Summary
وصفنا تصنيع الكريات هرمون مضغوط، فضلا عن زرع جراحية تحت الجلد في الفئران. هذه الاستراتيجية يمكن دمجها مع نمو الخلية والأنسجة xenografts تحت كبسولة الكلى من الفئران عارية athymic لتقييم التسرطن الهرمونية وتنظيم نمو البروستاتا الحميد.
Abstract
علاجات جديدة لاثنين من الأمراض الشائعة في البروستاتا، وسرطان البروستاتا (PRCA) وتضخم البروستاتا الحميد (BPH)، وتعتمد بشكل كبير على التجارب تقييم تنظيمها الهرمونية. الهرمونات الجنسية الستيرويد (وخاصة الاندروجين والاستروجين) مهمة في PRCA وBPH، ونحن سبر دور كل منهما في إحداث نمو البروستاتا والتسرطن في الفئران مع التجارب باستخدام الكريات هرمون مضغوط. يتم تصنيع الهرمون و / أو المخدرات الكريات بسهولة مع الصحافة بيليه، وجراحيا زرعها في الأنسجة تحت الجلد للمضيف الماوس الذكور. نحن أيضا وصف بروتوكول لتقييم التسرطن الهرمونية تحت الجلد عن طريق الجمع بين هرمون زرع بيليه مع xenografting من recombinants خلية البروستاتا تحت كبسولة الكلى من الفئران المناعة. علاوة على ذلك، هرمون تحت الجلد بيليه الزرع، بالاشتراك مع الكلوي xenografting كبسولة من الأنسجة BPH، من المفيد أن نفهم على نحو أفضل من التنظيم الهرموني بروست حميدةأكلت النمو، واختبار علاجات جديدة تستهدف الجنس هرمون الستيرويد مسارات.
Introduction
سرطان البروستاتا (PRCA) وتضخم البروستاتا الحميد (BPH) هي أعباء صحية كبيرة. PRCA هو الثاني الأكثر انتشارا سرطان الجهاز الصلبة في الرجال والسبب الرئيسي للسرطان وفاة 1 ذات الصلة. BPH هو أيضا واسع الانتشار بين كبار السن من الرجال، وتشير التقديرات إلى أن مظاهر سريرية من BPH، وانخفاض أعراض المسالك البولية (طرفيات)، وسوف تؤثر على 50-90٪ من الرجال 2. بينما يعرف الاندروجين والاستروجين إلى أن تكون مهمة في PRCA وBPH، فهمنا لآليات التسرطن الهرمونية التي تكمن وراء والنمو لا تزال غير مكتملة 3،4. نماذج حيوانية بسيطة ولين العريكة وراثيا تدعم الدراسات التي من شأنها معالجة هذه الأولويات في مجال البحوث البروستاتا. في استجابة هرمون الأمراض مثل PRCA وBPH، واستخدام تحت الجلد، وبطء الكريات هرمون الإفراج عنهم، في عزلة أو بالاشتراك مع كبسولة الكلوي xenografting (نقل الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء من نوع واحد إلى آخر) في immunocompالمضيف الماوس romised، يوفر طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لدراسة التنظيم الهرموني للنمو والتسرطن.
تحت الجلد هرمون بيليه الزرع هو تقنية بسيطة وقابلة للتكرار لدراسة التنظيم الهرموني التسرطن والنمو حميدة في البروستات 5. زرع تحت الجلد من الفئران الذكور البالغين مع 25 ملغ هرمون تستوستيرون (T) و 2.5 ملغ 17β استراديول (E 2)، يسبب زيادة في المصل ض 2 والانخفاض التدريجي في خميس، وإعادة البيئة الهرمونية الحيوية من كبار السن من الرجال 5،6. بالإضافة إلى ذلك، هذا النموذج يلخص العديد من المظاهر السريرية لBPH-طرفيات 5،7. طرق بديلة لإدارة هرمون تشمل تناوله عن طريق الفم / التغذية الأنبوبية أو الحقن داخل الصفاق، والذي يسبب الضيق إلى القوارض، هي أقل اتساقا في تقديم نفس الكمية من المخدرات على مر الزمن، وأكثر من مرة واحدة الزرع الجراحية التي تتطلب عمالة مكثفة. وسائط أخرى تحت الجلد لحormone و / أو تسليم المخدرات تشمل كبسولات Silastic 8. في حين لدينا أيضا تجربة مع استخدام كبسولات Silastic، ويفضل الكريات مضغوط لسهولة استخدامها والتكاثر. وعلاوة على ذلك، فإن معدلات الافراج عن الكريات هرمون مضغوط أفضل تحاكي الجنس ديناميكية نسب هرمون الستيرويد لوحظ في كبار السن من الرجال 5،7.
منذ تطوير الفئران المناعة وراثيا، وقد تم تطوير العديد من أنظمة الجسم الحي في نموذج دمج تقنيات xenografting لدراسة مجموعة واسعة من الأنسجة الطبيعية والمريضة. هناك عدة فئات أساسية من xenografting. تتكون xenografts أنسجة قطعة صغيرة من الأنسجة سليمة، والتي يمكن أن تكون بنية عادية، ورم خبيث، أو النمو حميدة. Szot وآخرون (2007) لقد أضاءت مؤخرا الكلوي xenografting كبسولة من الجزر البنكرياسية 9. وصف Aamdal وآخرون (1985) الكلوي xenografting كبسولة من 27 خطوط الخلايا السرطانية البشرية في ايمالماوس munocompromised يستضيف 10. ويمكن أيضا أن تتكون من ترقيع خط خلية واحدة مخلد (سرطانية أو غير مكون للأورام)، أو يمكن أن تتكون من خط خلية خلد جنبا إلى جنب مع الخلايا المعزولة من اللحمة المتوسطة (خلية الكسب غير المشروع المؤتلف).
نؤيد xenografting من recombinants خلية لبحث دور كل من سدى وظهارة في تطوير PRCA وBPH. كان كونها وآخرون (1980) أول من أشار إلى أنه عندما يتم الجمع بين الكبار الفئران الجنينية مع ظهارة المثانة البولية التناسلية اللحمة المتوسطة الجيوب الأنفية (مادا) وxenografted تحت كبسولة الكلى الجنود الفئران الذكور، والأنسجة تطور الى هياكل تشبه البروستاتا عنيبات 11. أظهر نورمان وآخرون (1986) أن الفأر الكبار البروستاتا ظهارة الأقنية ومادا، عند دمجها في recombinants الأنسجة، والخضوع لنمو الأقنية المتفرعة والتشكل 12. أظهرت هايوارد وآخرون (1988) أن ظهارة البروستاتا الإنسان يستجيب لحثي متر الجنينesenchyme بطريقة مماثلة 13. نموذج الهرمونية التسرطن في البروستاتا، من خلال الجمع بين خلد البروستاتا البشرية خط الخلايا الظهارية، أفيد BPH-1 مع مادا أول مرة من قبل وانغ وآخرون 14 (2001)، واستخدمت على نطاق واسع في مختبرنا 15. هذا النموذج هو مناسبة تماما لفهم تطور PRCA لأن ظهارة البروستاتا الحميد يتحول إلى المرض المنتشر، والنمذجة المتقدمة PRCA في البشر 5. لأن مكونات محددة يمكن التلاعب بها وراثيا، خلية تطعيم المؤتلف مفيد بشكل خاص كنهج لتقييم التفاعلات اللحمية الظهارية.
مواقع أخرى مناسبة لxenografting هي داخل الجلد، تحت الجلد ومواقع مثلي 16. اعتمادا على عملية نسيج والمرض من الاهتمام، قد تكون هذه النهج البديلة مناسبة. لدراسة التسرطن الهرمونية البروستاتا وتنظيم النمو حميدة، نختار الكبسولة الكلويموقع لxenografting بسبب الكسب غير المشروع أعلى معدل لها، وإمدادات وفيرة من الدم، والقدرة على زرع عدد أكبر من xenografts في موقع واحد يقتصر 16 اتخاذها. وعلاوة على ذلك، والتلاعب الهرمونية من الفأرة المضيف الذي يؤدي إلى ضمور البروستاتا يحد من استخدام البروستاتا تطعيم مثلي 16.
يحدد هذا البروتوكول تقنيات ضغط هرمون / المخدرات بيليه تصنيع وزرع جراحية، وكذلك الكلوي xenografting كبسولة من الخلايا في البروستاتا البشرية والأنسجة الطعوم. معا، توفر هذه التقنيات مقايسة حساسة لتحديد ما إذا كان الماوس المعدلة وراثيا هي أكثر عرضة للPRCA و / أو الشروع BPH من سلالات السيطرة. Xenografting هي تقنية قوية لفي الجسم الحي تقييم إمكانات الخلايا التجريبية لتطوير نسيجية والميزات الجزيئية الخباثة، فضلا عن فحص لاستراتيجيات العلاج الرواية لطائفة واسعة من الأمراض الحميدة والخبيثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد مضغوط هرمون / المخدرات بيليه
- وينبغي أن يتم هذا الإجراء في غطاء السلامة الكيميائية في حين يرتدي معطف المختبر، والقفازات، وقناع، ونظارات السلامة، وغطاء محرك السيارة. لمنع انتقال التلوث، فمن الأهمية بمكان أن المعدات صنع بيليه وتنظيفها مع الايثانول 70٪ قبل وبعد تصنيع كل نوع من بيليه.
- باستخدام نطاق والتحليلية وتزن الورق، وقياس المبلغ المطلوب من مسحوق هرمون / المخدرات. ينصح مواد اضافية ما يقرب من 5٪ لاستيعاب الخسارة خلال الضغط.
- بعض الهرمونات / المخدرات تتطلب وكيل ملزمة أو حشو، والذي يخلط قبل بيليه تصنيع. على سبيل المثال، لصنع بيليه 2.5 ملغ من 17β استراديول، والجمع بين هذا الهرمون مع 22.5 ملغ من الكولسترول، مما يؤدي الى بيليه 25 ملغ.
- نقل بعناية في مجموعة الموت، في ظل صحافة ودفع رافعة بقوة إلى أسفل لضغط بيليه. استخدام الضغط متسقة للحفاظ على سطح ثابت ووإلى نسبة الحجم.
- المقبل عكس حامل يموت ودفع رافعة لأسفل مرة أخرى للافراج عن بيليه.
- تفقد بيليه للسلامة وتحديد ما إذا الشامل النهائي هو ضمن النطاق المطلوب. نطاق مقبول هو الفرق ± 5٪ في كتلة النهائية (على سبيل المثال، نطاق مقبول لبيليه 25 ملغ هو 23،8-26،3 ملغ).
- ويمكن إجراء الكريات قبل الجراحة وتخزينها (شروط ومدة التخزين يعتمد على استقرار هرمون أو عقار يستخدم في صنع بيليه). الكريات هرمون يمكن شراؤها كبديل لتكوير تصنيع. شراء الكريات يتجنب استخدام العقاقير الصف غير الدوائية لأنها سوف تصاغ وتتفاقم.
2. إعداد خلية المؤتلف Xenografts
- الحصاد والثقافة الابتدائية الماوس اللحمة المتوسطة البولي التناسلي (مادا) الخلايا اللحمية لمدة تقل عن 4 أسابيع قبل أن يتم جمعها لفرز الأصوات.
- ثقافة خلد البروستاتا خطوط الخلايا الظهارية في فعاش المعتادأيون وجمع لفرز الأصوات. لهذا المثال، وإعداد الخلايا ترقيع المؤتلف عن طريق خلط 100،000 الخلايا الظهارية BPH-1 في الكسب غير المشروع مع 250،000 مادا الخلايا اللحمية في الكسب غير المشروع في التعليق.
- بيليه الخلايا معا، وإعادة تعليق في نوع ما يكفي تحييد 1 ذيل فأر الكولاجين لجعل العدد المطلوب من الطعوم، كل في حجم 25 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر.
- تعيين ترقيع المؤتلف عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقائق ثم تغطي مع متوسط النمو للتخزين عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل التطعيم.
3. إعداد Xenografts الأنسجة
- الحفاظ على الاحتياطات العالمية لمسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم أثناء الشراء الأنسجة وإجراء العمليات الجراحية. بعد موافقة مجلس المراجعة المؤسسية والموافقة المسبقة، يجب الحصول أنسجة البروستاتا الطازجة من استئصال الجراحي. للدراسات النمو BPH، الأنسجة يمكن أن تحصد من استئصال البروستاتا عبر الاحليل من استئصال البروستاتا أو إجراءات بسيطة. xenografts الرئيسي للPRCA أو بروست حميدةويمكن الحصول على الأنسجة يأكلون من العينات استئصال البروستاتا.
- متجر تحصد الأنسجة في وسائل الإعلام خلية متساوي التوتر أو مخزنة المالحة العادي على الجليد. تبعا للظروف الأنسجة والتخزين، قد يتم تخزين العينات لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل إعداد ترقيع الأنسجة. ممارسة شائعة هو تقسيم العينة إلى ثلاث قطع، مع مقطع واحد ثابت في الفورمالين وبشكل روتيني لمعالجة الأنسجة، قطعة واحدة المفاجئة المجمدة للتحليل الجزيئي وتقسيم قطعة واحدة الى مزيد من xenografts الأنسجة (1-3 ملم في الحجم).
4. إعداد النار مصقول ماصة الزجاج
- ارتداء حماية العين، ومعطف المختبر وقفازات المقاومة للحرارة، ومكان الزجاج ماصة باستير طرف في بنسن لهب الموقد في ما يقرب من 60 درجة زاوية لبدء.
- الحفاظ على، حركة طفيفة المستمر لماصة وذلك لتجنب المناطق الساخنة.
- رسم غيض رقيقة والنار البولندية بهدف كونه نهاية منحنية قليلا مع مدورة، أغلقت طرف. 5. إعداد أدوات وجناح للعمليات الجراحية
- الأوتوكلاف جميع الصكوك. قبل الجراحة، وفحص جميع الصكوك، مع الحرص على الحفاظ على مجال معقم.
- انشاء منطقة الجراحية المعقمة مع منصات ماصة، نطاق تشريح، والتخدير مخروط الأنف، والأدوات الجراحية ومصباح التدفئة موجهة نحو منطقة العمل. لتعقيم الأدوات في بين الفئران، prewarm حبة تعقيم.
- تجميع وأجهزة التخدير الاختبار؛ تزن زبال الغاز.
- باستخدام الميكروويف، والحرارة منصات الشمع لمدة تصل إلى 5 دقائق (في 1 دقيقة الزيادات، والعجن وسادة الشمع من أجل الجمع بين ذاب الشمع وغير ذاب) في السلطة 70-80٪، حتى ذاب الشمع جميع بالتساوي. عن طريق اللمس، وضمان لوحة ليست ساخنة جدا ومكان تحت فارغة الانتعاش القوارض القفص.
- دون معدات الوقاية الشخصية للإجراءات الجراحية القوارض، بما في ذلك قناع جراحي، قلنسوة، والقفازات وثوب.
- يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات البحوث بموافقة لجان رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها. قبل التخدير، ومراقبة الماوس لضمان الصحة والرفاه.
- ضع الماوس في غرفة لتحريض التخدير isoflurane وعلى 3-5٪. عند الحيوان قد توقفت عن الحركة وانخفض معدل التنفس، ونقل إلى مخروط الأنف في وضعية الانبطاح، والحفاظ على التخدير في 1-3٪.
- إذا لزم الأمر، واستخدام كليبرز حلق الخلفي من الماوس. ليست هناك حاجة هذا عند استخدام athymic عارية (نو / نو) الفئران.
- تطبيق الضغط على الشركة حزام من القدم الخلفية ممتدة لتقييم مدى كفاية تخدير. إذا يستجيب الماوس للضغط، هناك حاجة إلى مزيد من الوقت للتخدير نافذة المفعول. إذا لزم الأمر، وضبط تدفق التخدير قليلا لتحقيق التخدير الكافي.
- عندما يتم تخدير الماوس بشكل كاف، وتطهير موقع الجراحية مع اليود الجراحية (بتدين) حل تليها70٪ كحول.
- دون قفازات معقمة وثوب، وتطبيق الستائر العقيمة إلى موقع الجراحية. رفع الجلد مرة أخرى مع زوج من ملقط مسنن، واستخدام مقص الخشنة جعل 2-3 سم خط الوسط الظهرية شق.
- باستخدام مقص حادة أو التحقيق، فصل الأدمة الكامنة من جدار الجسم (على كلا الجانبين من شق لتطعيم الثنائية أو على جانب واحد من جانب واحد لترقيع).
- إعادة الماوس في الموقف الجانبي، وتحديد مكان وجود الكلى عن طريق عرض الملف الشخصي الكلوي من خلال جدار العضلات. تطبيق الضغط اليدوي لطيف مع الإبهام والسبابة على البطن قد تساعد في تصور الأعضاء الداخلية.
- باستخدام مقص القزحية الجميلة، ومع الحرص على تجنب السفن الرئيسية والأعصاب في العمود الفقري، وجعل شق 1 سم في الجسم موازية لجدار العمود الفقري. توسيع هذا الشق إلى 1.5-2.0 سم (أطول قليلا من محور طويل من الكلى) عن طريق فتح بلطف مقص أوسع بعد وضعها في شق الأولي.
- من الداخل للظاهر الكلى من خلال تطبيق ضغط لطيف خارج الجدار العضلي على جانبي الكلى باستخدام السبابة والإبهام. شد حواف الجلد تحت الكلى exteriorized، والتي ستقع على جدار الجسم. بينما exteriorized الكلى، والحفاظ على ترطيب الكبسولة الكلوي من خلال تطبيق ملحي معقم.
- باستخدام ملقط غرامة # 5 رفع بلطف الكبسولة الكلى من لحمة في الكلى مع وجود غرامة مشرط، وجعل 2 -4 مم شق في الكبسولة. يتم تحديد حجم شق حسب حجم الكسب غير المشروع، ولكن ينبغي أن يكون الحد الأدنى من أجل الحفاظ على سلامة الكبسولة.
- التلاعب ماصة باستير الزجاج التي تم استخلاصها رقيقة وإطلاق النار مصقول مع نهاية مغلقة تقريب تحت الكبسولة عرضية إلى السطح في الكلى. بلطف فتح جيب كبسولة صغيرة للترقيع، وذلك باستخدام عناية كبيرة لا يلحق الضرر حمة الكلى.
- رفع حافة قطع من كبسولة الكلى مع ملقط غرامة، وأنا الكسب غير المشروعق إدراجها في جيب تحت الكبسولة باستخدام ماصة الزجاج المصقول النار. يمكن وضع عدة ترقيع تحت كبسولة الكلى ومتباعدة على سطح الكلى بالتساوي.
- إذا، خلال التطعيم، يصبح كبسولة المجففة، ينبغي ترطيبها ذلك من خلال تطبيق ملحي معقم.
- عند اكتمال التطعيم، ورفع بلطف جانبي شق الجدار العضلي لتحل محل الكلى مرة أخرى إلى تجويف الجسم. نلاحظ أن ترقيع لا يخرج من تحت الكبسولة.
- إغلاق الجدار العضلي مع خياطة واحدة (4-0، FS-2 VICRYL خياطة). ويمكن تكرار العملية الجراحية على الكلى من خلال اعادة تموضع المقابل الماوس.
- عندما تطعيم كاملة، والماوس قد يخضع تحت الجلد بيليه زرع خلال نفس العملية الجراحية (انظر البروتوكول الخطوة 7).
- باستخدام ملقط مسنن، قم بمحاذاة حواف شق الجلد وتطبيق 2-3 مقاطع الجرح الجراحي لإغلاق الجرح. إدارة التسكين (نستخدم 5-10 ملغ / كغ carprofأون باستخدام الحقن تحت الجلد) ووضع الماوس في موقف راقد الجانبي في القفص الانتعاش. ضمان صيانة درجة حرارة الجسم مع حرارة من مصباح أو وسادة التدفئة. مراقبة عن الشفاء التام من الفأرة، والتي ينبغي أن تحدث في أقل من 15 دقيقة.
- ينبغي التقيد الفئران للساعة 24 المقبل لعلامات الألم بعد الجراحة، والنزيف و / أو غيرها من المضاعفات. بانتظام تفتيش شق جراحي لعلامات العدوى.
- إزالة مقاطع الجرح مع جهاز الجراحية إزالة مقطع الجرح بعد 7-14 أيام من الجراحة.
- كرر الخطوات من 6،1-6،5 من كبسولة الكلوي xenografting إجراء العمليات الجراحية.
- رفع الجلد مرة أخرى مع زوج من ملقط الجلد، واستخدام مقص الخشنة جعل 1-2 سم خط الوسط الظهرية شق.
- باستخدام مقص حادة أو التحقيق، فصل الأدمة الكامنة من جدار الجسم في اتجاه الجمجمة.
- الجلد باستخدام ملقط،رفع بلطف الجانب الجمجمة من شق الجلد، وعقد هرمون بيليه بلطف مع مستقيم، ملقط مسنن، إدراج بيليه والافراج في القفا من الرقبة، في جيب قمت بإنشائه مع التحقيق حادة.
- كرر الخطوات 6،18-6،20 من كبسولة الكلوي xenografting إجراء العمليات الجراحية. إذا أداء زرع تحت الجلد بيليه فقط، استخدم 1 الجراحية مقطع الجرح لإغلاق شق جراحي.
6. الإجراءات الجراحية: كبسولة الكلوي Xenografting
7. الإجراءات الجراحية: زرع تحت الجلد بيليه
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اعتمادا على فرضية لفحصها، الكلوي xenografting كبسولة من الأنسجة أو الخلايا recombinants لا يمكن أن يؤديها في عزلة، أو بالاشتراك مع هرمون تحت الجلد بيليه الزرع. ويتضح التخطيطي للتجربة افتراضية تجمع بين التجربة كبسولة الكلوي xenografting مع هرمون تحت الجلد بيليه الزرع في الشكل 1. مجموعة متنوعة من المواد مسحوق و / أو البلورية يمكن استخدامها في تصنيع الكريات مضغوط مع الصحافة بيليه. يبين الشكل 2 25 ملغ، 12 ملغ و 6 ملغ مضغوط الكريات الهرمون.
ويبين الشكل 3 مثالا من ماصة الزجاج المصقول النار التي استخدمت خلال العملية الجراحية. يمر متعددة من الزجاج ماصة باستور من خلال بنسن لهب الموقد تؤدي في تلميح النار مصقولة، وتقريبه التي يتم استخدامها لإنشاء جيب للترقيع تحت كبسولة الكلى والتلاعب ترقيع تحت كبسولة الكلى.
ntent "> كما هو مبين في الشكل (4)، xenografts الأنسجة الابتدائية من المرضى الذين يعانون من BPH، على أن تستكمل مع هرمون تستوستيرون الخارجية (25 ملغ تحت الجلد بيليه) لمحاكاة الوسط الهرمونية الإنسان الذكور، والبقاء على قيد الحياة هو الحفاظ على بنية الأنسجة (الشكل 4A). أظهرت أيضا في الرقم 4، كبسولة الكلوي ترقيع يمكن استخدامها لتقييم التسرطن الهرمونية. recombinants خلية تحتوي على ظهارة حميدة البروستاتا (BPH-1) واللحمة المتوسطة البولي التناسلي الاستقرائي (مادا) نمت في الفئران غير المعالجة تشكل أورام حميدة (الشكل 4B). نفس الكسب غير المشروع، ونمت في المضيف الذي تلقى الكريات هرمون تحت الجلد من 25 ملغ T و2.5 ملغ E 2 لمدة أربعة أشهر، تطور الى سرطان البروستاتا الذي يغزو الكبسولة الكلوي (الشكل 4C) 5،14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
الشكل 1. التخطيطي الكلوي xenografting كبسولة وبيليه إجراء الزرع. يتم تنفيذ الكلوي كبسولة xenografting عبر نهج ظهري خط الوسط. خلال نفس العملية الجراحية، هو مزروع جراحيا مع الماوس بطيئة الافراج عن هرمون مضغوط تحت الجلد و / أو الكريات المخدرات في الرقبة القفا المنطقة.
الشكل 2. أمثلة من الكريات هرمون مضغوط تصنيعها مع هذا البروتوكول. A. 12 ملغ بيليه. ب 6 ملغ بيليه. C. 25 ملغ بيليه.
الرقم 3. الزجاج باستور ماصة مصقول النار. ماصة النهائي هو المنحني، مع تلميح تقريب سلس مناسبة لخلق بثرةوآخرون لطعم أجنبي تحت كبسولة الكلى. يتم استخدام ماصة أيضا لمعالجة الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى.
الشكل 4. مثال xenografts كبسولة الكلوي. تزرع A. xenografts الأنسجة (النصال) من الأنسجة BPH الإنسان لمدة شهر تحت كبسولة الكلى من الذكور عارية الماوس. وتستكمل المضيف الفأر مع 25 ملغ التستوستيرون بيليه لمحاكاة الوسط الهرمونية للذكور الإنسان. B. xenografts المؤتلف الخليوي (السهام) التي تحتوي على خط البروستاتا الإنسان الظهارية الخلية (BPH-1) واللحمة المتوسطة البولي التناسلي الاستقرائي (مادا) نمت تحت الكلوي كبسولة من الماوس عارية التي لم يتم زرعها مع هرمون بيليه تحت الجلد لمدة أربعة أشهر. خلية C. طعم أجنبي المؤتلف تحتوي على BPH-1 ومادا، ونمت تحت كبسولة الكلى من الماوس عارية أيضا أن خضع الفرعيةالجلدي بيليه غرس 25 ملغ 2.5 ملغ هرمون تستوستيرون واستراديول 17β لمدة أربعة أشهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه الورقة والبروتوكول المبينة في هذه الوثيقة تصف تصنيع هرمون مضغوط و / أو الكريات المخدرات، وإجراء العمليات الجراحية لزرع تحت الجلد بيليه من الفئران. اعتمادا على سؤال البحث إلى معالجة، هذه التقنية يمكن القيام بها منفردة، أو مجتمعة مع الكلوي xenografting كبسولة من الخلايا البروستاتا ترقيع المؤتلف أو البروستاتا xenografts الأنسجة، والتي هي التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في مجال البحوث البروستاتا 17-19. أخذت معا، وهذه التقنيات توفر طريقة فعالة لدراسة التسرطن الهرمونية وتنظيم النمو حميدة في البروستاتا الذي يصيب الانسان والفأر.
صنع بيليه هو بسيط لأداء، استنساخه بسهولة، ويتطلب معدات محدودة. ويمكن تطبيقه على مختلف الهرمونات والمخدرات الاستعدادات. فمن الأهمية بمكان لتنفيذ هذه التقنية في غطاء السلامة الكيميائية، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. لتقييم التجارب البروستاتا التسرطن والثاني تحريض الفئران منفذ المثانة العرقلة نستخدم 25 ملغ T و2.5 ملغ E 2 5،7،15. ويتم اختيار هذه الجرعات لأنها تنتج المطلوب في استجابة الجسم الحي، ولأنها خلق مستويات الهرمون في الدم التي هي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للذكور الإنسان مع عملية المرض من الفائدة 6. قوالب بيليه تسمح العديد من أحجام مختلفة من الكريات التي يمكن تصنيعها، ونحن عادة استخدام 25 ملغ الكريات لتقييم التسرطن والنمو حميدة. اختيار حجم بيليه يعتمد على فرضية لمعالجتها، فضلا عن إنتاج التأثير المطلوب، وإنتاج مستويات تعميم المطلوب ومدة التجربة. إذا تم الجمع بين المخدرات أو هرمون ملزم مع وكيل (مثل الكوليسترول) نوصي خليط متجانس من هرمون وكيل ملزمة.
اعتمادا على هذه الدراسة، تحت الجلد زرع بيليه لا يمكن أن يؤديها الإخصاء التالي من المضيف الذكور 15. في تجربتنا،غرس 25 ملغ من T يسبب ردود فعل تثبيط محور الغدة النخامية الخصية، مما يعوق إفراز الذاتية. لذا اخترنا للمقارنة مع الفئران التي عولجت 25 ملغ T لمحاكاة البيئة الذكورة من الذكور إلى الذكور الإنسان سليمة ولكن دون علاج، مع إفراز T الذاتية الحفاظ عليها. نحن لا تستخدم بشكل روتيني مجموعة يخصوا نظرا لاستجابة ضامرة في البروستاتا والبروستاتا xenografts إلى الاندروجين الانسحاب.
يصف هذا البروتوكول أيضا بإنشاء قطعة من المعدات المتخصصة لالكلوي xenografting كبسولة، والزجاج باستور ماصة مصقول النار. هذا لا يمكن أن يؤديها بسهولة مع أجهزة موجودة في معظم المختبرات، مما أدى إلى أداة جراحية مخصصة من يمكن تصنيعها وتعقيمها قبل استخدامها في إجراء العمليات الجراحية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية أمر مهم لضمان سلامة الموظفين عند إنشاء ماصة الزجاج المصقول النار.
قبل embarkiنانوغرام في أي من العمليات الجراحية الواردة في هذا البروتوكول، يجب مراجعة جميع التقنيات والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية. تتطلب العمليات الجراحية التي أجريت في القوارض التدريب والممارسة في كل الجوانب التقنية لهذا الإجراء، وكذلك مبادئ وممارسات تقنية العقيم. للحصول على مقدمة إلى المعدات والتقنيات الهامة في هذه الإجراءات نوصي الموظفين عرض المخطوطة الفيديو ذكرت مؤخرا من قبل Prichett-كورنينج وآخرون (2011) 20. نوصي أيضا الحصول على جميع الموظفين على التدريب العملي في العمليات الجراحية القوارض وتقنية العقيم.
في المختبر لدينا، وعادة ما يتم تنفيذ هذه الإجراءات مع موظفين اثنين. مساعد الجراحية تدير التخدير، ويلاحظ الحيوانات خلال فترة الانتعاش، ويساعد الجراح مع الجوانب غير معقمة الإجراء ويوثق جميع الإجراءات. يحافظ على الجراح مجال العقيمة، تدير تسكين والثاني بتنفيذ الإجراءات الجراحية الواردة في هذا البروتوكول. مع التخطيط والتدريب المناسب، وإجراء العمليات الجراحية تحت الجلد من هرمون بيليه زرع بسيطة وسهلة لتنفيذ.
هناك عدة اعتبارات التصميم التجريبي لخلية xenografting المؤتلف. كما هو الحال مع أي تجارب باستخدام خطوط الخلايا خلد، وتلوث المهم لتقليل والكشف عنها. لإجراء التجارب باستخدام BPH-1 خطوط الخلايا، نوصي عدد مرور منخفض (أقل من 25). للسيطرة على آثار سدى، ونحن الاستفادة الطعوم تحتوي فقط BPH-1 خلايا للكلية واحدة والطعوم المحتوية على BPH-1 ومادا على الكلى المقابل. للتجارب مصممة لمعالجة الهرمونية التسرطن، ونحن عادة ما يكون شرطا السيطرة غير المعالجة (لا يتم زرع الفأر مع بيليه، أو يتم زرع مع بيليه الكولسترول). الضوابط الإيجابية (هو مزروع الماوس المضيف مع T + E 2 الكريات) لا تقل أهمية عند تقييم ظروف أخرى ثار قد تشجع التسرطن مع هذا النظام النموذجي. اعتمادا على سؤال البحث إلى معالجة، ومدة بيليه الزرع و / أو النمو طعم أجنبي قد تتراوح بين عدة أسابيع إلى أربعة أشهر؛ للتجارب خططت لتتجاوز أربعة أشهر، ونحن نوصي إضافية بيليه زرع للحفاظ على مستويات هرمون الخارجية. التجارب التي تنطوي على حميدة البروستاتا xenografts الأنسجة، من المهم أن ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والحفاظ على الاحتياطات العالمية لمسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم. ويمكن تخزين الأنسجة المقطوع حديثا قبل xenografting ل12-72 ساعة.
تقنية جراحية للكبسولة الكلوي xenografting يتطلب التخطيط والممارسة وبعض البراعة اليدوية. يمكن التقليل من مدة العملية الجراحية، والحفاظ على درجة حرارة الجسم وتقنية جراحية حذرا تخفيف وفيات المحيطة بالجراحة والمضاعفات الجراحية. فرصة الموت المحيطة بالجراحة في تجربتنا يزيد مع مدة سوالإجراء rgical، ولهذا السبب علينا أن نحد من إجراء العمليات الجراحية لمدة لا تزيد على 20-25 دقيقة. استخدام مصباح التدفئة وتسخين الشمع وسادة أثناء الجراحة والإنعاش مثالية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. الرعاية الروتينية بعد العملية هو جانب مهم آخر لنجاح هذا الأسلوب. ينبغي التقيد الفئران خلال الانتعاش التخدير، وفي اليوم التالي لعملية جراحية لعلامات الألم والضيق. إدارة التسكين المناسب لتقليل آلام ما بعد الإجرائية والضيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء المختبر ريك، في الماضي والحاضر. نشكر كالفين باتن، الابن، DVM وبريجيت رابي، DVM، للحصول على تعليقات مفيدة بشأن البروتوكول. نود أن نعترف NIDDK، NCI، ومعهد علوم الصحة البيئية للحصول على الدعم المالي لهذه الدراسات: R01DK093690، R01CA123199، RC2ESO18764. TMN هو متدرب في برنامج التدريب الطبي العلماء في جامعة روتشستر بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة T32 GM07356، والمعاهد الوطنية للصحة تحت L. روث كيرشتاين الخدمة الوطنية بحوث جائزة F30DK093173 كما يدعم هذا المشروع. معتمد من قبل CDV T32CA157322 وABT معتمد من قبل T32ES007015 في جامعة ويسكونسن ماديسون. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
