Summary
אנו מתארים את הייצור של הורמון כדורים דחוסים, כמו גם השתלה כירורגית תת עורית לעכברים. אסטרטגיה זו יכולה להיות משולבת עם הצמיחה של xenografts תא והרקמה תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום athymic להעריך היווצרות סרטן ורגולציה של צמיחת ערמונית שפירה הורמונלי.
Abstract
טיפולים חדשים עבור שתי מחלות נפוצות בבלוטת ערמונית, סרטן הערמונית (PrCa) והיפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH), תלויים באופן קריטי על ניסויי הערכת הוויסות הורמונלי שלהם. הורמוני סטרואידי מין (בעיקר אנדרוגנים ואסטרוגנים) הם חשובים בPrCa וBPH; לחקור התפקידים שלהם בזירוז צמיחת ערמונית וסרטן בעכברים עם ניסויים באמצעות כדורי הורמון דחוסים. כדורי הורמון ו / או תרופה מיוצרים בקלות עם עיתונות גלולה, וניתוח מושתלים לתוך הרקמה תת עורית של מארח עכבר הזכר. גם אנו מתארים פרוטוקול להערכת הסרטן הורמונלי על ידי שילוב של השתלת גלולה הורמון תת עורית עם xenografting של recombinants תא ערמונית תחת הקפסולה הכליות של עכברי מדוכאי חיסון. יתר על כן, השתלת גלולה הורמון תת עורי, בשילוב עם xenografting הקפסולה הכליות של רקמת BPH, כדאי להבין ויסות הורמונלי של פרוסט השפיר טוב יותראכלתי צמיחה, וכדי לבחון טיפולים חדשים מיקוד מסלולי הורמון מין סטרואידים.
Introduction
סרטן הערמונית (PrCa) והיפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH) הן מעמסה בריאותית משמעותית. PrCa הוא הסרטן השני הנפוץ ביותר מוצק האיבר אצל גברים וגורם מוביל לסרטן הקשורים למוות 1. BPH הוא גם נפוץ מאוד בקרב גברים מבוגרים, והערכה הוא כי הביטוי הקליני של BPH, תסמינים בדרכי שתן תחתון (LUTS), ישפיע 50-90% מהגברים 2. בעוד אנדרוגנים ואסטרוגנים ידועים להיות חשוב בPrCa וBPH, ההבנה של מנגנונים הורמונליים העומדים בבסיס היווצרות סרטן וצמיחה שלנו נשארה שלמה 3,4. מודלים של בעלי חיים פשוטים וגנטי צייתנים לחזק את המחקרים שיעסקו בסדרי עדיפויות אלה במחקר ערמונית. במחלות הורמון מגיבות כמו PrCa וBPH, השימוש בתת עור, כדורי הורמון שחרור איטיים, בבידוד או בשילוב עם xenografting הקפסולה הכליות (ההעברה של תאים, רקמות או איברים ממין אחד למשנו) לimmunocompמארח עכבר romised, מספק שיטה פשוטה לשחזור ללימוד רגולציה הורמונלית של צמיחה והיווצרות סרטן.
השתלת גלולה הורמון תת עורי היא טכניקה פשוטה ולשעתק ללמוד ויסות הורמונלי של סרטן וגידול שפיר בערמונית 5. השתלה תת עורית של עכברי זכרים מבוגרים עם 25 טסטוסטרון מ"ג (T) ו17β-אסטרדיול 2.5 מ"ג (ה 2), גורמת לעלייה בסרום E 2 וירידה הדרגתית בT, יצירה מחדש של הסביבה ההורמונלית הדינמית של גברים מזדקנים 5,6. בנוסף, מודל זה משחזר רבים של המאפיינים הקליניים של 5,7 BPH-LUTS. שיטות חלופיות של ממשל הורמון כוללות אוראלי / gavage או זריקת intraperitoneal, אשר גורם למצוקה למכרסמים, הם פחות עקביים באספקת אותה הכמות של תרופה לאורך זמן, ויותר עתיר עבודה מאשר השתלה כירורגית חד פעמית. מצבים תת עורית אחרים לשעותormone ו / או אספקת סמים כוללות כמוסות Silastic 8. אמנם יש לנו גם ניסיון עם שימוש בכמוסות Silastic, כדורים דחוסים הם העדיפו עבור קלות שימוש שלהם ושחזור. יתר על כן, שיעורי שחרורו של כדורי הורמון דחוסים יותר טובים לחקות את היחסים הדינמיים מין סטרואידי ההורמון נצפו בגברים מזדקנים 5,7.
מאז הפיתוח של עכברים גנטי חיסון, in vivo מערכות מודל רבים המשלבות טכניקות xenografting פותחו עבור המחקר של מגוון רחב של רקמות בריאות וחולות. ישנן מספר קטגוריות בסיסיות של xenografting. xenografts הרקמה מורכבת של פיסה קטנה של רקמה שלמה, אשר יכול להיות מבנה נורמלי, גידול ממאיר, או גידול שפיר. Szot et al. (2007) לאחרונה מואר xenografting הקפסולה כליות של איי לבלב 9. Aamdal et al. (1985) תאר xenografting הקפסולה כליות של 27 שורות תאי סרטן אנושיים בimעכבר munocompromised מארח 10. יכולים גם להיות מורכבים תלים של שורה אחת הנציחה תא (סרטנית או שאינה סרטנית), או יכולים להיות מורכב משורת תאים הונצחו בשילוב עם תאים מבודדים מmesenchyme (שתל רקומביננטי תא).
אנו דוגלים xenografting של recombinants תא כדי לבחון את תפקידיהם של stroma והאפיתל בפיתוח PrCa וBPH. Cunha et al. (1980) היה הראשון לדווח כי כאשר אפיתל שלפוחית העכברי מבוגר בשילוב עם mesenchyme עוברי ואברי המין סינוס (UGM) וxenografted תחת הקפסולה הכליות של מארחים עכברי זכרים, הרקמה מתפתחת למבנים הדומים acini ערמונית 11. נורמן et al. (1986) הראה כי אפיתל עכבר הבוגר של הערמונית ductal וUGM, כאשר הוא משולב בrecombinants רקמות, עוברים צמיחת ductal והסתעפות המורפוגנזה 12. הייוורד et al. (1988) הראה כי אפיתל ערמונית אדם מגיב לאינדוקטיביים מ 'עובריesenchyme באופן דומה 13. מודל ההורמונלית של הסרטן בערמונית, על ידי שילוב של שורת תאי אפיתל הונצח ערמונית אדם BPH-1 עם UGM, דווח לראשונה על ידי וואנג et al. 14 (2001) ונעשה שימוש נרחב במעבדה שלנו 15. מודל זה גם מתאים להבנת התקדמות PrCa כי אפיתל השפיר של הערמונית הופך למחלה גרורתית, דוגמנות PrCa המתקדמת בבני האדם 5. מכיוון שניתן להשפיע על רכיבים ספציפיים גנטי, השתלת רקומביננטי תא שימושית במיוחד כגישה להעריך אינטראקציות סטרומה-אפיתל.
אתרים אחרים המתאימים לxenografting הם intradermal, תת עורית ובמקומות orthotopic 16. בהתאם לתהליך הרקמות ומחלות של עניין, אלה עשויים להיות גישות חלופיות מתאימות. לצורך המחקר של סרטן ערמונית הורמונליים ורגולציה גידול שפירה, אנו בוחרים את הקפסולה הכליותאתר לxenografting בשל השתל גבוה יותר שלה לקחת שיעור, אספקת דם בשפע, ויכולת להשתיל מספר רב יותר של xenografts לאתר מוגבל אחד 16. יתר על כן, מניפולציה הורמונלית של עכבר המארח כי תוצאות בניוון של הערמונית מגבילה את השימוש בהשתלת orthotopic ערמונית 16.
פרוטוקול זה מתאר טכניקות של ייצור הורמון דחוס / סמים גלולה והשתלה כירורגית, כמו גם xenografting הקפסולה כליות של שתלי תא ערמונית אנושי ורקמות. יחד, טכניקות אלה מספקים assay רגיש כדי לקבוע אם עכבר מהונדס גנטי הוא רגיש יותר לPrCa ו / או ייזום BPH מאשר זני שליטה. Xenografting הוא טכניקה רבת עוצמה עבור in vivo הערכה של הפוטנציאל של תאים ניסיוניים כדי לפתח היסטולוגית ותכונות מולקולריות של ממאירות, כמו גם assay לאסטרטגיות טיפול חדשניים במגוון רחב של מחלות שפירים וממאירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת דחוסה הורמונים / תרופות גלולה
- הליך זה צריך להיעשות במנדף בטיחות כימי בזמן שהוא לובש מעיל מעבדה, כפפות, מסיכה, משקפי מגן, ומכסה מנוע. כדי למנוע זיהום צולב, זה קריטי, כי ציוד גלולה קבלת הוא ניקה ביסודיות עם אתנול 70% לפני ואחרי הייצור של כל סוג של גלולה.
- שימוש בקנה מידה אנליטית ולשקול נייר, למדוד כמות רצויה של אבקת הורמון / סמים. כ 5% חומר נוסף מומלץ כדי להתאים הפסד בלחיצה.
- כמה הורמונים / תרופות דורשות סוכן מחייב או מילוי, שהוא מעורב לפני גלולה ייצור. לדוגמה, כדי לייצר גלולה 2.5 מ"ג 17β-אסטרדיול, ההורמון לשלב עם 22.5 מ"ג של כולסטרול, שתוצאתה גלולה 25 מ"ג.
- להעביר בזהירות לתוך סט למות, מקום תחת לחץ ולדחוף את הידית בחוזקה כלפי מטה כדי לדחוס גלולה. השתמש בלחץ עקבי כדי לשמור על משטח קבוע הםיחס נפח.
- הבא להפוך את בעל למות ולדחוף את הידית כלפי מטה שוב כדי לשחרר את הכדור.
- בדוק גלולה לשלמות ולקבוע אם מסה סופית נמצאת בטווח רצוי. טווח מקובל הוא הבדל ± 5% במסה הסופית (לדוגמא, טווח מקובל לגלולת 25 מ"ג הוא 23.8-26.3 מ"ג).
- פלטות יכולות להתבצע לפני ניתוח ומאוחסן (תנאים ואורך של אחסון תלוי ביציבות של ההורמון או תרופה המשמש בייצור גלולה). ניתן לרכוש כדורי הורמון כחלופה לגלולת ייצור. רכישת כדורים תמנע את השימוש בתרופות בדרגה שאינן תרופתיות ומאז הם יגובשו ומורכבים.
2. הכנת הנייד xenografts רקומביננטי
- קציר ועכבר עיקרי תרבות mesenchyme ואברי המין (UGM) תאי סטרומה בפחות מ -4 שבועות לפני שנאסף לספירה.
- תרבות הונצחה שורות תאי אפיתל בערמונית fash כרגיליון ולאסוף לספירה. בדוגמה זו, להכין תלי רקומביננטי תא על ידי ערבוב של 100,000 תאי האפיתל BPH-1 לכל שתל עם 250,000 תאי סטרומה UGM לשתל בהשעיה.
- גלולה תאים יחד ומחדש להשעות קולגן עכברוש זנב הסוג נוטרל 1 מספיק כדי להפוך את המספר רצוי של שתלים, כל אחד בנפח של 25 μl 50 μl.
- קבע שתלי רקומביננטי על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולאחר מכן לכסות עם מדיום גידול לאחסון על 37 מעלות צלזיוס עד 48 שעות לפני השתלה.
3. הכנת xenografts רקמות
- לשמור על אמצעי זהירות אוניברסלית לפתוגנים דם נישא במהלך רכש רקמות והליך כירורגי. לאחר אישור דירקטוריון הסקירה מוסדי והסכמה מדעת, להשיג רקמת ערמונית טרי מכריתה כירורגית. ללימודים של צמיחת BPH, ניתן לקצור רקמות מכריתה של הערמונית או נהלי כריתת ערמונית פשוטים. xenografts העיקרית של PrCa או פרוסט השפירניתן להשיג רקמה אכלה מדגימות כריתה רדיקאלית של ערמונית.
- חנות שנקטפו רקמה בתקשורת איזוטוני נאגרה תא או מלח רגיל על קרח. בהתאם לתנאי הרקמות ואחסון, דגימות ניתן לאחסן לתקופה של עד 24 שעות לפני הכנת שתלי רקמה. מנהג נפוץ הוא לחלק את הדגימה לשלושה חלקים, עם סעיף אחד קבוע בפורמלין ושגרתי מעובד להיסטולוגיה, חתיכה אחת הצמד קפוא לניתוח מולקולרי וחתיכה אחת נוספת מחולקת לxenografts רקמות (1-3 מ"מ בגודל).
4. הכנת האש מלוטש זכוכית פיפטה
- כפפות להגנה על העין לבישת, מעיל מעבדה ועמידות בחום, מקום קצה פיפטה פסטר זכוכית לתוך להבת מבער בונזן בזווית של כ 60 ° להתחיל.
- שמור על תנועה מתמדת, קלה לפיפטה כדי למנוע נקודות חמות.
- למשוך את הקצה דק ואש פולנית במטרה להיות סוף מעוגל מעט עם מעוגל, נסגר קצה. 5. הכנת מכשירים וחדרי ניתוח
- החיטוי כל המכשירים. לפני הניתוח, לבדוק את כל המכשירים, מקפיד לשמור על שדה סטרילי.
- הגדר את אזור ניתוח סטרילי עם רפידות סופגים, היקף לנתיחה, חרטומו הרדמה, מכשירי ניתוח ומנורת חימום המכוונים לאזור העבודה. לעקר כלים בין עכברים, מעקר את חרוז prewarm.
- להרכיב ומכשירי הרדמה בדיקה; שוקל נבלות גז.
- שימוש במיקרוגל, רפידות שעוות חום לתקופה של עד 5 דקות (במרווחים של 1 דקות, לישת משטח השעווה כדי לשלב שעווה נמסה ולא נמסה) ב70-80% כוח, עד שכל השעווה נמסה באופן שווה. על ידי מגע, להבטיח הכרית אינה חמה ומקום גם מתחת לכלוב התאוששות מכרסמים הריק.
- ציוד מגן אישי לדון ניתוחי מכרסמים, כוללים מסיכת מנתחים, כובע, כפפות וגלימה.
- כל ההליכים הכרוכים בחיות מחקר צריכים להתבצע באישור של ועדות טיפול בבעלי חיים מוסדיים ולשימוש. לפני האינדוקציה של הרדמה, להתבונן בעכבר כדי להבטיח את בריאותם ורווחתם.
- מניחים את העכבר לתוך תא לאינדוקציה של הרדמה isoflurane ב3-5%. כאשר בעלי החיים הפסיקו לזוז וקצב הנשימה ירד, להעביר לחרטומו במצב המועדים, ולשמור על הרדמה ב1-3%.
- במידת צורך, השתמש בקוצץ לגלח את החלק האחורי של העכבר. זה אינו נחוץ כאשר ניצול עכברי עירום athymic (נו / נו).
- החל לחץ חזק לחגורה של כף הרגל האחורית המורחבת להערכת הלימות של הרדמה. אם העכבר מגיב ללחץ, יש צורך בזמן רב יותר להרדמה תיכנס לתוקף. במידת צורך, להתאים את זרימת הרדמה מעט כדי להשיג הרדמה נאותה.
- כאשר סמן העכבר הוא מורדם כראוי, לחטא את האתר כירורגית עם יוד כירורגית פתרון (פולידין) ואחריואלכוהול 70%.
- דון כפפות וחלוק סטרילי; להחיל סדינים מעוקרים לאתר כירורגית. הרם את העור חזרה עם זוג המלקחיים שיניים, ותוך שימוש במספריים הגסים לעשות חתך קו האמצע 2-3 סנטימטר הגבי.
- באמצעות מספריים קהים או בדיקה, להפריד את הדרמיס שבבסיס מקיר הגוף (בשני הצדדים של החתך להשתלה דו צדדית או בצד אחד להשתלה חד צדדית).
- למקם את העכבר למקומו לרוחב, ולזהות את המיקום של הכליות על ידי הצגת פרופיל הכליות דרך קיר השריר. הפעלת לחץ ידני עדין עם האגודל ואצבע מורה על הבטן יכולה לסייע בהמחשת אברים פנימיים.
- בעזרת המספריים איריס בסדר, ולטפל כדי למנוע ספינות גדולות ועצבים בעמוד השדרה, לעשות חתך 1 סנטימטר בקיר המקביל לגוף את עמוד השדרה. להרחיב את החתך הזה ל1.5-2.0 סנטימטר (מעט יותר מאשר הציר של הכליה הארוכה) בעדינות על ידי פתיחת המספריים רחבים יותר לאחר ביצועם בחתך הראשוני.
- Exteriorize הכליות על ידי הפעלת לחץ עדין מחוץ לחומת השרירים בכל צד של הכליה באמצעות האצבע ואגודל. טאק עור קצוות מתחת לכליות exteriorized, שינוח על קיר הגוף. בעוד הכליות exteriorized, לשמור על לחות של הקפסולה הכליות על ידי יישום תמיסת מלח סטרילית.
- באמצעות # 5 מלקחיים בסדר בעדינות להרים את הקפסולה הכליות מparenchyma של הכליה ועם אזמל דק, לעשות חתך מ"מ 2 -4 בכמוסה. גודל החתך נקבע על ידי הגודל של השתל, אך צריך להיות ממוזער על מנת לשמור על השלמות של הקפסולה.
- מניפולציות זכוכית פיפטה פסטר שכבר נמשכה דק ואש מלוטשת עם סוף סגור מעוגל תחת הקפסולה משיקה למשטח של הכליה. בעדינות לפתוח כיס כמוסה קטן לשתלים, תוך שימוש בזהירות רבה שלא לפגוע בparenchyma הכליות.
- קצה החתך של הקפסולה הכליות יוסר עם המלקחיים בסדר, ואני השתלs מוכנס לתוך הכיס מתחת לכמוסה באמצעות פיפטה הזכוכית מלוטשת האש. ניתן להציב כמה שתלי תחת הקפסולה הכליות ומחולקים באופן שווה על פני השטח בכליות.
- אם, במהלך ההשתלה, הקפסולה הופכת מיובשת, זה צריך להיות טבול ידי החלת תמיסת מלח סטרילית.
- כאשר השתלה היא מוחלטת, בעדינות להרים את צדי קיר שרירים החתך להחליף את הכליה בחזרה לתוך חלל הגוף. שים לב שהתלים לא להחליק מתחת לקפסולה.
- סגור את קיר השרירים עם תפר אחד (4-0, FS-2 תפר vicryl). הליך כירורגים ניתן לחזור על הכליות נגדי על ידי למקם מחדש את העכבר.
- כאשר השתלה היא מוחלטת, העכבר עשוי לעבור השתלה תת עורית גלולה באותה הפרוצדורה כירורגית (ראה שלב פרוטוקול 7).
- בעזרת מלקחיים שיניים, ליישר את קצות חתך בעור ולהחיל 2-3 קליפים פצע ניתוח כדי לסגור את החתך. לנהל שיכוך כאבים (אנו משתמשים 5-10 מ"ג / קילוגרם carprofen באמצעות הזרקה תת עורית) ולמקם את העכבר במצב שכיבה לרוחב בכלוב ההתאוששות. להבטיח שמירה על טמפרטורת גוף בחום ממנורה או כרית חימום. שים לב להחלמה מלאה של העכבר, שאמורה להתרחש בפחות מ -15 דקות.
- עכברים יש לשים לב לשעות 24 הבאות לסימנים של כאב שלאחר ניתוח, דימום ו / או סיבוכים אחרים. באופן קבוע לבדוק חתך ניתוחי לסימנים של זיהום.
- הסרת קליפים פצע עם מכשיר הסרת סרטון פצע ניתוח 7-14 ימים לאחר הניתוח.
- חזור על שלבים 6.1-6.5 מהקפסולה כליות xenografting הליך כירורגי.
- הרם את העור חזרה עם זוג המלקחיים עור, ושימוש במספריים הגסים לעשות חתך קו האמצע 1-2 סנטימטר הגבי.
- באמצעות מספריים קהים או בדיקה, להפריד את הדרמיס שבבסיס מהגוף הקיר בכיוון גולגולתי.
- באמצעות מלקחיים עור,בעדינות להרים את ההיבט גולגולתי של החתך בעור, ומחזיק את כדור ההורמון בעדינות עם מלקחיים ישרים, משוננים, הכנס את גלולה ולשחרר בעורף, בכיס שיצרת עם החללית הבוטה.
- חזור על שלבים 6.18-6.20 מהקפסולה כליות xenografting הליך כירורגי. אם ביצוע השתלת גלולה התת עורית בלבד, להשתמש 1 קליפ פצע ניתוח כדי לסגור את החתך הניתוחי.
6. הליך כירורגי: כליות קפסולת Xenografting
7. הליך כירורגי: תת עורי גלולה השרשה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתאם להשערה להיבדק, xenografting הקפסולה הכליות של recombinants רקמה או תא יכול להתבצע בבידוד, או בשילוב עם השתלת גלולה הורמון תת עורית. סכמטי של ניסוי היפותטי שילוב ניסוי xenografting הקפסולה כליות עם השתלת גלולה הורמון תת עורית מודגמת באיור 1. מגוון רחב של חומרי אבקה ו / או גבישים יכול לשמש בייצור של כדוריות דחוסות עם עיתונות גלולה. איור 2 מראה 25 מ"ג, מ"ג 12 ו6 מ"ג דחוס כדורי הורמונים.
איור 3 מראה דוגמא של פיפטה זכוכית האש מלוטשת המשמשת במהלך ההליך הכירורגי. עובר מרובה של זכוכית פיפטה פסטר באמצעות להבת מבער בונזן לגרום לקצה אש מלוטשת, מעוגל המשמש ליצירת כיס עבור שתלים תחת הקפסולה הכליות ולתפעל את השתלים מתחת להקפסולה הכליות.
ntent "> כפי שניתן לראות בתרשים 4, xenografts העיקרית רקמה מחולים עם BPH, בתוספת טסטוסטרון אקסוגני (גלולה תת עורית 25 מ"ג) כדי לדמות את הסביבה ההורמונלית האנושית הגברית, לשרוד וארכיטקטורת הרקמה נשמרה (איור 4 א). כמו כן מוצג ב איור 4, השתלת הקפסולה כליות יכול לשמש כדי להעריך את היווצרות הסרטן הורמונלי. Recombinants תא המכיל אפיתל שפירים ערמונית (BPH-1) וmesenchyme אינדוקטיביים ואברי המין (UGM) גדל בעכברים שלא טופלו בצורת גידולים שפירים (איור 4). אותו השתל, גדל ב מארח שקיבל כדורים תת עורית של הורמון 25 T מ"ג ו2.5 מ"ג E 2 במשך ארבעה חודשים, מתפתח לסרטן הערמונית שפולש הקפסולה הכליות (איור 4C) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
איור 1. סכמטי של xenografting הקפסולה כליות והליך השתלת גלולה. Xenografting הקפסולה כליות מתבצע באמצעות גישת קו האמצע גב. במהלך אותה הפרוצדורה כירורגית, העכבר מושתל בניתוח עם הורמון איטי שחרור תת עורית דחוס ו / או כדורי תרופה בצוואר עורף האזור.
איור 2. דוגמאות של כדורי הורמון דחוסים מיוצרים עם הפרוטוקול הנוכחי. גלולה מ"ג א 12. ב גלולה 6 מ"ג. ג 25 גלולה מ"ג.
איור 3. זכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. פיפטה המוגמרת היא מעוגלת, עם קצה מעוגל חלק מתאים ליצירת נקבet לxenograft תחת הקפסולה הכליות. פיפטה משמשת גם כדי לתפעל את השתל מתחת להקפסולה הכליות.
