Summary
We beschrijven de productie van samengeperste hormoon pellets, alsmede subcutane chirurgische implantatie in muizen. Deze strategie kan worden gecombineerd met de groei van cellen en weefsels xenotransplantaten onder de renale capsule van athymische naakt muizen hormonale carcinogenese en regulering van benigne prostaat groei te evalueren.
Abstract
Nieuwe therapieën voor twee veel voorkomende prostaataandoeningen, prostaatkanker (PRCA) en benigne prostaathyperplasie (BPH), afhankelijk zijn van de experimenten evalueren van hun hormoonhuishouding. Sex steroïde hormonen (met name oestrogenen en androgenen) zijn belangrijk in PRCA en BPH, we onderzoeken hun respectieve rol in het veroorzaken van de groei prostaat en carcinogenese bij muizen met experimenten met gecomprimeerde hormoon pellets. Hormonen en / of geneesmiddel pellets gemakkelijk vervaardigd met een korrelpers, chirurgisch geïmplanteerd in het subcutane weefsel van de mannelijke muizengastheer. We een protocol beschrijven ook voor de evaluatie van hormonale carcinogenese door het combineren van subcutane hormoon pellet implantatie met xenografting van prostaat cel recombinanten onder de renale capsule van immuungecompromitteerde muizen. Bovendien subcutane hormoon pellet implantatie in combinatie met renale capsule xenografting van BPH weefsel, nuttig voor een beter begrip hormonale regulatie van goedaardige prostaten groei, en nieuwe behandelingen die sex steroïde hormoon pathways testen.
Introduction
Prostaatkanker (PRCA) en benigne prostaathyperplasie (BPH) zijn significant gezondheidslasten. PRCA is de tweede meest voorkomende solide orgaantransplantatie kanker bij mannen en een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte 1. BPH is ook zeer vaak voor bij oudere mannen, en er wordt geschat dat de klinische manifestatie van BPH, de lagere urinewegen (LUTS), is van invloed op 50-90% van de mannen 2. Terwijl androgenen en oestrogenen zijn bekend belangrijk om in PRCA en BPH, ons begrip van de hormonale mechanismen die ten grondslag liggen aan het ontstaan van kanker en de groei is nog onvolledig 3,4. Eenvoudige en genetisch handelbaar diermodellen ondersteunen de studies die deze prioriteiten zullen met prostaat onderzoek. In hormoon reagerende aandoeningen zoals PRCA en BPH, het gebruik van subcutane, langzame afgifte hormoon pellets, op zich of in combinatie met een renale capsule xenografting (de overdracht van cellen, weefsels of organen van de ene soort in de andere) in het immunocompromised muisgastheer, biedt een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het bestuderen van hormonale regulatie van de groei en carcinogenese.
Subcutaan hormoon pellet implantatie is een eenvoudige en reproduceerbare techniek om hormonale regulatie van carcinogenese en goedaardige groei van de prostaat 5 bestuderen. Subcutane implantatie van volwassen mannelijke muizen met 25 mg testosteron (T) en 2,5 mg 17β-oestradiol (E2), veroorzaakt een toename in serum E2 en geleidelijke afname T, opnieuw de dynamische hormonale milieu van oudere mannen 5,6. Daarnaast is dit model recapituleert veel van de klinische kenmerken van BPH-LUTS 5,7. Alternatieve methoden voor het hormoon toediening omvatten orale / maagsonde of intraperitoneale injectie, die leed veroorzaken bij de knaagdieren, zijn minder consequent in het leveren van dezelfde hoeveelheid geneesmiddel in de tijd, en zijn arbeidsintensiever dan een eenmalige chirurgische implantatie. Andere subcutane modi voor hormone en / of drug delivery omvatten Silastic capsules 8. Terwijl we hebben ook ervaring met het gebruik van Silastic capsules, worden gecomprimeerd pellets favoriet voor hun gebruiksgemak en reproduceerbaarheid. Bovendien afgiftesnelheden van samengeperste hormoon pellets beter na te bootsen de dynamische geslacht steroïde hormoon ratio's waargenomen bij oudere mannen 5,7.
Sinds de ontwikkeling van genetisch immuungecompromitteerde muizen hebben talrijke in vivo modelsystemen waarin xenografting technieken ontwikkeld voor de studie van een grote verscheidenheid van normale en zieke weefsels. Er zijn een aantal standaard categorieën van xenografting. Weefsel xenotransplantaten bestaan uit een klein stukje intacte weefsel, dat een normale structuur, kwaadaardige tumor, of goedaardige groei zijn. Szot et al.. (2007) hebben onlangs verlicht niercapsule xenografting van pancreaseilandjes 9. Aamdal et al.. (1985) beschreven niercapsule xenografting van 27 kanker bij de mens cellijnen in immunocompromised muis biedt 10. Enten kan ook bestaan uit een geïmmortaliseerde cellijn (kanker of niet-tumorigene), of kan bestaan uit een geïmmortaliseerde cellijn in combinatie met cellen geïsoleerd uit mesenchym (cel recombinant graft).
Wij zijn voorstander van xenografting van cel recombinanten de respectieve rol van stroma en epitheel in de ontwikkeling van PRCA en BPH sonde. Cunha et al.. (1980) was de eerste om te melden dat bij volwassen muizen blaas epitheel wordt gecombineerd met embryonale urogenitale sinus mesenchym (UGM) en xenotransplantatie onder de renale capsule van mannelijke muizen gastheren, het weefsel ontwikkelt tot structuren die lijken prostaat acini 11. Norman et al.. (1986) toonden aan dat volwassen muis prostaat ductaal epitheel en UGM, gecombineerd in weefsel recombinanten ondergaan ductale groei en vertakking morfogenese 12. Hayward et al.. (1988) toonden dat menselijke prostaat epitheel aan foetale m inductieveesenchyme soortgelijke wijze 13. Een model van hormonale carcinogenese in de prostaat, door de combinatie van geïmmortaliseerde humane prostaat epitheliale cellijn BPH-1 met UGM, werd eerst beschreven door Wang et al.. 14 (2001) en wordt veelvuldig gebruikt in ons laboratorium 15. Dit model is zeer geschikt voor het begrijpen van PRCA progressie omdat benigne prostaathyperplasie epitheel transformeert naar metastatische ziekte, het modelleren van geavanceerde PRCA bij de mens 5. Omdat specifieke onderdelen genetisch kunnen worden gemanipuleerd, recombinante cel enten is bijzonder bruikbaar als een benadering stroma-epitheliale interacties te evalueren.
Andere sites die geschikt zijn voor xenografting zijn intradermale, subcutane en orthotopische locaties 16. Afhankelijk van het weefsel en ziekteproces plaats kunnen deze geschikt alternatieve benaderingen. Voor de studie van de prostaat hormonale kanker en goedaardige groei regulering, kiezen we de nierkapselsite voor xenografting vanwege de hogere graft nemen tarief, overvloedige bloedtoevoer, en het vermogen om een groter aantal xenograften implanteren in een beperkt plaats 16. Bovendien hormonale manipulatie van de ontvangende muis die resulteert in prostaatatrofie beperkt het gebruik van prostate orthotope enten 16.
Dit protocol beschrijft technieken gecomprimeerde hormoon / geneesmiddel pellet productie en chirurgische implantatie, evenals renale capsule xenografting menselijke prostaatcellen en weefseltransplantaten. Samen vormen deze technieken bieden een gevoelige test om te bepalen of een genetisch gemodificeerde muizen is gevoeliger voor PRCA en / of BPH inleiding dan controlestammen. Xenografting is een krachtige techniek voor in vivo bepaling van de potentie van experimentele cellen histologische en moleculaire kenmerken van maligniteit ontwikkelen, en een test voor nieuwe behandelingsstrategieën voor een breed scala van goedaardige en kwaadaardige ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Compressed Hormoon / Drug Pellet
- Deze procedure moet worden gedaan in een chemisch veiligheidsrapport kap terwijl het dragen van een laboratorium jas, handschoenen, masker, veiligheidsbril, en de motorkap. Om kruisverontreiniging te voorkomen, is het essentieel dat de pellet maken van apparatuur grondig gereinigd met 70% ethanol voor en na fabricage van elk type pellet.
- Met behulp van een analytische schaal en weeg papier, zijn gewenste hoeveelheid hormoon / drug poeder. Ongeveer 5% extra materiaal wordt geadviseerd om verlies tegemoet tijdens het persen.
- Sommige hormonen / geneesmiddelen vereisen een bindmiddel of vulmiddel, die vóór vervaardiging pellet gemengd. Bijvoorbeeld, een 2,5 mg pellet van 17β-oestradiol vervaardigen combineren hormoon 22,5 mg cholesterol, wat resulteert in een 25 mg tablet.
- Breng zorgvuldig in matrijs set, plaats onder de druk en duw de hendel stevig naar beneden tot pellet te comprimeren. Gebruik consistente druk om constant oppervlak te onderhoudeneen-volumeverhouding.
- Vervolgens keren de dobbelsteen houder en duw de hendel weer naar beneden om de pellet los.
- Inspecteer pellet voor integriteit en bepalen of definitieve massa is binnen gewenste bereik. Een aanvaardbaar bereik is een verschil ± 5% van de uiteindelijke massa (bijvoorbeeld een aanvaardbaar bereik voor een 25 mg tablet is 23,8-26,3 mg).
- Pellets kunnen voorafgaand aan de operatie worden gemaakt en opgeslagen (voorwaarden en duur van de opslag is afhankelijk van de stabiliteit van het hormoon of drugs gebruikt in pellet productie). Hormoon pellets kan worden gekocht als een alternatief voor de fabricage pellet. Aankoop pellets vermijdt het gebruik van niet-farmaceutische kwaliteit geneesmiddelen omdat ze worden geformuleerd en samengesteld.
2. Voorbereiding van de Cel Recombinant Xenografts
- Oogst en cultuur primaire muis urogenitale mesenchym (UGM) stromale cellen voor minder dan 4 weken voordat het wordt verzameld voor het tellen.
- Cultuur vereeuwigd prostaat epitheliale cellijnen in de gebruikelijke fashion en het verzamelen voor het tellen. Voor dit voorbeeld bereid recombinante cel enten door mengen 100.000 BPH-1 epitheelcellen per graft met 250.000 UGM stromale cellen per graft in suspensie.
- Pellet cellen samen en opnieuw te schorten in voldoende geneutraliseerd type 1 rattenstaart collageen om gewenste aantal enten, elk merk in een volume van 25 pl 50 pl.
- Stel recombinant enten bij 37 ° C gedurende 15 minuten en vervolgens bedekken met groeimedium voor opslag bij 37 ° C gedurende maximaal 48 uur voor enten.
3. Voorbereiding van Tissue Xenografts
- Handhaaf universele voorzorgsmaatregelen voor door bloed overgebrachte ziekteverwekkers tijdens de verkrijging van weefsels en chirurgische ingreep. Na goedkeuring Institutional Review Board en geïnformeerde toestemming, krijgen vers prostaatweefsel van chirurgische resectie. Voor studies van BPH groei, kunnen weefsels worden geoogst van transurethrale resectie van de prostaat of eenvoudige prostatectomie procedures. Primaire xenograften PRCA of goedaardige prostaten weefsel kan worden verkregen bij radicale prostatectomie exemplaren.
- Store verzamelde weefsel in een isotone gebufferde mobiele media of fysiologische zoutoplossing op ijs. Afhankelijk van het weefsel en opslagcondities kunnen monsters worden bewaard gedurende 24 uur vóór de bereiding van weefseltransplantaten. Dikwijls wordt het model verdelen in drie stukken, met een in formaline gefixeerde en routinematig verwerkt voor histologie sectie, een stuk snap ingevroren voor moleculaire analyse en een stuk verder verdeeld in weefsel xenotransplantaties (1-3 mm groot).
4. Voorbereiding van Fire gepolijst glas Pipette
- Het dragen van oogbescherming, laboratoriumjas en hittebestendige handschoenen, plaats glas Pasteur pipet tip in bunsenbrander vlam op ongeveer een hoek van 60 ° te beginnen.
- Houd een constante lichte beweging de pipet om hot spots te voorkomen.
- Teken de tip dun en brand-polijsten met als doel een licht gebogen uiteinde met een afgeronde, gesloten tip. 5. Voorbereiding van instrumenten en chirurgische Suite
- Autoclaaf alle instrumenten. Voorafgaand aan de operatie, inzage krijgen in alle instrumenten, en zorg ervoor dat steriele veld te handhaven.
- Opgezet steriele chirurgische gebied met absorberende pads, dissectie scope, anesthesie neuskegel, chirurgische instrumenten en warmtelamp gericht op het werkgebied. Om instrumenten te steriliseren in tussen muizen, voorverwarmen kraal sterilisator.
- Assembleren en testen anesthesietoestel; wegen gas aaseter.
- Met behulp van de magnetron, warmte wax pads voor maximaal 5 minuten (in stappen van 1 min, kneden de was muismat om gesmolten en unmelted wax combineren) bij 70-80% vermogen, totdat al de was gelijkmatig wordt gesmolten. Door aanraking, zorgen voor de pad is niet te warm en plaats onder de lege knaagdier herstel kooi.
- Don persoonlijke beschermingsmiddelen voor knaagdier chirurgische ingrepen, waaronder chirurgisch masker, muts, handschoenen en toga.
- Alle procedures waarbij proefdieren moeten worden uitgevoerd met toestemming van de institutionele Animal Care en gebruik commissies. Voorafgaand aan de inleiding van de anesthesie, observeren de muis om gezondheid en welzijn te garanderen.
- Plaats de muis in de kamer voor de inductie van isofluraananesthesie op 3-5%. Als het dier niet meer beweegt en ademfrequentie is gedaald, over te dragen aan neuskegel in buikligging en anesthesie te handhaven op 1-3%.
- Gebruik indien nodig tondeuse aan de achterkant van de muis te scheren. Dit is niet noodzakelijk bij gebruik van athymische naakt (nu / nu) muizen.
- Druk stevig op de band van de verlengde achterste voet naar de toereikendheid van de anesthesie te evalueren. Als de muis reageert op druk, is er meer tijd nodig is voor de narcose door te voeren. Pas zo nodig anesthesie stroom iets naar geschikte anesthesie te bereiken.
- Wanneer de muis voldoende is verdoofd, ontsmet de chirurgische site met chirurgische jood (Betadine) oplossing, gevolgd door70% alcohol.
- Don steriele handschoenen en toga; steriele doeken van toepassing op de operatiewond. Til de achterste huid met een paar getande tang en met de grove schaar maken 2-3 cm dorsale middellijn incisie.
- Met stompe schaar of een probe, scheid de onderliggende dermis van de lichaamswand (aan beide zijden van de incisie voor bilaterale enten of naast unilaterale enten).
- Verplaats de muis in zijligging, en identificeren van de locatie van de nier door het bekijken van de renale profiel door de spierwand. Het toepassen van lichte manuele druk met de duim en wijsvinger op de buik kan helpen bij het visualiseren van de interne organen.
- Met behulp van fijne iris schaar, en het verzorgen van grote schepen en spinale zenuwen te voorkomen, maak dan een 1 cm incisie in het lichaam muur parallel aan de wervelkolom. Widen deze incisie 1,5-2,0 cm (iets langer dan de lange as van de nier) door voorzichtig openen van de schaar bredere nadat ze in de eerste incisie.
- Exterioriseren de nier door toepassen van lichte druk buiten de spierwand aan weerszijden van de nier met de wijsvinger en duim. Stop de huidranden onder de geëxterioriseerde nier, die rusten op de lichaamswand. Terwijl de nier exteriorized handhaven hydratatie van de renale capsule door toepassing steriele zoutoplossing.
- Met behulp van fijne # 5 tang til de nier capsule uit het parenchym van de nieren en met een fijne scalpel, maak een 2 -4 mm incisie in de capsule. De grootte van de incisie wordt bepaald door de grootte van het transplantaat, maar moet worden geminimaliseerd teneinde de integriteit van de capsule te behouden.
- Manipuleren een glazen Pasteur pipet die is dun en vuur-gepolijst getekend met een afgeronde gesloten uiteinde onder de capsule raakt aan het oppervlak van de nier. Opent voorzichtig een kleine capsule zak voor het enten, met behulp van grote zorg de nierparenchym niet te beschadigen.
- De snijkant van de nier capsule wordt opgeheven met de fijne tang, en de graft is in de zak gestoken onder de capsule met behulp van de brand gepolijst glazen pipet. Verschillende grafts onder de nier capsule geplaatst en gelijkmatig over het oppervlak nieren.
- Indien tijdens enten, de capsule uitgedroogd, moet worden bevochtigd door toepassing steriele zoutoplossing.
- Wanneer enten voltooid, til de zijkanten van de spierwand incisie aan de nier terug in de lichaamsholte te vervangen. Merk op dat de transplantaten niet uitglijden van onder de capsule.
- Sluit de spier muur met een enkele hechting (4-0, FS-2 vicryl hechtdraad). De chirurgische procedure kan worden herhaald op het contralaterale nier door herpositionering van de muis.
- Bij veredeling is voltooid, kan de muis onderhuidse pellet implantatie ondergaan tijdens dezelfde operatie (zie Protocol stap 7).
- Met behulp van getande tang, lijn de huid incisie randen en 2-3 operatiewond clips van toepassing op de incisie te sluiten. Dien analgesie (we gebruiken 5-10 mg / kg carprofen met behulp van een subcutane injectie) en plaats de muis in de zijligging in het herstel kooi. Zorgen voor het onderhoud van de lichaamstemperatuur met warmte van een lamp of verwarming pad. Let op voor volledig herstel van de muis, die moet optreden bij minder dan 15 minuten.
- Muizen worden waargenomen voor de volgende 24 uur op tekenen van postoperatieve pijn, bloeden en / of andere complicaties. Controleer regelmatig chirurgische incisie op tekenen van infectie.
- Verwijder wond clips met chirurgische wond clip verwijdering apparaat 7-14 dagen na de operatie.
- Herhaal de stappen 6,1-6,5 van nierkapsel xenografting chirurgische ingreep.
- Til de achterste huid met een paar pincetten huid en met de grove schaar maken 1-2 cm dorsale middellijn incisie.
- Het gebruik van botte schaar of een sonde, scheiden de onderliggende dermis uit het lichaam muur in een craniale richting.
- Behulp van de huid van een tang,til de craniale aspect van de huid incisie, en houdt het hormoon pellet voorzichtig met rechte, getande tang, plaatst u de pellet en laat bij het nekvel, in de zak die u hebt gemaakt met de stompe sonde.
- Herhaal de stappen 6,18-6,20 uit nierkapsel xenografting chirurgische ingreep. Als het uitvoeren van onderhuidse pellet implantatie alleen, gebruik dan 1 operatiewond clip om de chirurgische incisie te sluiten.
6. Chirurgische Procedure: Renal Capsule Xenografting
7. Chirurgische Procedure: Onderhuids Pellet Implantatie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhankelijk van de hypothese te testen, kan niercapsule xenografting van weefsels of cellen recombinanten worden uitgevoerd op zichzelf of in combinatie met subcutane hormoon pellet implantatie. Een schema van een hypothetische experiment combineren renale capsule xenografting experiment subcutane implantatie hormoon pellet wordt geïllustreerd in figuur 1. Een verscheidenheid van poeder-en / of kristallijne stoffen kunnen worden gebruikt bij de vervaardiging van samengeperste tabletten met de korrelpers. Figuur 2 toont 25 mg, 12 mg en 6 mg gecomprimeerd hormoon pellets.
Figuur 3 toont een voorbeeld van het vuur gepolijste glazen pipet gebruikt tijdens de chirurgische procedure. Meerdere passages van een glas Pasteur pipet door bunsenbrander vlam resulteren in brand-gepolijste, afgeronde tip dat wordt gebruikt om een zak voor enten maken onder de renale capsule en enten te bewerken onder de renale capsule.
ntent "> Zoals getoond in figuur 4, primaire weefsel xenotransplantaten van patiënten met BPH, aangevuld met exogeen testosteron (25 mg subcutaan pellet) te simuleren de mannelijke menselijke hormonale milieu, overleven en de weefselarchitectuur blijft behouden (Figuur 4A). Ook is in Figuur 4, kan renale capsule enten worden hormonale carcinogenese evalueren. Cell recombinanten die benigne prostaat epitheel (BPH-1) en inductieve urogenitale mesenchym (UGM) gekweekt in onbehandelde muizen vormen goedaardige gezwellen (Figuur 4B). Dezelfde transplantaat, gekweekt een host die onderhuidse hormoon pellets van 25 mg T en 2,5 mg E 2 ontvangen gedurende vier maanden, ontwikkelt zich tot prostaatcarcinoom dat de renale capsule (Figuur 4C) 5,14 binnenvalt.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische voorstelling van nierkapsel xenografting en pellet implantatie procedure. Is Nier capsule xenografting uitgevoerd via een dorsale middellijn aanpak. Tijdens dezelfde operatie, wordt de muis operatief geïmplanteerd met slow-releasing hormoon subcutane gecomprimeerd en / of drugs pellets in de nek nekvel regio.
Figuur 2. Voorbeelden van gecomprimeerde hormoon pellets vervaardigd met het huidige protocol. A. 12 mg pellet. B. 6 mg pellet. C. 25 mg pellet.
Figuur 3. Brand gepolijst glas Pasteur pipet. De afgewerkte pipet is gebogen, met een afgeronde tip geschikt voor het creëren van een pocket voor de xeno onder de renale capsule. De pipet wordt ook gebruikt om het implantaat te bewerken onder de renale capsule.
Figuur 4. Voorbeeld van renale capsule xenograften. A. Tissue xenografts (pijlpunten) van menselijk weefsel BPH worden gekweekt voor een maand onder de renale capsule van een mannelijk naakt muis. De muizengastheer is aangevuld met 25 mg testosteron pellet te simuleren de hormonale milieu van de menselijke man. B. Cell recombinante xenografts (pijlpunten) humaan prostaat epitheliale cellijn (BPH-1) en inductieve urogenitale mesenchym (UGM) onder de renale gekweekt capsule van een naakt muis die niet werd geïmplanteerd met een subcutane hormoon pellet gedurende vier maanden. C. Cell recombinant xeno met BPH-1 en UGM, onder de renale capsule van een naakt muis die ook onderging sub gegroeidpellet cutane implantatie van 25 mg testosteron en 2,5 mg 17β-oestradiol vier maanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document en de beschreven protocol hierin de vervaardiging van gecomprimeerde hormoon en / of drugs pellets, en de chirurgische procedure voor subcutane pellet implantatie van muizen te beschrijven. Afhankelijk van de onderzoeksvraag worden aangepakt, kan deze techniek worden uitgevoerd afzonderlijk, of in combinatie met een nier capsule xenografting van prostaat cel recombinant transplantaten of prostaatweefsel xenograften, welke technieken op grote schaal gebruikt in prostate onderzoek 17-19 zijn. Tezamen bieden deze technieken bieden u een krachtige aanpak van hormonale carcinogenese en regulering van goedaardige groei in de mens en muis prostaat bestuderen.
Pellet vervaardiging is eenvoudig uit te voeren, eenvoudig reproduceerbaar en vereist weinig apparatuur. Het kan op diverse hormonen en drugs preparaten. Het is cruciaal om deze techniek uit te voeren in een chemisch veiligheidsrapport kap, en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Voor experimenten beoordelen prostaat carcinogenese eennd inductie van muizen obstructie van de blaas gebruiken we 25 mg T en 2,5 mg E 2 5,7,15. Deze doses worden gekozen omdat ze het gewenste in vivo reactie en omdat serum hormoonniveaus die fysiologisch relevante menselijke mannen met het ziekteproces plaats 6 te creëren. Pellet mallen kunnen meerdere verschillende maten pellets worden vervaardigd; we gebruiken meestal 25 mg pellets voor het evalueren van carcinogenese en goedaardige groei. Keuze van de pellet hangt af van de hypothese worden aangepakt, en de productie van een gewenst effect, de productie van gewenste bloedspiegels en de duur van het experiment. Als middel of hormoon wordt gecombineerd met een bindmiddel (zoals cholesterol) aanbevolen een homogeen mengsel van hormonen en bindmiddel.
Afhankelijk van de studie, kan onderhuidse pellet implantatie worden uitgevoerd na castratie van de mannelijke gastheer 15. In onze ervaring,implantatie van 25 mg van T veroorzaakt feedback inhibitie van de hypothalamus-hypofyse-testiculaire as remmen endogene secretie. Daarom kiezen we ervoor om te vergelijken muizen behandeld met 25 mg T te simuleren de androgene omgeving van de mens mannelijk intact maar onbehandelde mannen, met een endogene T afscheiding gehandhaafd. We hebben niet routinematig gebruik een castreren gastheer door de atrofische respons van de prostaat en prostaatkanker xenotransplantaten androgeen terugtrekking.
Dit protocol beschrijft ook de oprichting van een stuk van gespecialiseerde apparatuur voor niercapsule xenografting, de brand-gepolijst glas Pasteur pipet. Dit kan gemakkelijk worden uitgevoerd met apparatuur aanwezig in de meeste laboratoria, waardoor een aangepast chirurgisch instrument dan kan worden vervaardigd en gesteriliseerd in de chirurgische procedure. Het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen is van belang om veiligheid van het personeel te garanderen bij het maken van de brand gepolijst glazen pipet.
Vóór embarking op een van de chirurgische ingrepen die in dit protocol moeten alle technieken worden beoordeeld en door de institutionele Animal Care en gebruik Comite. Chirurgische ingrepen uitgevoerd bij knaagdieren vereisen opleiding en praktijk in zowel de technische aspecten van de procedure, evenals de principes en de praktijk van aseptische techniek. Voor een kennismaking met de apparatuur en technieken van belang in deze procedures adviseren wij personeel bekijk de video manuscript onlangs gemeld door Prichett-Corning et al.. (2011) 20. We raden ook aan alle medewerkers ontvangen hands-on training in knaagdieren chirurgische procedures en aseptische techniek.
In ons laboratorium worden deze procedures meestal uitgevoerd met twee medewerkers. De chirurgische assistent beheert anesthesie, merkt dieren tijdens het herstel, helpt de chirurg met niet-steriele aspecten van de procedure en documenteert alle procedures. De chirurg handhaaft het steriele veld, beheert analgesie eennd voert de chirurgische procedures die in dit protocol. Met de juiste planning en training, de chirurgische procedure van subcutane hormoon pellet implantatie is eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren.
Er zijn verschillende experimentele overwegingen bij het ontwerp voor mobiele recombinant xenografting. Zoals met alle experimenten gebruik geïmmortaliseerde cellijnen verontreiniging belangrijk te minimaliseren en te detecteren. Voor experimenten met BPH-1 cellijnen, raden we een lage passage aantal (minder dan 25). Om controle voor de effecten van de stroma, gebruiken we grafts die enkel BPH-1 cellen voor een nier en enten met BPH-1 en UGM de contralaterale nier. Voor experimenten ontworpen om hormonale carcinogenese te pakken, we hebben meestal een onbehandelde controle conditie (muis is niet geïmplanteerd met een pellet, of wordt geïmplanteerd met een cholesterol pellet). Positieve controles (host muis wordt geïmplanteerd met T + E 2 pellets) zijn even belangrijk bij de beoordeling van andere aandoeningen that kan carcinogenese bevorderen met dit model systeem. Afhankelijk van de onderzoeksvraag worden aangepakt, kan de duur van pellet implantatie en / of xeno-groei variëren van enkele weken tot vier maanden, voor experimenten gepland om maximaal vier maanden, raden wij extra pellet implantatie voor exogene hormonen op peil te houden. Voor experimenten met goedaardige prostaatweefsel xenograften, is het belangrijk om de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen dragen en universele voorzorgsmaatregelen voor door bloed overgebrachte ziekteverwekkers te behouden. Vers geoogste weefsel kan worden opgeslagen voorafgaand aan xenografting voor 12-72 uur.
De chirurgische techniek voor nierkapsel xenografting vereist planning, praktijk en een aantal handvaardigheid. Het minimaliseren van de duur van de chirurgische procedure handhaven lichaamstemperatuur en zorgvuldige chirurgische techniek kan perioperatieve mortaliteit en chirurgische complicaties verminderen. De kans op perioperatieve dood in onze ervaring neemt toe met de duur van de surgical procedure, om deze reden beperken we de chirurgische ingreep om niet langer dan 20-25 minuten. Gebruik van een warmtelamp en opgewarmd was pad tijdens de operatie en het herstel is ideaal voor het handhaven lichaamstemperatuur. Routine postoperatieve zorg is een ander belangrijk aspect van het succes van deze techniek. Muizen moeten worden geobserveerd tijdens de anesthesie herstel, en de dag na de ingreep op tekenen van pijn en angst. Dien passende pijnstilling aan post-procedurele pijn en leed te minimaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle leden van de Ricke lab, heden en verleden te bedanken. Wij danken Calvin Patten, Jr, DVM en Brigitte Raabe, DVM, voor nuttige opmerkingen met betrekking tot het protocol. Wij willen de NIDDK, NCI, en NIEHS erkennen voor hun financiële steun voor deze studies: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN is een stagiair in het Medisch Scientist Training Program aan de Universiteit van Rochester gefinancierd door NIH T32 GM07356; NIH onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 ondersteunt ook dit project. CDV wordt ondersteund door T32CA157322 en ABT wordt ondersteund door T32ES007015 bij de Universiteit van Wisconsin-Madison. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen of NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
- Cancer Facts Figures. 4, American Cancer Society. (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
