers å barbere baksiden av musen. Dette er ikke nødvendig når utnytte atymiske nude (nu / nu) mus.
- Trykk hardt til webbing av den utvidede bakfot å evaluere tilstrekkeligheten av anestesi. Hvis musen reagerer på trykk, tar det lengre tid for anestesi skal tre i kraft. Juster om nødvendig anestesi flyt litt for å oppnå tilstrekkelig anestesi.
- Når musen er tilstrekkelig bedøvet, desinfisere operasjonsstedet med kirurgisk jod (Betadine), etterfulgt av70% alkohol.
- Don sterile hansker og kappe; gjelde sterile forheng til operasjonsstedet. Løft tilbake huden med et par tann tang, og med grov saks foreta en 2-3 cm dorsal midtlinjen snitt.
- Ved hjelp av en saks eller butte en sonde, skiller de underliggende dermis fra kroppen vegg (på begge sider av innsnittet for bilateral pode eller på den ene side for ensidig poding).
- Reposisjonere musen i sideleie, og identifisere plasseringen av nyre ved å vise den nyreprofil gjennom muskelveggen. Bruk av milde manuell press med tommelen og pekefingeren på magen kan hjelpe til med å visualisere indre organer.
- Ved hjelp av gode iris saks, og ta vare å unngå store fartøy og spinal nerver, lage en 1 cm snitt i kroppen veggen parallelt med ryggraden. Utvide dette snittet til 1,5-2,0 cm (litt lengre enn den lange aksen av nyre) ved å forsiktig åpne saksen bredere etter å plassere dem i den første innsnitt.
- Exteriorize nyrene ved å påføre forsiktig trykk utenfor muskelveggen på hver side av nyrene ved hjelp av pekefinger og tommel. Tuck huden kanter under exteriorized nyre, som vil hvile på den kroppsveggen. Mens nyrene er exteriorized, vedlikeholde hydrering av nyre kapselen ved å bruke sterilt saltvann.
- Bruke fin # 5 tang løfte forsiktig nyrene kapselen fra parenchyma av nyre og med en fin skalpell, lage en 2 -4 mm snitt i kapselen. Størrelsen av innsnitt er bestemt av størrelsen av pode, men bør være minimalisert for å opprettholde integriteten av kapselen.
- Manipulere en glass Pasteur pipette som er blitt trukket tynn og ild-polert med en avrundet lukket ende under kapselen tangential til overflaten av nyrene. Åpne forsiktig en liten kapsel lomme for grafts, bruker stor forsiktighet for ikke å skade nyrene parenchyma.
- Snittet kant av nyre kapselen løftes med fin pinsett, og pode ir satt inn i lommen under kapselen ved hjelp av flamme-polert glass-pipette. Flere grafts kan plasseres under nyrekapselen og jevnt fordelt på nyrene overflate.
- Dersom det i løpet av podingen, blir dehydrert i kapselen, bør det fuktes ved å anvende sterilt saltvann.
- Ved poding er fullført, forsiktig løfte sidene av muskelveggen innsnitt for å erstatte nyrene inn i kroppens hulrom. Observer at grafts ikke sklir ut fra under kapselen.
- Lukk muskel veggen med et enkelt sutur (4-0, FS-2 Vicryl sutur). Den kirurgiske prosedyren kan gjentas på motsatt nyre ved å flytte musen.
- Ved poding er fullført, kan muse gjennomgå subkutan implantasjon pellet i løpet av samme kirurgiske prosedyren (Se protokoll trinn 7).
- Ved hjelp av tann tang, justere huden innsnitt kanter og påfør 2-3 kirurgiske klipp sår å lukke såret. Administrer analgesi (vi bruker 5-10 mg / kg carprofno bruker en subkutan injeksjon) og plassere musen i stabilt sideleie i utvinningen buret. Sørg for vedlikehold av kroppstemperatur med varme fra en lampe eller oppvarming pad. Legg merke til full gjenoppretting av musen, som bør forekomme i mindre enn 15 minutter.