איור 4. דוגמא לxenografts הקפסולה כליות. Xenografts א רקמות (ראשי חץ) של רקמת BPH אדם גדלים במשך חודש אחד תחת הקפסולה הכליות של עכבר עירום גברי. מארח העכבר בתוספת 25 גלולה טסטוסטרון מ"ג כדי לדמות את הסביבה ההורמונלית של הזכר האנושי. Xenografts B. תא רקומביננטי (ראשי חץ) המכילה קו אנושי של הערמונית אפיתל תאים (BPH-1) וmesenchyme אינדוקטיביים ואברי המין (UGM) גדל בכליות כמוסה של עכבר בעירום שלא מושתל עם גלולה הורמון תת עורי במשך ארבעה חודשים. xenograft רקומביננטי הנייד ג מכילה BPH-1 וUGM, גדל תחת הקפסולה הכליות של עכבר בעירום שעבר גם תתהשתלת גלולה עורית של טסטוסטרון 25 מ"ג ו2.5 מ"ג 17β-אסטרדיול במשך ארבעה חודשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה והפרוטוקול שתואר במסמך זה מתארים את הייצור של הורמון דחוס ו / או כדורי סמים, וההליך כירורגי להשתלת גלולה תת עורית של עכברים. בהתאם לשאלת המחקר יש לטפל, טכניקה זו יכולה להתבצע ביחידים, או בשילוב עם xenografting הקפסולה הכליות של שתלי תא ערמונית רקומביננטי או xenografts רקמת ערמונית, שהם טכניקות בשימוש נרחב במחקר ערמונית 17-19. יחדיו, טכניקות אלה מציעות גישה רבת עוצמה כדי לחקור את היווצרות סרטן והסדרה של גידול שפיר בערמונית האדם ועכבר הורמונלי.
ייצור גלולה הוא פשוט לביצוע, לשחזור בקלות, ודורש ציוד מוגבל. זה יכול להיות מיושם על הכנות הורמון והתרופות שונות. זה קריטי כדי לבצע בטכניקה זו במנדף בטיחות כימית, וללבוש ציוד מגן אישי מתאים. עבור ניסויי הערכת סרטן ערמוניתnd אינדוקציה של חסימת מוצא שלפוחית עכברית אנו משתמשים 25 T מ"ג ו2.5 מ"ג E 2 5,7,15. מינונים אלה נבחרו משום שהם מייצרים רצויים בתגובה vivo ובגלל שהם יוצרים את רמות הורמון בסרום שרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית לזכרים אנושיים עם תהליך המחלה של עניין 6. תבניות גלולה מאפשרות גדלים שונים של כדורים שיוצרו, אנחנו משתמשים בדרך כלל 25 כדורי מ"ג להערכת סרטן וגידול שפיר. בחירה של הגודל גלולה תלויה בהשערה לטפל, כמו גם את הייצור של אפקט הרצוי, הייצור של רמות במחזור רצויה ואת משך הזמן של הניסוי. אם בתרופות או הורמונים בשילוב עם סוכן מחייב (כמו כולסטרול) אנו ממליצים תערובת הומוגנית של הורמון וסוכן מחייב.
בהתאם למחקר, השתלה תת עורית גלולה ניתן לבצע סירוס של מארח זכר 15 הבא. מניסיוננו,השתלה של 25 מ"ג של T גורמת עיכוב משוב של ציר ההיפותלמוס, יותרת המוח, אשכים, עיכוב הפרשת אנדוגני. לכן אנו בוחרים להשוות את העכברים שטופלו 25 T מ"ג כדי לדמות את הסביבה אנדרוגנית של הזכר האנושי לזכרים ללא פגע, אך לא טופלו, עם הפרשת T אנדוגני נשמרה. אנחנו לא באופן שיגרתי לנצל מארח לסרס בשל תגובת המכולה של xenografts הערמונית וסרטן הערמונית לנסיגת אנדרוגן.
פרוטוקול זה מתאר גם את הקמתה של פיסת ציוד מיוחד עבור xenografting הקפסולה כליות, זכוכית פיפטה פסטר האש מלוטשת. זה יכול להתבצע בקלות עם ציוד קיים ברוב המעבדות, וכתוצאה מכך מכשיר לניתוח מותאם אישית יותר יכול להיות מיוצר ומעוקר לפני השימוש בהליך כירורגי. לבישת ציוד מגן אישי היא חשובה כדי להבטיח את בטיחות צוות בעת יצירת פיפטה הזכוכית מלוטשת האש.
לפני embarking על כל אחד מהניתוחים המפורטים בפרוטוקול זה, כל הטכניקות חייבת להיות נבדקו ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית. ניתוחים שבוצעו במכרסמים דורשים אימון ותרגול בשני ההיבטים הטכניים של ההליך, כמו גם את העקרונות ותרגול של טכניקת aseptic. לקבלת מבוא לציוד והטכניקות החשוב בהליכים אלה אנו ממליצים צוות להציג את כתב יד הווידאו דיווח לאחרונה על ידי Prichett-Corning et al. (2011) 20. כמו כן אנו ממליצים לכל צוות מקבל הדרכה מעשית בפרוצדורות כירורגיות מכרסמים וטכניקת aseptic.
במעבדה שלנו, נהלים אלה מבוצעים בדרך כלל עם שני אנשי צוות. העוזר כירורגית מנהל הרדמה, מציין בעלי חיים במהלך התאוששות, מסייע למנתח בהיבטים שאינם סטרילי של ההליך ומתעד את כל ההליכים. המנתח שומר על שדה סטרילי, מנהל שיכוך כאביםnd מבצע את הניתוחים המפורטים בפרוטוקול זה. עם תכנון והכשרה מתאימים, ההליך הכירורגי של השתלת גלולה הורמון תת עורי הוא פשוט וקל לביצוע.
ישנם מספר שיקולי עיצוב ניסיוני לxenografting רקומביננטי תא. כמו בכל ניסויי ניצול שורות תאים הונצחו, זיהום הוא חשוב כדי למזער ולזהות. לניסויים באמצעות שורות תאים BPH-1, אנו ממליצים על מספר נמוך מעבר (פחות מ 25). כדי לשלוט על השפעות של stroma, אנו מנצלים בשתלים המכילים תאי BPH-1 רק כליה אחת ושתלים המכילים BPH-1 וUGM בכליה הנגדית. בניסויים שנועדו לתת מענה סרטן הורמונליים, בדרך כלל יש לנו מצב ביקורת שלא טופל (עכבר לא מושתל עם גלולה, או שהוא מושתל עם גלולה כולסטרול). בקרות חיוביות (עכבר מארח הוא מושתל עם T + E 2 כדורים) חשובות באותה מידה בעת הערכת tha תנאים אחרלא עשוי לקדם היווצרות סרטן עם מערכת מודל זה. בהתאם לשאלת המחקר יש לטפל, משך ההשתלה גלולה ו / או צמיחת xenograft עשוי לנוע בין מספר שבועות לארבעה חודשים; לניסויים המתוכננים יעלה על ארבעה חודשים, אנו ממליצים השתלת גלולה נוספת כדי לשמור על רמות הורמונים אקסוגניים. לניסויים מעורבים xenografts רקמת ערמונית שפירה, חשוב ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולשמור על אמצעי זהירות אוניברסלית לפתוגנים דם נישא. רקמה שנקטפו זה עתה יכול להיות מאוחסן לפני xenografting ל12-72 שעה.
הטכניקה כירורגית לxenografting הקפסולה הכליות דורשת תכנון, אימון וכמה מיומנות ידנית. צמצום משך הזמן של ההליך כירורגי, שמירה על טמפרטורת גוף וטכניקה ניתוחית זהירה יכול להקטין תמותה סביב ניתוח וסיבוכים כירורגיים. הסיכוי למוות סביב ניתוח בניסיון שלנו עולה עם משך suהליך rgical; מסיבה זו אנו מגבילים את ההליך כירורגי כדי לא יותר מ 20-25 דק '. שימוש במנורת חימום ומשטח שעווה התחמם במהלך ניתוח וההחלמה הוא אידיאלית לשמירה על טמפרטורת גוף. טיפול שלאחר ניתוח שיגרתי הוא היבט חשוב נוסף להצלחתה של טכניקה זו. עכברים צריכים להיות שנצפו במהלך התאוששות הרדמה, והיום לאחר ניתוח לסימנים של כאב ומצוקה. לנהל שיכוך כאבים מתאימים כדי למזער את הכאב ומצוקה שלאחר פרוצדורליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לכל חברים במעבדה Ricke, בעבר ובהווה. אנו מודים לקלווין פאטן, הבן, DVM ובריז'יט ראבה, רופאת וטרינרית, על הערות מועילות לגבי הפרוטוקול. ברצוננו להודות NIDDK, NCI, וNIEHS על התמיכה הכספית למחקרים אלה: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN הוא חניך בתכנית ההכשרה הרפואי מדען באוניברסיטת רוצ'סטר שמומן על ידי NIH T32 GM07356; NIH תחת רות ל 'Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס F30DK093173 תומך גם בפרויקט זה. CDV נתמך על ידי T32CA157322 וABT נתמך על ידי T32ES007015 באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים או NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
