Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التصوير من الأنسجة البيولوجية بواسطة الامتزاز Electrospray التأين الطيف الكتلي

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

الامتزاز قداس الطيف Electrospray التأين (DESI-MS) هو أسلوب المحيطة التي العينات، بما في ذلك الأنسجة البيولوجية، ولا يمكن تصوير مع إعداد العينات الحد الأدنى. من قبل إن تحريك عينة أدناه لجنة التحقيق التأين، ويوفر هذا الأسلوب القائم على رذاذ القرار المكانية كافية لتبين ملامح الجزيئية المصالح داخل أقسام الأنسجة.

Abstract

قياس الطيف الكتلي التصوير (MSI) يوفر معلومات الجزيئية تشتته مع أعلى خصوصية والتحليل المكاني للتحقيق في الأنسجة البيولوجية في مئات إلى عشرات من نطاق ميكرون. عندما يؤديها في ظل الظروف المحيطة، يصبح عينة العلاج قبل لا لزوم لها، وبالتالي تبسيط البروتوكول مع الحفاظ على الجودة العالية للمعلومات التي تم الحصول عليها. الامتزاز electrospray التأين (ديزي) هو ومقرها رذاذ المحيطة MSI تقنية تسمح لأخذ العينات مباشرة من السطوح في الهواء الطلق، وحتى في الجسم الحي. عند استخدامها مع عينة المرحلة التي تسيطر عليها البرنامج، وrastered العينة تحت التحقيق التأين ديسي، ومن خلال المجال الزمني، يرتبط ارتباطا م / ض المعلومات مع التوزيع المكاني للأنواع الكيميائية ". الاخلاص من الناتج DESI-MSI يعتمد على التوجه مصدر وتحديد المواقع فيما يتعلق سطح العينة وكتلة مدخل مطياف. هنا، نستعرض كيفية تحضير المقاطع النسيجية للديسي أناmaging والظروف التجريبية الإضافية التي تؤثر بشكل مباشر على جودة الصورة. على وجه التحديد، ونحن تصف البروتوكول لتصوير المقاطع أنسجة المخ الفئران بواسطة DESI-MSI.

Introduction

التصوير غير مستهدفة من قبل قياس الطيف الكتلي يسهل الحصول على المعلومات الكيميائية لاكتشاف وتوليد فرضية التطبيقات. يمكن التصوير المستهدفة من مادة كيميائية معروفة من الفائدة، من ناحية أخرى، وتيسير زيادة الحساسية والانتقائية من خلال تطوير أسلوب معين. قياس الطيف الكتلي التصوير (MSI) يتم تنفيذ الأكثر شيوعا في الأنسجة باستخدام MALDI، 1 الثانوية ايون الطيف الكتلي (سيمز)، (2) وتقنيات التأين المحيطة، بما في ذلك المج electrospray التأين (ديزي)، 3 الليزر التذرية-التأين electrospray (LAESI)، 4، 5 وسائل أخذ العينات الصغيرة تقاطع سطح مسبار (LMJ-SSP). 6 في MALDI وSIMS، وعينات لا بد من إزالتها فعليا من العينة، ويجب أن تكون مسطحة ورقيقة، كما يتم تحليل أنهم تحت فراغ عالية. يتطلب MALDI طلاء من العينة مع الإشعاع استيعاب مصفوفة، مضيفا خطوة إضافية ومرهقة لإعداد العينة. SIMSلديها أعلى قرار الوحشي، ولكن القصف مع جزيئات نشطة للغاية يسبب تجزئة الجزيئية واسعة النطاق. ولذلك، MSI بالطرق المحيطة ملء مكانة حيث تحليل لينة مع إعداد العينات الحد الأدنى هو مرغوب فيه. ومع ذلك، حتى الآن، كل الأساليب لا تزال محدودة بسبب اشتراط السطوح عينة مسطحة.