- Mus bør observeres for de neste 24 timer for tegn på postoperativ smerte, blødning og / eller andre komplikasjoner. Inspiser kirurgisk innsnitt for tegn på infeksjon.
- Fjern sår klipp med operasjonssåret klipp fjerning enhet 7-14 dager etter operasjonen.
- Gjenta trinn 06.01 til 06.05 fra nedsatt kapsel xenografting kirurgisk prosedyre.
- Løft tilbake huden med et par skin tang, og med grov saks foreta en 1-2 cm dorsal midtlinjen snitt.
- Ved hjelp av en saks eller butte en sonde, skiller de underliggende dermis fra kroppen veggen i en cranial retning.
- Ved hjelp av hud tang,Løft forsiktig kranie aspektet av huden innsnitt, og holder hormonet pellet forsiktig med rette, profilerte tang, setter pellet og slipp på nakkeskinnet, i lommen du opprettet med den butte sonde.
- Gjenta trinn 06.18 til 06.20 fra nedsatt kapsel xenografting kirurgisk prosedyre. Hvis du utfører subkutan pellet implantasjon bare bruke en kirurgisk klipp såret å lukke kirurgiske inngrep.
6. Kirurgisk prosedyre: Nedsatt Capsule Xenografting
7. Kirurgisk prosedyre: Subkutan Pellet Implantasjon
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avhengig av den hypotese som skal testes, kan renale kapselen xenografting av vevs-eller celle rekombinanter utføres isolert eller i kombinasjon med subkutan hormon pellet implantasjon. En skjematisk av en hypotetisk eksperiment kombinere renal kapsel xenografting eksperiment med subkutan hormon pellet implantasjon er illustrert i figur 1.. En rekke pulverformede og / eller krystallinske stoffer kan anvendes til fremstilling av sammenpressede pellets med en pellet-presse. Figur 2 viser 25 mg, 12 mg og 6 mg komprimerte hormon pellets.
Figur 3 viser et eksempel på brann-polert glass-pipette brukes under den kirurgiske prosedyren. Flere går av et glass Pasteur pipette gjennom bunsenbrenner flamme resultere i en brann-polert, avrundet spiss som brukes til å lage en lomme for grafts under nedsatt kapsel og å manipulere grafts under nedsatt kapsel.
ntent "> Som vist i figur 4, primære xenografts vev fra pasienter med BPH, supplert med eksogen testosteron (25 mg subkutan pellet) for å simulere den mannlige menneskelige hormonelle miljøet, overleve og vevet arkitekturen er bevart (figur 4A). Også vist i figur 4, kan renale kapselen pode brukes til å evaluere hormonell carcinogenesis. Cell rekombinanter innehold benign prostata epitel (BPH-1) og induktiv urogenital mesenchyme (UGM) dyrket i ubehandlede mus danne godartet vekster (figur 4B). Samme pode, dyrket i en vert som fikk subkutane hormon pellets av 25 mg T og 2,5 mg E 2 i fire måneder, utvikler seg til prostata karsinom som invaderer nedsatt kapsel (Figur 4C) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk av nyre kapsel xenografting og pellet implanteringsoperasjon Nedsatt kapsel xenografting er utført via en ryggmidtlinjen tilnærming.. I løpet av det samme kirurgiske prosedyren blir mus implantert med sakte-frigjørende subkutan komprimert hormon-og / eller medikament pellets i nakken scruff region.
Figur 2. Eksempler på komprimerte hormon pellets produsert med det nåværende protokollen. A. 12 mg pellet. B. 6 mg pellet. C. 25 mg pellet.
Figur 3. Brann polert glass Pasteur-pipette. Den ferdige pipette er buet, med en glatt avrundet spiss egnet til å skape en pocket for xenograft under nedsatt kapsel. Pipetten blir også brukt til å manipulere pode under nedsatt kapsel.
Figur 4. Eksempel på nyrekapsel xenografts. Er A. Tissue xenografts (pilspisser) av menneskelig BPH vev dyrket for en måned under nedsatt kapsel av en naken mann mus. Musen verten er supplert med 25 mg testosteron pellet for å simulere den hormonelle miljø i det menneskelige male. B. Cell rekombinante xenografter (pilspisser) inneholdende human prostatic epitelisk cellelinje (BPH-1) og induktiv urogenital mesenchyme (UGM) dyrkes under nedsatt kapsel av en naken mus som ikke ble implantert med en subkutan hormon pellet i fire måneder. C. Celle rekombinant xenograft innehold BPH-1 og UGM, dyrkes under den renale kapselen i en naken mus som også gjennomgikk subkutane pellet implantasjon av 25 mg testosteron og 2,5 mg 17β-østradiol i fire måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret og protokollen beskrevet heri beskriver fremstillingen av komprimerte hormon-og / eller medikament pellets, og den kirurgiske prosedyre for subkutan implantasjon pellet av mus. Avhengig av problemstillingen tas opp, kan denne teknikken utføres enkeltvis eller i kombinasjon med nedsatt kapsel xenografting av prostata celle rekombinante grafts eller prostata vev xenografts, som er teknikker mye brukt i prostata forskning 17-19. Samlet utgjør disse teknikkene har en kraftfull tilnærming til å studere hormonelle kreftutvikling og regulering av godartet vekst i den menneskelige og mus prostata.
Pellet fremstillingen er enkel å utføre og lett reproduserbare, og krever begrenset utstyr. Den kan benyttes på forskjellige hormon og legemiddelpreparater. Det er viktig å utføre denne teknikken i en kjemisk sikkerhetshette, og bruke egnet personlig verneutstyr. For eksperimenter vurdere prostata carcinogenese ennd induksjon av murine blæreutløpsobstruksjon vi bruker 25 mg T og 2,5 mg E 2 5,7,15. Disse doser er valgt fordi de produserer den ønskede in vivo respons, og fordi de skaper serum hormonnivåer som er fysiologisk relevant for menneskelig menn med sykdomsprosessen av interesse 6. Pellets muggsopp tillate flere forskjellige størrelser av pellets som skal produseres, vi bruker vanligvis 25 mg pellets for å vurdere kreftutvikling og godartet vekst. Valg av pelletstørrelse, avhenger av den hypotese som skal behandles, så vel som produksjonen av en ønsket effekt, produksjon av ønskede sirkulerende nivåer og varigheten av eksperimentet. Dersom legemiddel-eller hormon er kombinert med et bindemiddel (som for eksempel kolesterol) anbefaler en homogen blanding av hormonet og bindemiddel.
Avhengig av studien, kan subkutan implantasjon pellet utføres følgende kastrering av mannlig vert 15.. I vår erfaring,implantasjon av 25 mg av T forårsaker tilbakemelding inhibering av hypothalamus-hypofyse-testikulær akse, inhibering av endogene sekresjon. Derfor velger vi å sammenligne mus behandlet med 25 mg T for å simulere den androgene miljøet i human male til intakte, men ubehandlede hanner, med endogent T sekresjon opprettholdes. Vi trenger ikke rutinemessig benytter en kastrera vert på grunn av atrofisk respons av prostata og prostata xenografts til androgen tilbaketrekking.
Denne protokollen beskriver også etablering av et stykke av spesialisert utstyr for nedsatt kapsel xenografting, brann-polert glass Pasteur pipette. Dette kan lett utføres med utstyr som er tilstede i de fleste laboratorier, noe som resulterer i en tilpasset kirurgisk instrument enn det som kan fremstilles og steriliseres før bruk i en kirurgisk prosedyre. Iført personlig verneutstyr er viktig for å sikre ansatte trygghet når du oppretter brann-polert glass pipette.
Før embarking på noen av de kirurgiske prosedyrer som er skissert i denne protokollen, må alle teknikker gjennomgås og godkjennes av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komité. Kirurgiske prosedyrer utført hos gnagere krever opplæring og praksis i både den tekniske aspekter av prosedyren, samt prinsippene og praktiseringen av aseptisk teknikk. For en innføring i utstyr og teknikker viktig i disse prosedyrene anbefaler vi ansatte vise videoen manuskript nylig rapportert av Prichett-Corning et al. (2011) 20. Vi anbefaler også alle ansatte får hands-on trening i gnager kirurgiske prosedyrer og aseptisk teknikk.
I vårt laboratorium, er disse prosedyrene vanligvis utføres med to ansatte. Operasjonsassistent administrerer anestesi, observerer dyr under utvinning, bistår kirurgen med ikke-sterile aspekter av prosedyren og dokumenterer alle prosedyrer. Kirurgen opprettholder det sterile feltet, forvalter analgesi ennd utfører de kirurgiske prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen. Med riktig planlegging og trening, er den kirurgiske prosedyren av underhudsfett hormon pellet implantasjon enkel og lett å utføre.
Det er flere eksperimentelle design hensyn til celle rekombinant xenografting. Som med alle eksperimenter som benytter udødeliggjorte cellelinjer, er forurensning viktig å minimere, og detektere. For eksperimenter med BPH-en cellelinjer, anbefaler vi en lav passasje nummer (mindre enn 25). For å kontrollere for virkningene av stroma, utnytter vi transplantater inneholdende bare BPH-1 celler for en nyre-og transplantater inneholdende BPH-1 og UGM på den kontralaterale nyre. Ved forsøk utformet for å løse hormonell karsinogenese, vi har vanligvis en ubehandlet kontrolltilstand (musen ikke implantert med en pellet, eller implanteres med en kolesterol pellet). Positive kontroller (host mus er implantert med T + E 2 pellets) er like viktige når man skal vurdere andre forhold that kan fremme kreftutvikling med denne modellen system. Avhengig av problemstillingen tas opp, kan varigheten av pellet implantasjon og / eller xenograft vekst varierer fra noen uker til fire måneder, for eksperimenter planlagt å overstige fire måneder, anbefaler vi ekstra pellet implantasjon å opprettholde eksogene hormonnivåer. For forsøk med benign prostata vev xenografts, er det viktig å bruke riktig personlig verneutstyr og opprettholde universelle forholdsregler for blodbårne patogener. Nyhøstet vev kan lagres før xenografting etter 12-72 timer.
Den kirurgiske teknikken for nedsatt kapsel xenografting krever planlegging, praksis og noen fingerferdighet. Minimering av varigheten av den kirurgiske prosedyre, opprettholde kroppstemperatur og forsiktig kirurgisk teknikk kan redusere perioperative dødelighet og kirurgiske komplikasjoner. Sjansen for perioperativ død i vår erfaring øker med varigheten av surgical prosedyre, på grunn av dette begrenser vi den kirurgiske prosedyren ikke lenger enn 20-25 min. Anvendelse av en varmelampe og varmet voks puten under operasjonen og gjenvinning er ideell for å holde kroppstemperaturen. Rutinemessig postoperativ omsorg er et annet viktig aspekt av suksessen med denne teknikken. Mus bør observeres under anestesi utvinning, og dagen etter operasjonen for tegn på smerte og nød. Gi hensiktsmessig analgesi å redusere post-prosessuelle smerte og nød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av Ricke lab, fortid og nåtid. Vi takker Calvin Patten, Jr, DVM og Brigitte Raabe, DVM, for nyttige kommentarer til protokollen. Vi ønsker å takke NIDDK, NCI, og NIEHS for sin økonomiske støtte til disse studiene: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN er en trainee i Medical Scientist Training Program ved University of Rochester finansiert av NIH T32 GM07356; NIH henhold Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 støtter også dette prosjektet. CDV er støttet av T32CA157322 og ABT er støttet av T32ES007015 ved University of Wisconsin-Madison. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute of General Medical Sciences eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
