Summary
Descreve-se o fabrico de peletes de hormonas comprimidos, bem como a implantação cirúrgica subcutânea em ratos. Esta estratégia pode ser combinado com o crescimento de células e de tecidos de xenoenxertos sob a cápsula renal de ratinhos nus atímicos para avaliar a carcinogénese hormonal e regulação do crescimento benigno da próstata.
Abstract
Novas terapias para duas doenças comuns da próstata, o cancro da próstata (AEP) e hiperplasia benigna da próstata (HBP), dependem criticamente experimentos avaliando sua regulação hormonal. Os hormônios sexuais esteróides (nomeadamente andrógenos e estrógenos) são importantes na AEP e BPH, nós sondar os seus respectivos papéis na indução do crescimento da próstata e carcinogênese em ratos com experimentos usando pelotas hormonais compactados. Hormonais e / ou drogas pellets são facilmente fabricado com uma imprensa da pelota, e cirurgicamente implantadas no tecido subcutâneo do hospedeiro macho mouse. Descrevemos também um protocolo para a avaliação da carcinogênese hormonal combinando subcutânea implantação hormônio pellet com xeno de recombinantes células da próstata sob a cápsula renal de ratos imunocomprometidos. Além disso, o hormônio subcutâneo pellet implantação, em combinação com xeno cápsula renal de tecido de BPH, é útil para compreender melhor regulação hormonal de prost benignocomeu o crescimento, e para testar novas terapias dirigidas sexo esteróide vias hormonais.
Introduction
O câncer de próstata (AEP) e hiperplasia prostática benigna (BPH) são encargos significativos para a saúde. AEP é o segundo câncer de órgão sólido mais prevalente em homens e uma das principais causas de câncer relacionados com a morte 1. HBP também é altamente prevalente entre os homens mais velhos, e estima-se que a manifestação clínica da HBP, os sintomas do trato urinário inferior (LUTS), vai afetar 50-90% dos homens 2. Enquanto andrógenos e estrógenos são conhecidos por serem importantes na AEP e BPH, a nossa compreensão dos mecanismos hormonais que sustentam a carcinogênese e crescimento permanece incompleta 3,4. Modelos animais geneticamente simples e tratável sustentar os estudos que irão abordar estas prioridades em pesquisa de próstata. Em doenças responsivas hormonais como AEP e BPH, o uso da via subcutânea, pelotas de hormônios de liberação lenta, de forma isolada ou em combinação com renal xeno cápsula (a transferência de células, tecidos ou órgãos de uma espécie para outra) na immunocomphospedeiro romised mouse, fornece um método simples e reprodutível para o estudo de regulação hormonal do crescimento e carcinogênese.
A implantação subcutânea hormônio pellet é uma técnica simples e reprodutível para estudar regulação hormonal da carcinogênese e do crescimento benigno na próstata 5. A implantação subcutânea de ratinhos macho adulto com 25 mg de testosterona (T) e 2,5 mg de 17β-estradiol (E2), provoca um aumento no soro e 2 e decréscimo gradual em T, recriando o ambiente hormonal dinâmica de homens idosos 5,6. Além disso, este modelo recapitula muitas das características clínicas da HPB-LUTS 5,7. Métodos alternativos de administração de hormônios incluem a administração oral / gavage ou injeção intraperitoneal, que causam sofrimento ao roedor, são menos consistentes no fornecimento da mesma quantidade de droga ao longo do tempo, e são mais do que um implante cirúrgico de um tempo de trabalho intensivo. Outros modos para subcutâneas hormone e / ou a entrega da droga incluem cápsulas Silastic 8. Enquanto nós também temos experiência com o uso de cápsulas de Silastic, pelotas comprimidas são favorecidos pela sua facilidade de uso e reprodutibilidade. Além disso, as taxas de liberação de hormônio de pelotas comprimidas melhor imitar os rácios de esteróides sexuais dinâmicas hormonais observados nos homens idosos 5,7.
Desde o desenvolvimento de ratinhos geneticamente imunocomprometidos, numerosos sistemas modelo in vivo incorporando técnicas xeno ter sido desenvolvido para o estudo de uma ampla variedade de tecidos normais e doentes. Existem várias categorias de base do xeno. Xenoenxertos de tecidos consistem de um pequeno pedaço de tecido intacto, o que pode ser uma estrutura normal, tumor maligno ou benigno do crescimento. Szot et al. (2007), recentemente iluminada xeno cápsula renal de ilhotas pancreáticas 9. Aamdal et al. (1985) descreveu xeno cápsula renal de 27 linhas celulares de cancro humano em imrato munocompromised hospeda 10. Enxertos também pode ser composto por uma única linha de células imortalizada (canceroso ou não tumorigénico), ou pode consistir de uma linha de células imortalizada combinada com células isoladas a partir de mesênquima (enxerto de células recombinante).
Somos a favor de xeno de recombinantes células para investigar os respectivos papéis do estroma e epitélio no desenvolvimento da AEP e BPH. Cunha et al. (1980) foi o primeiro a relatar que quando adulto murino epitélio da bexiga é combinado com mesênquima embrionário seio urogenital (UGM) e xenoenxertados sob a cápsula renal de ratos hospedeiros machos, o tecido se desenvolve em estruturas semelhantes a ácinos próstata 11. Norman et al. (1986) mostraram que ratinhos adultos ductal da próstata e epitélio UGM, quando combinados em recombinantes de tecido, são submetidos a um crescimento e ramificação ductal morfogénese 12. Hayward et al. (1988) mostrou que o epitélio da próstata humano responde a indutivos m fetalesenchyme de uma forma semelhante 13. Um modelo de carcinogénese hormonal na próstata, ao combinar a linha de células epiteliais imortalizadas da próstata humana BPH-1 com UGM, foi relatado pela primeira vez por 14 Wang et al. (2001) e tem sido amplamente utilizado no nosso laboratório 15. Este modelo é bem adequado para a compreensão progressão PRCA porque epitélio benigna da próstata se transforma em doença metastática, modelagem avançada PRCA em humanos 5. Como os componentes específicos podem ser geneticamente manipulados, enxertia de células recombinante é particularmente útil como uma abordagem para avaliar as interacções de estroma-epitelial.
Outros locais adequados para xeno são intradérmica, subcutânea e locais ortotópico 16. Dependendo do processo de tecidos e doença de interesse, estes podem ser abordagens alternativas adequadas. Para o estudo da carcinogênese hormonal da próstata e regulação do crescimento benigno, escolhemos a cápsula renalsite para xeno devido às suas maiores enxerto tomar forma, o fornecimento de sangue abundante e capacidade de implantar um maior número de enxertos em um local confinado 16. Além disso, a manipulação hormonal do ratinho hospedeiro que resulta em atrofia prostática limita o uso da próstata enxerto ortotópico 16.
Este protocolo descreve técnicas de fabrico comprimido hormona / droga sedimento e a implantação cirúrgica, bem como xeno cápsula renal de células da próstata humana e tecido de enxertos. Em conjunto, estas técnicas proporcionam um ensaio sensível para determinar se um rato geneticamente modificado é mais susceptível a PRCA e / ou de iniciação BPH do que as estirpes de controlo. Xeno é uma técnica poderosa para a avaliação in vivo do potencial de células experimentais para o desenvolvimento histológica e as características moleculares de malignidade, bem como um ensaio para novas estratégias de tratamento para uma grande variedade de doenças benignas e malignas.
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Protocol
1. Preparação do comprimido hormonal / Drogas Pellet
- Este procedimento deve ser feito em uma capa de segurança química, enquanto vestindo um casaco de laboratório, luvas, máscara, óculos de segurança, e capô. Para evitar a contaminação cruzada, é essencial que o equipamento de fabricação sedimento é cuidadosamente limpa com etanol a 70% antes e depois do fabrico de cada tipo de sedimento.
- Usando uma balança analítica e pesar papel, medir a quantidade desejada de pó de hormônio / drogas. Cerca de 5% de material adicional é recomendado para acomodar a perda durante a prensagem.
- Algumas hormonas e / ou drogas requer um agente de ligação ou de enchimento, que é misturada antes da pelota fabrico. Por exemplo, para a fabricação de um 2,5 mg de pelotas de 17β-estradiol, combinar a hormona com 22,5 mg de colesterol, o que resulta em um 25 mg de pelotas.
- Transferir cuidadosamente em conjunto morrer, lugar sob a imprensa e empurre a alavanca firmemente para baixo para comprimir pelota. Use pressão consistente para manter a superfície constante sãoum em relação ao volume.
- Próxima reverter o suporte da matriz e empurre a alavanca para baixo novamente para liberar o sedimento.
- Inspecione pelota para a integridade e determinar se massa final está dentro da faixa desejada. Um intervalo aceitável é uma diferença de ± 5% da massa final (por exemplo, uma gama aceitável para uma pastilha de 25 mg é 23,8-26,3 mg).
- Pelotas pode ser feita antes da cirurgia e armazenado (condições e tempo de armazenamento depende da estabilidade do hormônio ou medicamento usado na fabricação de pelotas). Pelotas de hormônio pode ser comprado como uma alternativa para agregar fabricação. Adquirindo pelotas evita o uso de drogas da classe não-farmacêuticas, uma vez que serão formuladas e agravado.
2. Preparação de células recombinantes Xenoenxertos
- Colheita e cultura primária rato mesenchyme urogenital (UGM) células estromais para menos de 4 semanas antes de ser recolhida para a contagem.
- Cultura imortalizado próstata linhagens de células epiteliais no fash habitualíon e recolher para a contagem. Para este exemplo, preparar os enxertos de células recombinantes por mistura de 100.000 células BPH-1 epiteliais por enxerto com 250.000 células estromais UGM por enxerto em suspensão.
- Células de pellets em conjunto e re-suspender o suficiente colágeno tipo neutralizado 1 cauda de rato para fazer número desejado de enxertos, cada um em um volume de 25 mL a 50 mL.
- Definir enxertos recombinantes a 37 ° C durante 15 minutos e, em seguida cobrir com meio de crescimento durante o armazenamento a 37 ° C durante até 48 horas antes da enxertia.
3. Preparação de xenoenxertos de tecidos
- Manter precauções universais para patógenos transmitidos pelo sangue durante a colheita de tecidos e procedimento cirúrgico. Após aprovação do conselho de revisão institucional e consentimento informado, obter o tecido da próstata fresco de ressecção cirúrgica. Para estudos de crescimento HBP, os tecidos podem ser colhidos a partir de ressecção transuretral da próstata ou procedimentos de prostatectomia simples. Xenografts primárias da AEP ou prost benignoComeram tecido pode ser obtida a partir de amostras de prostatectomia radical.
- Loja colhido tecido em mídia isotônicas buffer celulares ou soro fisiológico no gelo. Dependendo das condições do tecido e armazenamento, as amostras podem ser armazenadas até 24 horas antes da preparação de enxertos de tecidos. A prática comum é dividir a amostra em três partes, com uma seção fixa em formalina e processados rotineiramente para histologia, uma peça congeladas rapidamente para análise molecular e uma peça dividida em enxertos de tecido (1-3 mm de tamanho).
4. Preparação de fogo polido vidro Pipeta
- Luvas resistentes a usar óculos de protecção, bata de laboratório e de calor, lugar de vidro Pasteur pipeta ponta em bico de Bunsen chama em um ângulo de aproximadamente 60 ° para começar.
- Manter um, um ligeiro movimento constante para a pipeta, de modo a evitar pontos quentes.
- Desenhe a ponta fina e fogo-polonês com o objetivo de ser um final ligeiramente curvo com um arredondado, ponta fechada. 5. Preparação de Instrumentos e centro cirúrgico
- Autoclave todos os instrumentos. Antes da cirurgia, inspecionar todos os instrumentos, tendo o cuidado de manter o campo estéril.
- Configure área cirúrgica esterilizada com absorventes, o escopo de dissecação, anestesia nariz cone, instrumentos cirúrgicos e lâmpada de aquecimento direcionado para a área de trabalho. Para esterilizar ferramentas entre ratos, Pré-aquecer esterilizador talão.
- Montar e aparelho de anestesia teste; pesar limpador de gás.
- Usando as microondas, pastilhas de cera de calor por até 5 minutos (em incrementos de 1 min, amassar o bloco de cera, a fim de combinar derretido e unmelted cera) em 70-80% de energia, até que toda a cera é derretida uniformemente. Ao toque, garantir a almofada não está muito quente e colocar sob a gaiola de recuperação roedor vazio.
- Don equipamento de protecção individual para procedimentos cirúrgicos de roedores, incluindo máscara cirúrgica, gorro, luvas e bata.
- Todos os procedimentos que envolvam animais de pesquisa deve ser feita com a aprovação de cuidados de animais de uso institucional e comitês. Antes da indução da anestesia, observar o mouse para garantir a saúde e bem-estar.
- Posicione o mouse na câmara de indução da anestesia isoflurano em 3-5%. Quando o animal parou de se mover e freqüência respiratória diminuiu, a transferência para o nariz cone na posição prona, e manter a anestesia em 1-3%.
- Se necessário, use tesouras para raspar a parte de trás do mouse. Isso não é necessário quando se utiliza nuas (nu / nu) ratos atímicos.
- Aplique uma pressão firme para o cinto da pata traseira estendida para avaliar a adequação da anestesia. Se o mouse responde à pressão, é necessário mais tempo para a anestesia fazer efeito. Se necessário, ajustar o fluxo anestesia ligeiramente para atingir anestesia adequada.
- Quando o mouse está devidamente anestesiados, desinfete o local da cirurgia com a solução (Betadine) iodo cirúrgico seguido de70% de álcool.
- Don luvas estéreis e vestido; aplicar campos estéreis para o local da cirurgia. Levante a pele para trás com um par de pinças dentadas, e usar a tesoura grosseiros fazer um 2-3 cm dorsal incisão mediana.
- Utilizando uma tesoura sem corte ou uma sonda, separar a derme subjacente a partir da parede do corpo (em ambos os lados da incisão para enxertos bilaterais ou de um lado para o enxerto unilateral).
- Reposicionar o mouse para a posição lateral, e identificar a localização do rim, visualizando o perfil renal através da parede muscular. Aplicando pressão manual suave com o polegar eo dedo indicador no abdômen pode ajudar com a visualização de órgãos internos.
- Com uma tesoura de íris finos, e tendo o cuidado de evitar grandes vasos e nervos espinhais, fazer uma incisão de 1 cm na parede do corpo paralelo à coluna vertebral. Ampliar esta incisão para 1,5-2,0 cm (um pouco mais do que o longo eixo do rim), abrindo delicadamente a tesoura mais amplo depois de colocá-los na incisão inicial.
- Exteriorizar o rim através da aplicação de uma leve pressão do lado de fora da parede do músculo em cada lado do rim com o dedo indicador e polegar. Tuck as bordas da pele abaixo do rim exteriorizada, que vai descansar na parede do corpo. Embora o rim é exteriorizado, manter a hidratação da cápsula renal através da aplicação de solução salina estéril.
- Usando finas # 5 fórceps levante cuidadosamente a cápsula renal do parênquima do rim e com um bom bisturi, faça uma incisão de 2 mm -4 na cápsula. O tamanho da incisão é determinado pelo tamanho do enxerto, mas deve ser minimizada, a fim de manter a integridade da cápsula.
- Manipular uma pipeta de Pasteur de vidro, que foi desenhada e fina-fogo polido com uma extremidade fechada arredondada sob a cápsula tangencial à superfície do rim. Abra cuidadosamente uma pequena bolsa cápsula para os enxertos, utilizando muito cuidado para não danificar o parênquima renal.
- A orla de corte da cápsula renal é levantado com a pinça fina, e o i enxertos inseridas na bolsa, sob a cápsula com o vidro pipeta polida ao fogo. Diversos enxertos podem ser colocados sob a cápsula do rim e uniformemente espaçados na superfície do rim.
- Se, durante o curso de enxertia, a cápsula fica desidratado, ele deve ser humedecido por aplicação de solução salina estéril.
- Quando enxertia está completa, elevar ligeiramente os lados da incisão da parede muscular para substituir o rim de volta para dentro da cavidade do corpo. Observa-se que os enxertos não escorregar para fora de debaixo da cápsula.
- Feche a parede do músculo com uma única sutura (4-0, FS-2 vicryl sutura). O procedimento cirúrgico pode ser repetido no rim contralateral reposicionando o mouse.
- Quando enxerto estiver concluída, o mouse pode sofrer implantação pellet subcutânea durante o mesmo procedimento cirúrgico (Veja Protocolo passo 7).
- Utilizando uma pinça dentada, alinhe as bordas da lesão de pele e aplicar 2-3 clips ferida cirúrgica para fechar a incisão. Administrar analgesia (usamos 5-10 mg / kg carprofen usando uma injeção subcutânea) e coloque o mouse na posição de decúbito lateral na gaiola de recuperação. Assegurar a manutenção da temperatura do corpo com o calor de uma lâmpada ou uma almofada de aquecimento. Observar para a recuperação total do mouse, o que deve ocorrer em menos de 15 minutos.
- Ratos devem ser observados para o próximo 24 horas por sinais de dor pós-operatória, sangramento e / ou outras complicações. Inspecione regularmente incisão cirúrgica para sinais de infecção.
- Remover clips ferida com dispositivo cirúrgico remoção ferida clipe 7-14 dias após a cirurgia.
- Repita os passos de 6,1-6,5 de cápsula renal xeno procedimento cirúrgico.
- Levante a pele para trás com um par de fórceps de pele, e usar a tesoura grosseiros fazer um 1-2 cm dorsal incisão mediana.
- Utilizando uma tesoura sem corte ou uma sonda, separar a derme subjacente a partir da parede do corpo numa direcção craniana.
- Usando fórceps da pele,levantar delicadamente o aspecto cranial da incisão na pele, e segurando a pelota hormônio delicadamente com uma pinça, serrilhadas retas, insira o pellet e solte na nuca, no bolso que você criou com a sonda sem corte.
- Repita os passos de 6,18-6,20 cápsula renal xeno procedimento cirúrgico. Se estiver executando a implantação subcutânea pellet só, use um clipe de ferida cirúrgica para fechar a incisão cirúrgica.
6. Procedimento cirúrgico: Renal Capsule xeno
7. Procedimento cirúrgico: subcutânea Pellet Implantação
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Representative Results
Dependendo da hipótese de ser testado, xeno cápsula renal de tecido ou de células recombinantes pode ser realizada isoladamente ou em combinação com a implantação subcutânea hormona sedimento. Um diagrama esquemático de um experimento hipotético combinando renal experimento cápsula xeno com hormona subcutânea sedimento implante está ilustrada na Figura 1. Uma variedade de substâncias em pó e / ou cristalinos pode ser usado no fabrico de granulados compactados com o pellet press. Figura 2 mostra de 25 mg, 12 mg e 6 mg comprimido peletes hormonais.
A Figura 3 mostra um exemplo de uma pipeta de vidro polido ao fogo usadas durante o procedimento cirúrgico. Várias passagens de uma pipeta de Pasteur de vidro, através do queimador de Bunsen chama resultar em uma ponta polida ao fogo, arredondado que é usada para criar um bolso para enxertos sob a cápsula renal e para manipular os enxertos sob a cápsula renal.
ntent "> Tal como mostrado na Figura 4, xenoenxertos de tecidos primários de pacientes com HBP, suplementadas com testosterona exógena (25 mg de pelotas subcutânea) para simular o meio hormonal humano do sexo masculino, sobreviver e a arquitectura dos tecidos é preservado (Figura 4A). Também são mostrados na Figura 4, o enxerto renal cápsula pode ser utilizada para avaliar a carcinogénese hormonal. recombinantes celulares contendo epitélio benigna da próstata (BPH-1) e o mesênquima urogenital indutivo (UGM) cultivadas em ratinhos não tratados formar tumores benignos (Figura 4B). O mesmo enxerto, cultivadas em um host que recebeu pelotas hormonais subcutâneas de 25 mg e 2,5 mg T E 2 por quatro meses, se desenvolve em carcinoma de próstata que invade a cápsula renal (Figura 4C) 5,14.upload/50574/50574fig1.jpg "/>
Figura 1. Esquema de xeno cápsula renal e procedimento de implantação da pelota. Renal xeno cápsula é realizada através de uma abordagem na linha média dorsal. Durante o mesmo procedimento cirúrgico, o mouse é implantado cirurgicamente com hormônio liberador lento comprimido subcutâneo e / ou pelotas de drogas no pescoço nuca região.
Figura 2. Exemplos de pelotas hormonais comprimido fabricados com o presente protocolo. A. 12 mg pellet. B. 6 mg pellet. C. 25 mg pellet.
Figura 3. Pasteur pipeta de vidro polido-Fire. A pipeta acabado é curvo, com uma ponta arredondada suave adequado para a criação de um pocket para o xenoenxerto sob a cápsula renal. A pipeta é também utilizado para manipular o enxerto sob a cápsula renal.
Figura 4. Exemplo de xenotransplantes cápsula renal. A. xenografts Tecido (setas) de tecido de BPH humano são cultivadas por um mês sob a cápsula renal de um rato nu masculino. O anfitrião do mouse é suplementado com 25 mg de testosterona pellet para simular o ambiente hormonal do macho humano. B. celulares xenografts recombinantes (setas) contendo linhagem humana próstata células epiteliais (BPH-1) e mesênquima urogenital indutivo (UGM) cultivadas sob o renal cápsula de um ratinho nu que não foi implantado com um sedimento hormona subcutânea durante quatro meses. C. xenoenxerto celular recombinante contendo BPH-1 e UGM, cultivadas sob a cápsula renal de um ratinho nu que também foram submetidos a subimplantação da pelete cutânea de 25 mg e 2,5 mg de testosterona 17β-estradiol durante quatro meses.
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Discussion
Este papel e o protocolo delineado aqui descrever o fabrico de hormona comprimido e / ou peletes de droga, e o procedimento cirúrgico para a implantação da pelete de camundongos. Dependendo da questão de pesquisa para ser dirigida, esta técnica pode ser realizada isoladamente ou em combinação com xeno cápsula renal de células de próstata enxertos recombinantes ou xenoenxertos de tecidos da próstata, os quais são amplamente usados em técnicas de pesquisa de próstata 17-19. Tomadas em conjunto, essas técnicas oferecem uma abordagem poderosa para estudar a carcinogênese hormonal e regulação do crescimento benigno da próstata humana e do rato.
Fabricação de pellets é simples de executar, facilmente reproduzível e requer equipamento limitado. Ele pode ser aplicado a várias preparações hormonais e de drogas. Ele é fundamental para realizar esta técnica em uma capa de segurança química, e usar equipamento de protecção individual adequado. Para os experimentos que avaliam próstata carcinogênese umª indução de obstrução da saída da bexiga murino usamos 25 mg T e 2,5 mg E 2 5,7,15. Estas doses são escolhidas porque produzem o desejado em resposta in vivo e porque criam os níveis de hormonas no soro que são fisiologicamente relevante para os machos humanos com o processo da doença de interesse 6. Moldes de pellets permitir vários tamanhos diferentes de pelotas a ser fabricado, nós normalmente usam 25 mg pelotas para avaliar a carcinogênese e do crescimento benigno. A escolha do tamanho de pelete depende da hipótese de ser endereçado, bem como a produção de um efeito desejado, a produção de níveis de circulação desejados e a duração da experiência. Se droga ou hormona é combinado com um agente de ligação (tal como o colesterol) recomenda uma mistura homogénea de hormona e agente de ligação.
Dependendo do estudo, o implante subcutâneo pelete pode ser realizada a seguir a castração do hospedeiro macho 15. Em nossa experiência,implante de 25 mg de T provoca a inibição do feedback do eixo hipotálamo-hipófise-testicular, inibição da secreção endógena. Por isso optamos por comparar os ratos tratados com 25 mg T para simular o ambiente androgênica do macho humano para machos inteiros, mas não tratados, com secreção T endógeno mantida. Nós não costumam utilizar uma série de castração devido à resposta atrófica da próstata e próstata xenografts ao andrógeno retirada.
Este protocolo descreve também a criação de uma peça de equipamento especializado para xeno cápsula renal, a pipeta de Pasteur de vidro polido ao fogo. Isto pode ser facilmente realizado com o equipamento presente na maior parte dos laboratórios, resultando em um instrumento cirúrgico personalizado que pode ser fabricado e esterilizados antes de serem utilizados no procedimento cirúrgico. Usando equipamento de proteção pessoal é importante para garantir a segurança pessoal ao criar o vidro polido pipeta-fogo.
Antes embarking em qualquer um dos procedimentos cirúrgicos descritos neste protocolo, todas as técnicas devem ser analisados e aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional. Os procedimentos cirúrgicos realizados em roedores requer treinamento e prática em ambos os aspectos técnicos do procedimento, bem como os princípios ea prática da técnica asséptica. Para uma introdução aos equipamentos e técnicas importante nestes procedimentos recomendamos pessoal ver o manuscrito vídeo recentemente relatado por Prichett-Corning et al. (2011) 20. Recomenda-se também todos os funcionários recebem treinamento prático em roedores procedimentos cirúrgicos e técnica asséptica.
Em nosso laboratório, esses procedimentos são normalmente realizada com dois membros da equipe. O assistente cirúrgico administra anestesia, observa animais durante a recuperação, auxilia o cirurgião com aspectos não-estéreis do procedimento e documenta todos os procedimentos. O cirurgião mantém o campo estéril, administra analgesia umª executa os procedimentos cirúrgicos descritos neste protocolo. Com planejamento e treinamento adequado, o procedimento cirúrgico de implantação subcutânea hormônio pellet é simples e fácil de executar.
Há várias considerações experimentais de design para celular xeno recombinante. Tal como acontece com todas as experiências utilizando linhas de células imortalizadas, a contaminação é importante para minimizar e detectar. Para experimentos usando BPH-1 linhas de células, recomendamos uma série passagem baixa (menos de 25). Para controlar os efeitos do estroma, que utilizam enxertos contendo apenas BPH-1 de células de um rim e enxertos contendo BPH-1 e UGM sobre o rim contralateral. Para experiências destinadas a atender a carcinogênese hormonal, que normalmente têm uma condição de controle sem tratamento (mouse não é implantado com uma bolinha, ou é implantado com uma bolinha de colesterol). Os controlos positivos (mouse anfitrião é implantado com a T + E 2 pastilhas) são igualmente importantes quando se avalia outras condições that pode promover carcinogênese com este sistema modelo. Dependendo da questão de pesquisa a serem abordados, a duração da implantação da pelota e / ou crescimento de xenotransplante pode variar de algumas semanas a quatro meses; para experimentos planejados para exceder quatro meses, recomendamos a implantação pellet adicional para manter os níveis de hormônios exógenos. Para experimentos envolvendo benignos xenografts tecido da próstata, é importante usar equipamentos de proteção individual adequado e manter as precauções universais para patógenos transmitidos pelo sangue. Tecido recentemente colhidos podem ser armazenados antes de xeno para 12-72 horas.
A técnica cirúrgica para renal xeno cápsula requer planejamento, prática e alguma destreza manual. Minimizando a duração do procedimento cirúrgico, manutenção da temperatura corporal e técnica cirúrgica cuidadosa pode mitigar a mortalidade peri-operatória e complicações cirúrgicas. A chance de morte perioperatória em nossa experiência aumenta com a duração do suprocedimento rgical, por esta razão nós limitamos o procedimento cirúrgico para não mais do que 20-25 min. O uso de uma lâmpada de aquecimento e almofada cera aquecido durante a cirurgia ea recuperação é ideal para manter a temperatura do corpo. Cuidados pós-operatórios de rotina é outro aspecto importante para o sucesso desta técnica. Ratos devem ser observados durante a recuperação da anestesia, e no dia seguinte a cirurgia para sinais de dor e angústia. Administrar analgesia adequada para minimizar a dor pós-procedimento e angústia.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Ricke, passado e presente. Agradecemos Calvin Patten, Jr., DVM e Brigitte Raabe, DVM, pelos comentários úteis sobre o protocolo. Gostaríamos de agradecer o NIDDK, NCI e NIEHS pelo apoio financeiro para estes estudos: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN é um estagiário no Programa de Formação do Cientista Médico da Universidade de Rochester financiado pelo NIH T32 GM07356, o NIH sob Ruth L. Kirschstein Nacional Research Service Award F30DK093173 também apóia este projeto. CDV é suportado por T32CA157322 e ABT é suportado por T32ES007015 na Universidade de Wisconsin-Madison. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais ou NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5" length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band Tag Co. | 1005-1 | |
References
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