يستخدم DESI على هوائيا بمساعدة اتهم رذاذ المذيبات التي تستهدف سطح العينة لتمج وتأيين التحاليل. 7 ومن المعروف أن نموذج العمل لالامتزاز التأين واللاحقة من قبل ديسي باسم "نموذج البيك اب الحبرية". 8-10 قطرات الأولية المشحونة التي تنتجها التحقيق DESI تتصادم مع السطح، وترطيب ذلك، وتشكيل طبقة رقيقة الذي يتم حل الحليلة من خلال آلية microextraction الصلبة والسائلة 8 اللاحقة قطيرة التصادمات نتيجة في نقل الزخم واقلاعها من قطرات الثانوية التي تحتوي على مواد المستخرجة من السطح . 9،10 في نهاية المطاف، الغازويعتقد أن الأيونات المرحلة إلى أن يتم إنتاجها من خلال عمليات مثل ESI بعد تبخر أيون، ونماذج بقايا تهمة أو نماذج أخرى، 11 إلا أن عملية تشكيل أيون دقيقة في DESI لديه بعد أن ثبت بالتجربة. 12 حساسية DESI تعتمد بقوة على ذوبان الحليلة في رذاذ المذيب، والامتزاز تعتمد على microextraction المترجمة. 13

عند استخدامها مع عينة المرحلة التي تسيطر عليها البرنامج، يتم فحص عينة unidirectionally مع لين يخطو تحت التحقيق التأين ديسي، ومن خلال المجال الزمني، يرتبط ارتباطا م / ض المعلومات مع توزيع الأنواع الكيميائية 'المكانية (الشكل 1). منذ أول دليل من مبدأ DESI-MSI التجربة ذكرت من قبل فان بركل وكيرتز في عام 2006، وقد نضجت 14 تقنية إلى حد كبير، مع 15 التطبيقات ذكرت في تحليل الدهون، 3،16 الأيض المخدرات، 17،18 diseaالمؤشرات الحيوية SE، 19 أنسجة المخ، 3،18،20 أنسجة الرئة، 18 نسيج الكلى، 18 الأنسجة الخصية، 18 الغدد الكظرية، 17 لوحات رقيقة اللوني طبقة و 21 و السطوح الطحالب. 22 القرار الروتيني لصور حصلت عليها DESI-MSI هو 100-200 ميكرون، والتي يتم تحديدها في نهاية المطاف من قبل مساحة السطح الفعالة المستخرجة بواسطة رذاذ، ولكن تم الإبلاغ عن قرارات منخفضة تصل إلى 40 ميكرون. 23-25 ​​هذا القرار وسهولة تحليل يجعل DESI-MSI المناسبة لتحليل سريع وبسيط من عينات الأنسجة البيولوجية مع المساحات السطحية في نطاق 0،5-5 سم 2، وتمكن من الحصول على المعلومات المكانية قيمة لفهم أفضل للعمليات البيولوجية 26. هنا، كمثال على تطبيق DESI-MSI نموذجي، نستعرض التفاصيل الإجرائية لإجراء تجربة ناجحة تشمل التصوير الدهون في أنسجة الدماغ الفئران. الخطوات الأكثر أهمية اثنين في البروتوكول هيالأنسجة إعداد 27 وDESI مصدر الأمثل أيون، كما هو موضح أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الأنسجة باجتزاء

  1. متجر فلاش مجمدة، النسيج كله في الفريزر -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للباجتزاء.
  2. السماح للعينة الأنسجة للوصول إلى درجة الحرارة في cryomicrotome قبل باجتزاء (30 دقيقة). تعيين شفرة ودرجة حرارة العينة إلى -30 ° C.
  3. مرة واحدة وصلت درجة حرارة الأنسجة، والتعامل مع العينات مع ملاقط، وقطع الأمامي أو الخلفي من الدماغ اعتمادا على أي جزء من الدماغ هو من مصلحة لسطح كافية تركيب (أي إذا كان الجزء الأمامي من الدماغ هو من أهمية قصوى، جبل الخلفي من الدماغ على تشاك).
    1. تطبيق ~ 0.5 مل الأمثل القطع مجمع درجة الحرارة (أكتوبر، الأنسجة تيك، ساكورا) لتشاك في مركز و، باستخدام الملقط، عقد العينة في مكان في شهر أكتوبر حتى يتصلب. مرة واحدة يتم تجميد أكتوبر تماما، جبل تشوك في صاحب العينة.
    2. ويفضل الحد الأدنى من أكتوبر تستخدم لتركيب العينة (على النقيض من تصاعد العينة في كتلة من أكتوبر كما هو الحال عادة في histo أخرىإجراءات منطقية) للحد من تلوث العينة. تلوث العينة من أول أكتوبر تشرين يضر DESI وعملية التصوير بسبب قمع أيون.
  4. أقسام الأنسجة نموذجية اللازمة لMS نطاق التصوير 12-18 ميكرومتر في السمك. قسم الأنسجة في سمك المطلوب ضمن النطاق الموصى به. ذوبان الجليد-تحميل كل الأنسجة مقطوع عن طريق لمس طفيفة درجة حرارة الغرفة المجهر شريحة زجاجية أكثر من قسم. مرة واحدة هي التي شنت عينة، توخي الحذر كي لا تلمس قسم الأنسجة كما أنه سيتم تغيير توزيعات الكيميائية والتراكيب.

ملاحظة: نوصي تصاعد قسمين لكل شريحة، وذلك باستخدام مقطع واحد لتعظيم الاستفادة، والآخر للتصوير. إذا المقاطع ليست للتصوير الفوري، والشرائح مخزن في الفريزر -80 درجة مئوية في مربع الشريحة لتصبح جاهزة للتحليل.

  1. إذا تحليل المقاطع المخزنة، وإزالة الشريحة من الثلاجة، ونقل على الفور لمجفف فراغ، والسماح ~ 15-20دقيقة إلى ذوبان الجليد. وسوف يغادر العينة في المجفف يعد تجفيف عينة وتقليل كفاءة ديسي. وسوف يتم الاستفادة المثلى من مصدر أيون DESI مع عينة الأنسجة بمجرد إذابة ذلك، ولكن، لمصلحة من الوقت، والفترة التي كانت العينة ذوبان بمثابة الوقت المثالي لتهيئة المعدات.
    1. باستخدام الأسيتونتريل مع حمض الخليك 1٪ كما في DESI المذيبات، بدوره على مضخة المحاقن مع معدل التدفق من 5 ميكرولتر / دقيقة. وانخفاض معدل التدفق لحد من تأثير بقعة جانب من رذاذ DESI وحجم بكسل فعالة، ولكن قد يكون معدل تدفق أعلى اللازمة لحساسية كافية. وبالتالي فإن معدل التدفق (عادة 1-5 ميكرولتر / دقيقة) ينبغي أن يكون الأمثل لكل تطبيق وحساسية المطلوب والقرار. تأكد من أن حقنة تحتوي على مذيب بما فيه الكفاية لتعظيم الاستفادة كاملة والتصوير في إعطاء معدل التدفق.
    2. بمجرد ظهور المذيب نازف من طرف المصدر، بدوره على غاز النيتروجين nebulizing مع pressur(ه) من 160 رطل.
    3. بدوره على ارتفاع امدادات التيار الكهربائي متصلا مصدر أيون تطبيق 3،600 V.
  2. تركيب الشريحة على المسرح الحركة وتبدأ مصدر ايون وMS الأمثل

2. DESI الأمثل

  1. ويتكون النظام DESI من تحقيق المصدر (انظر الشكل 2)، حقنة ومضخة أو نظام بديل تسليم المذيبات والنيتروجين المضغوط، ترجمة المرحلة عينة وجبل. المضي قدما مصدر الأمثل DESI مرة واحدة تم ضبطها مطياف الكتلة لنطاق جماعي ملائمة والتحاليل من الفائدة.
    1. إذا لم يتم تشغيل مكونات المصدر على بعد الرجوع إلى أقسام 1.5.1-3 للاتجاهات.
    2. ينصح المتغيرات التي تمت مناقشتها في هذه الأقسام للتصوير من الأنسجة البيولوجية. ومع ذلك ينبغي أن يكون الأمثل هذه المتغيرات لأنواع مختلفة من الأنسجة أو عينة. وقد تم الإبلاغ عن المذيبات البديلة، ومعدلات التدفق، nebulizing الضغوط الغاز والفولتية لimagiنانوغرام من الأنسجة البيولوجية. 16-18
  2. تأكد من أن في البداية مصدر DESI لا لمس شريحة زجاجية، وليس موجها في أي جزء من قسم الأنسجة. وسوف يضمن هذا التحقيق غير معطوب في عملية التحسين الأولية ولن تلوث أي جزء من شكلتها ملامسة العينة الأنسجة.
    1. انطلاق جيدة الموقف هو مع طرف 3 مم من سطح العينة و 5 مم من مدخل شعري MS، مع التحقيق في زاوية من 55 درجة فيما يتعلق سطح العينة. والداخلية الشعرية من لجنة التحقيق DESI ينبغي أن تمتد ~ 1 ملم وراء الشعرية الخارجي. سيتم تحسين كل من هذه المعلمات.
  3. واجهة MS الشعرية ينبغي أن يكون لها زاوية مجموعة من ~ 15 درجة فيما يتعلق سطح العينة لنقل الأمثل للأيونات. ضبط ارتفاع مرحلة بحيث تحوم الشعرية MS على سطح العينة، والشعري ينبغي أن تكون <1 مم من السطح، في أقرب وقت ممكندون لمس.
  4. محاذاة التحقيق DESI في X البعد فيما يتعلق مدخل الشعرية MS بحيث تكون مباشرة في الخط.
  5. توفيق أوضاع Y و Z من مصدر ديسي لحساسية الأمثل باستخدام قسم الأنسجة الإضافية. كما لاحظ أن يتم توجيه التحقيق ديسي في منطقة عينة واحدة، وسوف تمج في نهاية المطاف وتأين كل من التحاليل في هذا المجال، وإشارة ستنخفض تدريجيا كما يحدث هذا. تنفيذ هذه الخطوة بأسرع وقت ممكن هو المهم.
    1. لذلك، في جميع مراحل عملية التحسين، ويحتاج إلى أن يتم نقل عينة تحت الرأس رذاذ لضمان أن العينة الطازجة ويجري تحليلها وأن أي تغييرات في إشارة ومن المقرر أن التحسين مصدر، وليس استنزاف عينة. ومع ذلك، بالنظر إلى أن التركيب الكيميائي متنوعة من مناطق مختلفة من الأنسجة، وإجراء مقارنة مباشرة من كثافة الأيونات عبر قسم الأنسجة بأكمله ليست دقيقة بالكامل. المهاد من الدماغ يوفر مساحة واسعة بحجم معقول معالتركيب الكيميائي أكثر اتساقا، ولكن لا تزال ليست موحدة تماما. بدلا من ذلك، وضع علامات وشربي الأحمر، الذي يحتوي على رودامين صبغ 6G ([M] +، م / ض 443)، على شريحة زجاجية بعيدا عن العينة يوفر استجابة قوية من قبل MS DESI ويمكن أيضا أن تستخدم لتعظيم الاستفادة، ولكن بالنظر إلى شكل عينة مختلفة، وتحليلها، وهذه الشروط قد لا يزال لم تكن متطابقة لمجموعة المتابعة مثالية للالأنسجة البيولوجية.
    2. أوصى فصل Y بين طرف مصدر ومدخل الشعرية: ~ 4 مم، أوصت Z الفصل بين طرف وسطح العينة: ~ 1.5 مم. ورغم أن هذه المعايير ستكون مختلفة قليلا عن كل تجريبية انشاء.
    3. تدرس الهندسة وزاوية من لجنة التحقيق، أن تأخذ في الاعتبار أن Y والمواقف Z-البعد مترابطة فيما يتعلق انتقال فعالة من قطرات تحتوي على المذيبات وتحليلها. وهناك تغير في متغير واحد تتطلب تعديل لاحق في الآخر للحفاظ على نفس الموقف تأثير الرش وزوايا انتقاله.
  6. ضبط المسافة ويقذف الشعرية الداخلية من شعري الخارجي للمصدر لأقصى قدر من الحساسية، وتأثير ضئيل حجم البقعة. تنبيه: تأكد من أن الجهد العالي هو OFF في حين جعل هذا التعديل.
  7. سيتم النظر في الهندسة مصدر الأمثل عندما لوحظ أقصى إشارة.
    1. المتغيرات الأمثل في أقسام 2،5-2،6 مترابطة، وبالتالي فإن تعديل واحد سوف تتطلب بطبيعتها إعادة التكيف من جهة أخرى للحفاظ على ما يلزم من الهندسة مصدر عينة مدخل، أو تعديل الشروط التي نوقشت في القسم 1.5.1- 3.
  8. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون عنصر التسخين المحيطة نقل شعري لمطياف الكتلة تحسين حساسية عن طريق تسهيل desolvation من قطرات الحليلة مشحونة أنتجت خلال عملية التأين. هنا نستخدم سخان حبل ملفوف حول نقل شعري لتعيين 100 درجة مئوية.

3. TISSUه التصوير

  1. أثناء عملية التصوير، مرحلة عينة يتحرك العينة تحت التحقيق DESI وMS مدخل الشعرية وتبقى جميع العناصر الأخرى ثابتة. وينبغي اختيار المعلمات حركة المرحلة يعتمد على حجم تأثير DESI ريشة وحساسية الأمثل.
    1. وهناك عمود تأثير أكبر يؤدي إلى كثافة أيون العالي، بالنظر إلى أن أكثر عينة يتم المستوعبة، ولكن للتصوير، فإنه سيؤدي أيضا في حجم بكسل أكبر ودقة وضوح الصورة وبالتالي أسوأ.
  2. مرحلة الترجمة المستخدمة في هذه التجربة هي موطن بنيت والتي تسيطر عليها برنامج ابفيف التي تسمح للسيطرة على rastering السرعة وتباعد الأسطر لصورة ذات أبعاد معينة. مرحلة حركة السادس التحكم المستخدمة في هذه التجربة هو متاح في omnispect.bme.gatech.edu. بدلا من ذلك، مصدرا DESI المتاحة تجاريا ومرحلة يمكن أن تستخدم مثل 2D الآلي أومني بخاخ مصدر من Prosolia شركة (إنديانابوليس، IN USA).
    1. لأنسجة الدماغنموذجي حجم الصورة 10 × 15 مم، ونظرا للمعلمات الحركة مرحلة استخدامها، وسوف يستغرق ما يقرب من صورة 3 ساعة.
      1. برنامج ابفيف السادس أو برنامج حاسوبي لمراقبة ما يعادلها للظروف التصوير المطلوب، وذلك باستخدام سرعة مرحلة الفحص من 80 ميكرون / ثانية، وتباعد الأسطر بين صفوف من 200 ميكرون. عند استخدام بخاخ مصدر أومني، يجب تعيين المعلمات الحركة لسرعة المسح الضوئي من 100-200 ميكرون / ثانية وتباعد الأسطر من 200 ميكرون. لاحظ أن هذه الحركة المعلمات ويمكن ان تتغير اعتمادا على عدد من وحدات البكسل المطلوب في كل البعد وضرورية حساسية.
        1. وقد تبين وجود تباعد الأسطر الأصغر لتحسين جودة الصورة، مع سرعة مسح بعد أقل من تأثير. 25 ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذا لا يشير بالضرورة وتحسين دقة وضوح الصورة، والتي تعتمد بقوة على بقعة أثر الحجم. وهناك سرعة المسح الضوئي أبطأ وتباعد الأسطر الأصغر زيادة كبيرة في وقت التحليل، وبالتالي يجب أن يكون optimiزيد لكل نوع من الأنسجة أو عينة.
      2. مع اكتساب الطيفية MS الغروب في 1 المسح الضوئي / ثانية، وخلق صورة ك 1 بكسل / المسح الضوئي، وسرعة مرحلة يحدد حجم البكسل في X البعد، في حين يحدد تباعد الأسطر حجم بكسل في البعد ذ. على الرغم من أن حجم بكسل الحقيقي للصورة هو أكبر من هذا نظرا للرش نشر، والحركة أبطأ يسمح بمزيد من الوقت للالامتزاز والكشف عن التحاليل.
    2. تعطي الدليل مسار واسم الملف لموقف والوقت الملفات التي سيتم تسجيلها خلال الصور داخل ابفيف السادس.
  3. استعدادا للحصول على البيانات الطيفية الشامل، حساب الوقت الإجمالي المطلوب للتصوير. برنامج ابفيف المستخدمة من قبل مجموعتنا تلقائيا يوفر هذه القيمة، ولكن إذا تم استخدام التحكم مرحلة بديلة، وهذا الحساب هو ضروري للحصول على الإعدادات الحصول على البيانات MS.
    1. عند استخدام بخاخ أومني مصدر الآلي والمسرح، واكتسب كل سطر من الصورة كما فيdividual يعمل. وتحسب لكل خط الوقت وعدد الخطوط اللازمة لأبعاد التصوير نظرا باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة أومني بخاخ لتكون مدخلات البرنامج مطياف الكتلة.
  4. تأكد من أن مطياف الكتلة سرعة المسح الضوئي هو 1 الطيف / ثانية، وضبط الوقت اقتناء أداة لتتناسب مع الوقت الإجمالي المحسوب.
    1. ضبط سرعة المسح الضوئي الطيفي لطيف 1 / ثانية.
    2. الحصول على البيانات في وضع صورة وتأكد من أن نطاق م / ض غير مناسبة لنوع من الفائدة. تذكر أن تنتج DESI أيضا التحاليل اتهم تتضاعف، كما هو الحال في ESI.
    3. تعيين اكتساب الوقت لمطابقة إجمالي الوقت صورة معينة عن طريق ابفيف.
  5. ضع بقعة تأثير رش في الجزء العلوي الأيسر من المنطقة المراد تصويرها.
  6. تبدأ الحصول على البيانات MS والحركة المرحلة في وقت واحد.
  7. بعد الانتهاء من الحصول على البيانات، والعودة مطياف الكتلة إلى وضع الاستعداد.
  8. إيقاف الجهد العالي من مصدر ديسي.
  9. بدوره سFF غاز النيتروجين.
  10. إيقاف ضخ حقنة.

4. معالجة الصور

  1. البيانات الطيفية الشامل، في تركيبة مع الوقت مرحلة والبيانات المحفوظة موقف كملفات نصية من خلال ابفيف يجب "مطوية" في صورة 2D ربط إحداثيات بكسل مع أطياف المقابلة. تم معالجة الصور المعروضة هنا باستخدام البرمجيات القائمة على مطلب التي هي متاحة بحرية في: omnispect.bme.gatech.edu. إذا يتم الحصول على البيانات باستخدام بخاخ مصدر أمني، يتم استخدام اليراع برامج تحويل البيانات لإنشاء مكعب البيانات لرؤية الصورة في BioMAP (www.maldi-msi.org).
  2. بالنسبة للبيانات حصلت على جيول AccuTOF مطياف الكتلة، يجب أن يعاد تصدير الجزء اللوني سجلت في صيغة CDF لمزيد من التحليل.
    1. باستخدام DataManager داخل MassCenter، أولا تحويل البيانات التي حصل عليها لبيانات centroided (أدوات → تحويل البيانات إلى اكساب النقطة الوسطى). ثم تصدير البيانات في صيغة CDF باستخدام تركيبة المفاتيح على Ctrl + Shift + E فلlowed بواسطة أدوات → تصدير.
  3. تحميل الخام. CDF البيانات الطيفية الشامل وملفات نصية اثنين، وموقف والوقت، لموقع OmniSpect. يمكن للبيانات التصوير اليراع-معالجتها يمكن تصور في BioMAP.
    1. مزيد من المعالجة للبيانات بما في ذلك التحليل الإحصائي من قبل غير سلبي التحليل للعوامل مصفوفة أو التآمر لأيون واحد من الفائدة يمكن القيام بها مباشرة على الموقع.
    2. بدلا من ذلك، يمكن تصديرها المكعب البيانات الخام للتحليل في ماتلاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 3 ممثل طائفة الحصول عليها من قسم دماغ الفئران غير المعالجة. في وضع إيجابي، ويهيمن على الطيف الشامل phosphatidylcholines نظرا لكفاءتها العالية التأين (نسبت إلى جماعة الأمونيوم الرباعية موجبة الشحنة). يظهر إجمالي صورة أيون من قسم الأنسجة أيضا في الشكل (3)، والتي تبين إشارة وفيرة في جميع أنحاء القسم الدماغ بأكمله. ويتم تحديد نسبة الدهون في الكشف عن مفتاح في الجدول 1 من خلال إجراء مقارنات الأدب.

التوزيع المكاني للسبيل المثال الدهون (الشكل 4) إظهار كيف أن الوفرة النسبية للأنواع المختلفة فسفاتيديل يتراوح بين الرمادي والمادة البيضاء في الدماغ. على سبيل المثال، [PC 34:1 + K] +، م / ض 798،5364، ويبين زيادة كثافة القشرة في المخيخ (المادة الرمادية)، في حين أن [PC 36:1 + K] +، م / ض 826،5558، ويبين زيادة كثافة في والسويقة المخيخية (مبادرة الخوذ البيضاءالشركة المصرية للاتصالات المسألة). صورة مركب التي تم الحصول عليها لمدة الأيونات (الشكل 4C) يسلط الضوء على التباين في توزيع الدهون عبر قسم الأنسجة. يتم سرد التوزيعات المكانية من الدهون رئيسية أخرى في الدماغ أيضا في الجدول 1. هذه التوزيعات أتفق مع الدراسات السابقة. 28-30

الشكل 1
الشكل 1. يستخدم التخطيطي للDESI-MSI عملية التصوير. ديسي (أ) لتحليل سطح الأنسجة، وعندما يتم rastered العينة في حركة رقابة (ب) أدناه المصدر، البيانات الطيفية الشامل، وكثافة مباراة م / ض ج ( )، بوصفها وظيفة من الزمن (د) هو المكتسبة. ثم يرتبط هذه البيانات من خلال المجال الزمني مع المعلمات الحركة لتشكيل صورة الكيميائية(ه). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. التخطيطي من مصدر ديسي.

الشكل (3)
الشكل (3). متوسط ​​أطياف النسيج مع م / ض القيم أكثر وفرة المسمى (أ) ومجموع الصور أيون (ب) التي حصل عليها DESI-MSI في وضع ايون ايجابية.

الشكل 4 الشكل 4. اختيار الصور أيون من phosphocholines رئيسيا في الفئران أنسجة المخ التي حصل عليها DESI-MSI في وضع أيون إيجابية؛ (أ) [PC 34:1 + K] +، م / ض 798،5364، (ب) [PC 36:1 + K] + ، م / ض 826.5558؛ (ج) صورة مركبة من م / ض 798، أزرق، و 826، أحمر.

نوع م / ض توطين (المسألة)
[PC 32:0 + NA] + 756.5335 رمادي
[PC 32:0 + K] + 772.5165 رمادي
[PC 36:4 + H] + 782.5477 أبيض
[PC 34:1 + K] + 798.5364 رمادي
[PC 38:4 + H] + أبيض
[PC 36:1 + K] + 826.5558 أبيض

الجدول 1. الهويات الدهون الأساسية وتوطين داخل قسم المخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الاستفادة المثلى من مصدر هندسة DESI أمر بالغ الأهمية للتجارب ناجحة MSI. متغيرات متعددة تسهم في المواءمة بين النظام تؤثر بشكل مباشر على حساسية ودقة وضوح الصورة. إذا خلال التحسين، والمجرب لديه صعوبات في الحصول على إشارة، فإننا نوصي باستخدام بقعة شربي الحمراء المرسومة على الشريحة كمعيار؛ الصبغة، رودامين 6G، م / ض 443، وتنتج إشارة قوية في وضع ايون ايجابية، ويمكن استخدامها لل الأمثل الأولي. بالإضافة إلى ذلك، واختيار مذيب للديسي أمر بالغ الأهمية لحساسية، كما نقل الحليلة والتأين يعتمد على استخراج الحليلة من على سطح الأرض في طبقة رقيقة شكلت 13 التأين electrospray المتوافقة مع العديد من المذيبات ومخاليط يمكن أن تستخدم للمساعدة في desolvation وعملية التأين اعتمادا على فئة من مجمع الفائدة خلال التحليل.

وكما ذكر سابقا، فإن القرار من DESI-MS صورة DEPENDS في المقام الأول على هندسة المصدر. يتم الحصول على صورة القرار بناء على أمر من 200 ميكرون بشكل منتظم من قبل DESI-MSI، رغم أن هذا هو أعلى من القائم على الليزر و / أو في أساليب التصوير الخلاء التي يمكن أن تتراوح من 10-150 ميكرون ~. 5،31 القرار تصل إلى 40 ميكرون وقد أبلغ باستخدام ديسي، 24 ومع ذلك، 200 ميكرون لتصوير روتين كافية لتحليل قطاعات واسعة الأنسجة البيولوجية. نوعية السيليكا تنصهر الشعرية الداخلية من مصدر DESI سوف تؤثر أيضا على جودة الصورة وحلها. القطر الداخلي الموصى بها من شعري هو 50 ميكرون، كما كبيرة معرف الشعيرات الدموية إنتاج رشاشات أكبر ودقة وضوح الصورة بشكل اكبر. 25 إذا كانت هذه الشعرية لا يتم خفض بشكل مباشر أو مشققة، فإن رذاذ لا يكون مخروطي مما أدى إلى تأثير بقعة غير منتظمة الشكل، وسوء- جودة والصور irreproducible.

فالامر لا يقتصر على الهندسة مصدر تؤثر على قرار من DESI-MSI، كما أنه يلعب دورا هاما في الحساسيةهذه الطريقة. ولذلك يجب أن يكون الأمثل للهندسة وتبقى ثابتة في جميع أنحاء الداخلي. إذا كانت العينة غير مستو، أو لم يتم تحميل تماما أفقيا، فإن الهندسة مصدر تغيير، وبالتالي تغيير استجابة وخلق قطعة أثرية داخل الصورة. 23 وعلى الرغم من DESI-MSI تقتصر على عينات مستو، يتم إجراء التصوير 3D من الأنسجة البيولوجية ممكن من خلال التصوير 2D من أقسام الأنسجة المسلسل الذي يتم بعد ذلك مكدسة في صورة ثلاثية الابعاد. يمكن أيضا أن تستخدم 32 هذا النهج لطرق MSI الأخرى، بما في ذلك SIMS، MALDI، LAESI، وما يمكن 33 ثلاثي الأبعاد الصور مطياف الكتلة يكون أيضا التي أنشأتها إزالة تدريجية من طبقات من المواد، من خلال نبضات الليزر على سبيل المثال، وreimaging 34

تحليل الوضع الإيجابي للأنسجة الدماغ الفئران يسهل التصوير الناجح لphosphatidylcholines وبعض العقاقير ونواتج الأيض. 18 ولاستكمال هذا التحليل، والتصوير في نيجاتيفه وضع ينتج الطيف مع تنوع أكبر من الطبقات من الدهون، 28،35، ويمكن استخدامها لتوفير تحليل شامل لأقسام الأنسجة. في الحالات التي يمكن أن يعزى أكثر من نوع واحد من المادة الدهنية إلى معين م / ض القيمة، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي يمكن أن تستخدم لتحديد الهوية. يقدم جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي أيضا كطريقة إضافية من تأكيد هوية الدهون 35

وقد تبين المحيطة قياس الطيف الكتلي التصوير من قبل ديسي أن تكون فعالة في التصوير من الأنواع الدهون في أنسجة المخ الفئران. يمكن معلومات تم الحصول عليها من خلال التجارب MSI توفير نظرة ثاقبة الأمراض المرتبطة بمستويات غيرت من الدهون الفوسفاتية مثل مرض الزهايمر، ومتلازمة داون، ومرض السكري، وغيرها. 36-38 بالنظر إلى وفرة عالية من الدهون ودورهم في العمليات البيولوجية، وجود العديد من النظم البيولوجية التي ستستفيد من المعلومات التي تم الحصول عليها عن طريق قياس الطيف الكتلي التصوير. مع العديد من وسائل المحتملةلعينات بيولوجية الصورة باستخدام مطياف الكتلة، وأساليب التأين المحيطة، DESI على وجه الخصوص، توفر وسيلة للقيام بذلك مع انخفاض إعداد العينات وزيادة سهولة تحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني الأذربيجانية MRI صك المنحة التنموية # 0923179 إلى FMF. نشكر أكوا Asberry، منسق مختبر لH. معهد بيتي باركر لهندسة البيولوجيا وعلم الأنسجة العلوم البيولوجية الأساسية، للحصول على المساعدة مع باجتزاء الأنسجة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
  3. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).
  4. Nemes, P., Laser Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).
  6. Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -N. T. Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).
  7. Takáts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science. 306, 471-473 (2004).
  8. Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).
  9. Costa, A. B., Cooks, R. G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).
  10. Costa, A. B., Graham Cooks, R. Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).
  11. Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization. Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).
  12. Kebarle, P., Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).
  13. Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 135, 731-737 (2010).
  14. Van Berkel, G. J., Kertesz, V. Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).
  15. Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview. Analyst. 135, 669-681 (2010).
  16. Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).
  17. Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 135, 28-32 (2010).
  18. Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).
  19. Eberlin, L. S., et al. Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry. Cancer Res. 72, 645-654 (2012).
  20. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).
  21. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).
  22. Lane, A. L., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).
  23. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).
  24. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).
  25. Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).
  26. Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).
  27. Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).
  28. Jackson, S. N., Wang, H. -Y. J., Woods, A. S. Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS. Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).
  29. Jackson, S. N., et al. MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue. J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).
  30. Wang, H. -Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections. Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).
  31. Wu, B., Becker, J. S. Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range. Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).
  32. