Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (DESI-MS) biyolojik dokular dahil olmak üzere örnekler, minimum numune hazırlama ile görüntülenebilir hangi bir ortam yöntemdir. Iyonizasyon probu aşağıdaki örnek rastering tarafından, bu sprey tabanlı teknik doku bölümleri içinde ilgi moleküler özellikleri ayırt etmek yeterli uzaysal çözünürlüğü sağlar.

Abstract

Kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) mikron ölçekli onlarca yüzlerce biyolojik dokular araştırmak için en yüksek özgüllük ve uzaysal çözünürlüğü ile hedefsiz moleküler bilgi sağlar. Ortam koşulları altında yapıldığında, numune ön muamele edilen bilgileri ve yüksek kaliteyi korurken bu nedenle protokol basitleştirilmesi, gereksiz hale gelir. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI) bile, in vivo olarak, açık havada yüzeylerin direkt örnekleme için izin veren bir püskürtme tabanlı bir ortam MSI tekniktir. Bir yazılım kontrollü numune aşamasında birlikte kullanıldığında, örnek DESI iyonizasyon probu altında rastered edilir ve zaman alanı ile, m / z bilgi kimyasal türlerin mekansal dağılımı ile ilişkilidir. Desi MSI çıkış aslına numune yüzeyi ve kütle spektrometresi girişi ile ilgili olarak kaynak yönlendirme ve konumlandırma bağlıdır. Bu yazıda, ben DESI için doku bölümleri hazırlamak için nasıl gözdenmaging ve doğrudan görüntü kalitesini etkileyen ek deneysel koşullar. Özellikle, DESI-MSI tarafından sıçan beyin dokusu bölümden görüntüleme için protokol açıklar.

Introduction

Kütle spektrometresi tarafından hedefsiz görüntüleme keşif ve hipotez üreten uygulamalar için kimyasal bilgi edinimi kolaylaştırır. Öte yandan, bir ilgi, bilinen kimyasal hedeflenen görüntüleme, özel yöntem geliştirilmesi yoluyla artan bir hassasiyet ve seçiciliğin kolaylaştırabilir. Kütle spektrometrisi görüntüleme (MSI) en çok MALDI, 1 sekonder iyon kütle spektrometresi (SIMS), 2 ve desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI), 3 lazerle-elektrosprey iyonizasyon (LAESI), 4 de dahil olmak üzere, ortam iyonizasyon teknikleri kullanarak dokular üzerinde gerçekleştirilir 5 ve MALDI ve SIMS sıvı mikro-kavşak-yüzey ölçüm probu (LMJ-SSP). 6, örnekleri fiziksel olarak numune kaldırılacak var ve yüksek vakum altında analiz olarak, düz ve ince olmak zorunda. MALDI örnek hazırlama için ek ve hantal bir adım ekleyerek, bir radyasyon emici bir matris olan numunenin kaplama gerektirir. SIMSen yüksek yanal çözünürlüğe sahip, ama son derece enerjik parçacıklar ile bombardımanı kapsamlı moleküler parçalanma neden olur. Minimum numune hazırlama ile yumuşak analizi istendiği Bu nedenle, ortam yöntemlerle MSI bir niş doldurun. Ancak, bugüne kadar, tüm yöntemleri hala düz örnek yüzeylerin ihtiyacı ile sınırlıdır.

DESI analit dezorbe ve iyonize için örnek yüzeyinde yönelik bir pnömatik destekli ücret çözücü sprey kullanır. 7 DESI tarafından desorpsiyon ve sonraki iyonlaşma için çalışma modeli "pick-up modeli damlacık" olarak bilinir. 8-10 ücret birincil damlacıkları desi prob tarafından üretilen ıslatma ve analit, bir katı-sıvı mikroekstraksiyonu mekanizması ile yüzeyden çıkarılan malzeme içeren ikincil damlacıklarının momentum transferi ve kalkış 8 sonraki damlacık çarpışma sonucu çözünmüş olduğu ince bir film oluşturucu, yüzey ile çarpışır . 9,10 Sonuçta, gazfaz iyonları ancak DESI en hassas iyon oluşum sürecini deneysel kanıtlanmış olması henüz iyon buharlaşma, ücret kalıntı modelleri ya da diğer modelleri, 11 sonrasında ESI benzeri süreçlerle üretilen olduğuna inanılmaktadır. 12 DESI duyarlılık çözünürlüğüne bağlı güçlü bağlıdır Sprey çözücü içinde, analit, desorpsiyon olarak lokalize microextractiondur dayanır. 13

Bir yazılım kontrollü numune aşamasında birlikte kullanıldığında, örnek şeritli DESI iyonizasyon probu altında adım ile tek yönlü taranır, ve zaman tanım ile, m / z bilgi kimyasal türlerin mekansal dağılımı (Şekil 1) ile ilişkilidir. 2006 yılında Van Berkel ve Kertesz tarafından bildirilen ilke DESI-MSI deney ilk kanıtı bu yana, 14 teknik lipid analizi, 3,16 ilaç metabolitleri, 17,18 disea rapor uygulamaları ile, önemli ölçüde 15 olgunlaştıse biyolojik, 19 beyin dokusu, 3,18,20 akciğer dokusu, 18 böbrek doku, 18 testis dokusu, 18 böbreküstü bezleri, 17 ince tabaka kromatografisi plakalar, 21 ve yosun yüzeyler. DESI-MSI ile elde edilen görüntülerin 22 rutin çözünürlük sonuçta sprey tarafından çıkarılan etkin yüzey alanı tarafından belirlenir, ancak 40 mikron gibi düşük çözünürlüklerde bildirilmiştir 100-200 mikron,. 23-25 ​​Bu kararname ve analiz kolaylığı hızlı ve basit bir analiz için uygun DESI-MSI yapar değerli mekansal bilgi edinimi daha iyi biyolojik süreçleri 26 anlamanıza olanak 0.5-5 cm 2 aralığında yüzey alanları ile biyolojik doku örneklerinin. Burada, tipik bir DESI-MSI uygulama örneği olarak, biz sıçan beyin dokularında lipid görüntüleme içeren başarılı bir deney yapma usul ayrıntıları gözden geçirin. Protokolde iki en kritik adımlar vardırAşağıda tarif edildiği gibi doku hazırlanması 27 ve desi iyonu kaynağı optimizasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kesit Doku

  1. Mağaza kesit için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda flaş dondurulmuş, bütün doku.
  2. Doku örneği (30 dakika) kesit önce cryomicrotome içinde sıcaklığına getirin. -30 ° C'ye bıçak ve örnek sıcaklığı ayarlayın
  3. Bir kez doku, cımbız ile numune işleme, sıcaklığa ulaşıldığında ne beynin bir kısmında (yani beynin ön birincil öneme sahip ise, beynin arka monte yeterli montaj yüzey ilgilendiren bağlı olarak beynin ön ya da arka azalttı Chuck üzerinde).
    1. Sertleşene kadar merkezinde ayna için ~ 0.5 ml Optimal Kesme Sıcaklık Bileşik (OCT, Doku-Tek, Sakura) uygulayın ve, cımbız kullanarak, OCT yerinde örnek tutun. Bir kez Ekim tamamen numune tutucuya monte ayna, dondurulur.
    2. Örnek monte etmek için kullanılan bir OCT az miktarda (OKT bir blok olarak numune montaj aksine olarak yaygın diğer histolojik yapılır tercih edilirnumunenin kontaminasyonu en aza indirmek için mantıksal işlemleri). OCT ile örnek kirlenmesi DESI ve iyon bastırma nedeniyle görüntüleme işlemi için zararlıdır.
  4. Kalınlığında 12-18 mikron MS görüntüleme aralığı için gerekli tipik doku bölümleri. Önerilen aralık dahilinde istenilen kalınlıkta Bölüm doku. Hafifçe bölümünde bir oda sıcaklık mikroskop cam slayt dokunarak her kesitli doku çözülme monte. Örnek monte edildikten sonra bu kimyasal dağılımları ve kompozisyonlar değişecek gibi, doku bölümünde dokunmamaya dikkatli olun.

Not: Biz bir optimizasyon için bölüm ve görüntüleme için başka kullanarak, slayt başına iki bölümden montaj tavsiye ederiz. Bölümleri bir slayt kutusunda ° C derin dondurucuda -80 kadar acil görüntüleme, mağaza slaytlar için analiz için hazır değildir. Ise

  1. Saklanan bölümleri analiz ise, dondurucu slayt kaldırmak, hemen vakum desikatörde transfer ve izin ~ 15-20çözülme min. Uzun desikatörde numune bırakmak örnek kuru ve DESI etkinliğini azaltacaktır. O zaman çıkarına, ancak çözülmüş sonra DESI iyon kaynağının optimizasyonu doku örneği ile yapılacaktır, örnek çözme edildiği sırasında dönemin ekipman başlatma için ideal bir zaman olarak hizmet vermektedir.
    1. Çözücü desi olarak% 1 asetik asit ile asetonitril kullanarak, 5 ul / dakika 'lık bir akış oranı ile bir şırınga pompası açın. Daha düşük akış hızı DESI sprey ve etkin piksel boyutu etkisini nokta yan azaltır, ancak daha yüksek bir akış hızı yeterli duyarlılığı için gerekli olabilir. Bu nedenle akış oranı (tipik olarak 1-5 ul / dak) her bir uygulama ve istenen duyarlılık ve çözünürlüğü için optimize edilmelidir. Şırınga verilen akış hızında tam optimizasyon ve görüntüleme için yeterli solvent içerdiğinden emin olun.
    2. Çözücü kaynak ucu dışarı damlayan göründüğünde, Gerilim ile azot nebulizing gazı açın160 psi örn.
    3. 3.600 uygulayarak iyon kaynağına bağlı yüksek gerilim güç kaynağı açın V.
  2. Hareket sahnede slayt monte ve iyon kaynağı ve MS optimizasyonu başlar

2. DESI Optimizasyon

  1. Desi sistem kaynağı prob (bkz. Şekil 2), bir şırınga pompası ve bir çözücü ya da alternatif dağıtım sistemi, sıkıştırılmış azot, çeviri örnek sahne ve bağlama oluşur. Kütle spektrometresi uygun kütle aralığı ve ilgi analitler için ayarlanmış bir kez DESI kaynak optimizasyonu ile devam edin.
    1. Kaynak bileşenleri henüz açık değil varsa, yön bölümleri 1.5.1-3 bakın.
    2. Bu bölümlerde ele değişkenler biyolojik dokuların görüntüleme için tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu değişkenler doku veya örneğin farklı tipleri için optimize edilmelidir. Alternatif çözücüler, akış hızı, nebulizing gaz basınçları ve gerilimleri Hü için bildirilmiştirBiyolojik dokuların ng. 16-18
  2. Başlangıçta DESI kaynak cam slayt dokunmadan değil, ve doku bölümün herhangi bir parçası yönelik olmadığından emin olun. Bu prob ilk optimizasyon sürecinde zarar görmemesi ve doku örneği ile temas tarafından ayarlanan herhangi bir kısmını kirletmeyin sağlayacaktır.
    1. İyi bir başlangıç ​​pozisyonu 55 arasında bir açıda, prob ile ucu örnek yüzeyden 3 mm ve MS kılcal giriş ila 5 mm arasında, ° numune yüzeyi ile ilgili ile. DESI prob iç kılcal dış kılcal ötesinde ~ 1 mm uzanmalıdır. Bütün bu parametreler optimize edilecektir.
  3. Kılcal MS arayüzü iyonların uygun transferini numune yüzeyi ile ilgili olarak ~ 15 ° 'lik bir toplama açıda olmalıdır. Kılcal mümkün olduğunca yakın, yüzeyden <1 mm olmalıdır; numune yüzeyi üzerinde MS kılcal gezinen böylece sahne yüksekliğini ayarlayındokunmadan.
  4. Doğrudan doğrultusunda böylece MS kılcal giriş ile ilgili olarak x boyutta DESI prob aynı hizaya getirin.
  5. Ekstra doku bölümünü kullanarak optimum hassasiyet için DESI kaynağının y ve z konumları ayarlayın. DESI prob bir örnek alan yönelik olarak, sonunda dezorbe ve bu ortaya çıkar gibi o bölgede ve sinyal analitlerin tüm giderek azalacak iyonize unutmayın. Bu adım olarak kısa sürede yapılması önemlidir.
    1. Bu nedenle, optimizasyon işlemi boyunca, örneğin taze numune sinyalindeki değişiklikler kaynak optimizasyonu değil, örnek tükenmesi nedeniyle olduğu analiz edilirken sağlamak için sprey kafası altında hareket ettirilmesi gereklidir. Ancak, doku farklı bölgelerin çeşitli kimyasal bileşimi, tüm doku kesiti iyon yoğunluğu doğrudan bir karşılaştırma tamamen doğru olmadığını düşünüyor. Beynin talamus ile oldukça büyük boyutlu alanı sağlardaha tutarlı kimyasal bileşimi, ama yine de mükemmel bir üniforma değil. Alternatif olarak, boya rodamin içeren kırmızı Sharpie, işaretleme 6G ([M] +, m / z 443), uzak örnek bir cam slayt DESI ile güçlü MS yanıtı sağlar ve aynı zamanda optimizasyonu için kullanılabilir, ancak Farklı örnek form ve analit verilen, bu koşullar hala biyolojik dokular için set-up ideal için ilişkili olmayabilir.
    2. Kaynak ucu ve kılcal girişi arasındaki Önerilen y ayırma: ~ 4 mm, uç ve örnek yüzeyi arasındaki tavsiye z ayırma: ~ 1.5 mm. Bu parametrelerin her deneysel set-up için biraz daha farklı olacak olsa.
    3. Probun geometrisi ve açısı göz önüne alındığında, y ve z-boyut pozisyonları solvent ve analit içeren damlacıkların etkin iletim göre birbiriyle ilişkili olduğunu göz önünde. Tek değişkenli bir değişiklik aynı çarpma etkisi konumunu korumak ve diğer bir sonraki değişiklik gerektirecektirkendi iletim açılar.
  6. Mesafe maksimum hassasiyet ve minimal etkisi spot büyüklüğü için kaynak dış kılcal gelen iç kılcal extrudes ayarlayın. Dikkat: Bu ayarı yaparken yüksek gerilim KAPALI olduğundan emin olun.
  7. Maksimum sinyal gözlenir, kaynak geometri uygun kabul edilecektir.
    1. Bölümlerde 2.5-2.6 optimize değişkenleri birbiri ile ilişkilidir, bu nedenle birinin ayarlama doğal olarak diğerinin yeniden ayar bölümde ele gerekli kaynak-örnek-giriş geometrisi, ya da koşulların ayarlama 1.5.1 korumak için gerektirir 3.
  8. Ayrıca, kütle spektrometresi ile kılcal transfer çevreleyen bir ısıtma elemanı iyonizasyon işlemi sırasında üretilen şarj analit damlacıkları desolvation kolaylaştırarak duyarlılığını artırmak olabilir. Burada bir ip ısıtıcı kullanmak transferi etrafında sarılmış 100 ° C ayarlı kılcal

3. TissuE Görüntüleme

  1. Görüntüleme işlemi sırasında, örnek aşamasında kılcal desi prob ve MS girişi altındaki numune hareket eder ve diğer tüm bileşenler sabit kalır. Sahnenin hareket parametreleri DESI etkisi tüy boyutu ve optimal duyarlılık dayalı seçilmelidir.
    1. Daha büyük bir etki tüy ancak görüntüleme için, aynı zamanda daha büyük bir piksel boyutu ve böylece kötü bir görüntü çözünürlüğü neden olur, daha fazla örnek desorbe olan göz önüne alındığında, daha yüksek bir iyon yoğunluğu ile sonuçlanacaktır.
  2. Bu deneyde kullanılan çeviri aşamasında olan ev inşa edilmiş ve verilen boyutları bir görüntü için hız ve satır aralığı rastering kontrolü için izin veren bir LabView programı tarafından kontrol. Bu deneyde kullanılan sahne hareket kontrolü VI omnispect.bme.gatech.edu mevcuttur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen DESI kaynağı ve aşama, Prosolia Inc 2B otomatik Omni Sprey kaynağı (Indianapolis, ABD) olarak kullanılabilir.
    1. Beyin dokuları için birTipik bir görüntü boyutu 10 x 15 mm ve kullanılan sahne hareketi parametreleri göz önüne alındığında, görüntü yaklaşık 3 saat sürer.
      1. Program LabView VI veya istenen görüntüleme koşulları için eşdeğer kontrol yazılımı, bir sahne tarama 80 mikron hızı / sn ve 200 mikron sıraları arasında satır aralığı kullanarak. Omni Sprey kaynak kullanırken, hareket parametreleri 100-200 mm / sn tarama hızı ve 200 mikron bir satır aralığı için ayarlanmalıdır. Bu hareketi parametreleri her boyut ve gerekli hassasiyeti istenen piksel sayısına bağlı olarak değiştirilebilir unutmayın.
        1. Daha küçük bir satır aralığı tarama hızı etkisi daha az olan ile, görüntü kalitesini artırmak için gösterilmiştir. 25 Ancak, bu mutlaka işaret ve gelişmiş görüntü çözünürlüğü değildir dikkat etmek önemlidir bu kadar etkisi noktada güçlü bağlıdır boyutu. Daha yavaş bir tarama hızı ve daha küçük satır aralığı önemli ölçüde analiz süresi artacak ve bu nedenle optimizasyon olmalıdırdoku ya da örneğin her türü için zed.
      2. Satır aralığı y boyutta piksel boyutunu belirler ise MS spektral satın alma 1 set ile tarama / sn ve 1 piksel / tarama olarak oluşturulan görüntü, sahne hızı, x boyutta piksel boyutunu tanımlar. Resmin gerçek bir piksel boyutuna yayılan püskürtülmesi nedeniyle daha büyük olmasına rağmen, daha yavaş hareket desorpsiyon ve analitlerin saptanması için daha fazla zaman sağlar.
    2. Dizin yolunu ve LabView VI içindeki görüntüleri sırasında kaydedilecek konum ve zaman dosyalar için dosya adı verin.
  3. Kütle spektral veri toplama için hazırlık, görüntüleme için gereken toplam zamanı hesaplamak. Grubumuz tarafından kullanılan Labview programı otomatik olarak bu değer sağlar, ama alternatif katı kontrolü kullanılırsa, bu hesaplama MS veri toplama ayarları için gereklidir.
    1. Bir Omni Sprey otomatik kaynak ve sahne kullanırken, resmin her satırı olarak elde edilirMünferit çalışır. Zaman-başına-line ve verilen görüntüleme boyutları için gerekli satır sayısı kütle spektrometresi yazılımı içine girilmesi için Omni Sprey kontrol yazılımı kullanılarak hesaplanmıştır.
  4. Kütle spektrometresi tarama hızı 1 spektrumu / sn olduğundan emin olun, ve hesaplanan toplam süre maç için araç satın alma saati ayarlayın.
    1. Spektral tarama hızı 1 spektrum / sn olarak ayarlayın.
    2. PROFİLİ modunda veri kazanmak ve m / z aralığı ilgi türler için uygun olduğundan emin olun. Bu DESI da ESI olduğu gibi, çarpma ücret analitleri üretir unutmayın.
    3. LabView tarafından verilen toplam resim zaman maç için satın alma saati ayarlayın.
  5. Görüntülü alanın üst sol çarpma etkisi nokta yerleştirin.
  6. Aynı anda MS veri ve sahne hareket satın başlayın.
  7. Veri toplama sonucu üzerine STANDBY moduna kütle spektrometresi dönmek.
  8. DESI kaynağının yüksek gerilim kapatın.
  9. O çevirinff azot gazı.
  10. Şırınga pompası kapatın.

4. Görüntü İşleme

  1. Toplu spektral veri, evre süresi ve LabView ile metin dosyaları olarak kaydedilir konum verileri ile birlikte gelen spektrumları ile piksel koordinatları ilişkilendirerek bir 2D görüntü içine "katlanmış" olmalıdır. Omnispect.bme.gatech.edu: Burada sunulan görüntüleri serbestçe kullanılabilir Matlab tabanlı yazılım kullanılarak işlendi. Veri Omni Sprey kaynak kullanılarak elde edilir ise, Firefly veri dönüştürme yazılımı BioMAP (www.maldi-msi.org) görüntü görselleştirme için veri küp oluşturmak için kullanılır.
  2. Jeol AccuTOF kütle spektrometresi ile elde edilen veriler için, kaydedilen kromatogram daha fazla analiz için. ED formatında ihraç edilmelidir.
    1. MassCenter içinde Data Manager kullanarak, ilk centroided veri (Araçlar → Geometrik için Toplama Veri dönüştürme) için elde verileri dönüştürmek. Daha sonra klavye kombinasyonu Ctrl + Shift + E fol kullanarak. ED biçimde veri ihracatAraçlar → İhracat ile onun ardından.
  3. OmniSpect web sitesine ham. ED kütle spektral veri ve iki metin dosyaları, konum ve zaman, yükleyin. Firefly işlenmiş görüntüleme verileri BioMAP olarak görüntülenebilir.
    1. Sigara Negatif Matrix çarpanlara tarafından istatistiksel analiz de dahil olmak üzere ya da ilgi tek bir iyon komplo verilerin işlenmesi doğrudan web sitesinde yapılabilir.
    2. Alternatif olarak, ham veri küp Matlab analiz için ihraç edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 3, tedavi edilmemiş bir sıçan beyin bölümünden elde edilen temsili bir spektrumunu göstermektedir. Olumlu modunda, kütle spektrumu yüksek iyonizasyon verimliliği (pozitif yüklü dörtlü amonyum gruba atfedilen) nedeniyle fosfatidilkolinler hakimdir. Doku kesiti toplam iyon görüntü aynı zamanda tüm beyin kesiti boyunca bol sinyali gösteren, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Tespit Anahtar lipidler edebiyat karşılaştırmalar ile Tablo 1'de açıklanmıştır.

Örneğin lipidlerin mekansal dağılımı (Şekil 4) farklı Phosphatidylcholin türlerin göreceli bolluk gri ve beynin beyaz cevher arasında nasıl değişeceğini gösterir. [PC 36:1 + K] +, m / z 826,5558, artan yoğunluk gösterir ise Örneğin, [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, serebellar korteks (gri madde) artış yoğunluğu gösterir serebellar sapı (WHIte madde). İki iyon (Şekil 4c) için elde edilen bileşik görüntü doku kesiti yağ dağılımı içinde kontrast vurgular. Beyindeki diğer önemli lipidlerin mekansal dağılımları da Tablo 1 'de listelenmiştir. Bu dağılımlar önceki çalışmalarda katılıyorum. 28-30

Şekil 1
Şekil 1. Desi MSI görüntüleme işlemi. DESI (a) şematik dokuların yüzey analizi için kullanılır ve numune (b) kaynak altında kontrollü bir hareket rastered olduğunda, kütle spektrum verileri, yoğunluğu vs m / z (C ), zamanın bir fonksiyonu olarak, (d) elde edilir. Bu veriler daha sonra kimyasal bir görüntü oluşturmak için hareket parametreleri ile zaman alanı ile ilişkilidir(E). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. DESI kaynak şematik.

Şekil 3,
Şekil 3,. Daha bol m / z değerleri ile ortalama tüm doku spektrum etiketli (a) ve toplam iyon görüntüsünde (b) pozitif iyon modunda DESI-MSI tarafından satın.

Şekil 4, Şekil 4. Pozitif iyon modunda DESI-MSI tarafından satın sıçan beyin dokusunda önemli phosphocholines iyon görüntüleri Seçilen (a) [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, (b) [PC 36:1 + K] + , m / z 826.5558; m / z 798, mavi ve 826, kırmızı (c) kompozit görüntü.

Tür m / z Yerelleştirme (madde)
[PC 32:0 + Na] + 756.5335 Gri
[PC 32:0 + K] + 772.5165 Gri
[PC 36:4 + H] + 782.5477 Beyaz
[PC 34:1 + K] + 798.5364 Gri
[PC 38:4 + H] + Beyaz
[PC 36:1 + K] + 826.5558 Beyaz

Tablo 1. Beynin bölümünde Anahtar lipid kimlikleri ve yerelleştirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DESI kaynak geometri optimizasyonu başarılı MSI deneyler için önemlidir. Sistemin uyum katkıda birden çok değişken doğrudan hassasiyet ve görüntü çözünürlüğü etkiler. Optimizasyon sırasında, deneyci sinyal elde zorluklar varsa, bir kriter olarak slayt çizilmiş kırmızı Sharpie nokta kullanmanızı öneririz, boya, rodamin 6G, m / z 443, pozitif iyon modunda güçlü bir sinyal üretir ve kullanılabilir ilk optimizasyon. Analit iletim ve iyonizasyon oluşan ince bir film haline yüzeyinden analitin ekstraksiyon bağlıdır Buna ek olarak, desi çözücü seçimi, hassasiyet için çok önemlidir. 13 çok elektrosprey iyonizasyon ile uyumlu çözücüler ve bunların karışımlarını desolvation yardımcı olmak için kullanılabilir ve iyonizasyon işlemi analizi sırasında ilgi bileşik sınıfına bağlı.

Daha önce belirtildiği gibi, DESI-MS görüntü depe kararıöncelikle kaynak geometrisine nds. Bu lazer tabanlı ve / veya ~ 10-150 mikron. 5,31 Çözünürlük gibi yüksek 40 mikron arasında olabilir vakumda görüntüleme yöntemleri daha yüksek olmasına rağmen 200 mikron sırasına görüntü çözünürlüğü düzenli, DESI-MSI ile elde edilir dESI 24, rutin görüntülenmesi için 200 mikron büyük biyolojik doku bölümleri analizi için yeterli olan kullanılarak bildirilmiştir. DESI kaynağının kılcal iç erimiş silis kalitesi de görüntü kalitesi ve çözünürlüğü etkileyecektir. Büyük id kılcal büyük spreyler ve daha büyük görüntü çözünürlüğü üretmek gibi kılcal tavsiye edilen iç çapı, 50 mm. Bu kılcal kare kesilmiş değil veya kırık ise 25, püskürtme düzensiz şekilli etkisi noktada sonuçlanan konik olması, kötü-olmaz kalite ve üretilemez görüntüler.

Sadece kaynak geometri DESI-MSI kararı etkiler, aynı zamanda hassasiyet önemli bir rol oynarYöntemin. Bu nedenle geometri optimize edilmiş ve işlem boyunca sabit tutulmalıdır. Örnek düzlemsel değil, ya da yatay olarak mükemmel monte değilse, kaynak geometri böylece yanıt değiştirme ve resim içindeki bir eser yaratmak, değişecektir. 23 DESI-MSI düzlemsel örnekleri ile sınırlı olmasına rağmen, biyolojik dokuların 3 boyutlu görüntüleme yapılır daha sonra, üç boyutlu bir görüntü halinde yığılmış Seri doku bölümlerinin 2B ile mümkündür. 32 Bu yaklaşım, aynı zamanda, Sims, MALDI, LAESI vb 33 üç boyutlu kütle spektrometresi görüntüleri de olabilir dahil olmak üzere diğer yöntemler MSI, için uygulanabilir yavaş yavaş, örneğin lazer darbeleri ile malzeme tabakası kaldırılması, ve Yeniden görüntüleme başlıyor tarafından oluşturulur. 34

Sıçan beyin dokuları olumlu modu analizi fosfatidilkolinler ve bazı ilaçlar ve metabolitleri başarılı görüntüleme kolaylaştırır. 18. Bu analizi tamamlamak için, negativ görüntülemeE modu lipidler, 28,35 sınıfları daha büyük bir çeşitliliğe sahip bir spektrumu ve doku bölümleri bir kapsamlı analiz sağlamak için de kullanılabilir. Birden fazla lipit tür belirli bir m / z değeri ile bağlanabilir durumda, tandem kütle spektrometrisi tanımlanması için de kullanılabilir. Tandem kütle spektrometresi de lipid kimlik doğrulama ek bir yöntem olarak hizmet vermektedir. 35

DESI ile ortam kütle spektrometresi görüntüleme sıçan beyin dokusunda lipid türlerin görüntüleme etkili olduğu gösterilmiştir. MSI deneyler yoluyla elde edilen bilgilerin diğerleri arasında sendromu ve diyabet Aşağı, Alzheimer hastalığı gibi fosfolipid değişen düzeylerde, ile ilişkili hastalıklar ışık tutabilir. 36-38 lipid ve biyolojik süreçlerin rolleri yüksek bolluğu göz önüne alındığında, birçok biyolojik sistemler var Bu kütle spektrometresi görüntüleme yoluyla elde edilen bilgilerden yararlanacak. Birçok potansiyel yöntemlerleÖzellikle kütle spektrometresi, ortam iyonizasyon yöntemleri, DESI kullanarak görüntü biyolojik örnekler için, azaltılmış numune hazırlama ile bunu yapmak için bir yol sağlar ve analiz kolaylığı arttı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma ARRA NSF MRI Aracı Geliştirme hibe # 0923179 FMF için tarafından desteklenmektedir. Biz doku kesit ile yardım için Aqua Asberry, Biyomühendislik için Parker H. Petit Enstitüsü ve Biosciences Histoloji Core Lab Koordinatörü, teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
  3. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).
  4. Nemes, P., Laser Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).
  6. Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -N. T. Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).
  7. Takáts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science. 306, 471-473 (2004).
  8. Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).
  9. Costa, A. B., Cooks, R. G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).
  10. Costa, A. B., Graham Cooks, R. Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).
  11. Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization. Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).
  12. Kebarle, P., Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).
  13. Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 135, 731-737 (2010).
  14. Van Berkel, G. J., Kertesz, V. Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).
  15. Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview. Analyst. 135, 669-681 (2010).
  16. Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).
  17. Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 135, 28-32 (2010).
  18. Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).
  19. Eberlin, L. S., et al. Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry. Cancer Res. 72, 645-654 (2012).
  20. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).
  21. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).
  22. Lane, A. L., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).
  23. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).
  24. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).
  25. Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).
  26. Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).
  27. Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).
  28. Jackson, S. N., Wang, H. -Y. J., Woods, A. S. Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS. Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).
  29. Jackson, S. N., et al. MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue. J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).
  30. Wang, H. -Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections. Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).
  31. Wu, B., Becker, J. S. Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range. Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).
  32. Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).
  33. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier. Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).
  34. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  35. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).
  36. Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).
  37. Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain. Brain Res. 867, 9-18 (2000).
  38. Han, X., et al. Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study. Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).

Tags

Biyomühendislik Sayı 77 Moleküler Biyoloji Biyomedikal Mühendisliği Kimya Biyokimya Biyofizik Fizik Hücresel Biyoloji Moleküler Görüntüleme kütle spektrometresi MS MSI Desorption elektrosprey iyonizasyon DESI Ambient kütle spektrometresi doku kesit biyolojik görüntüleme

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter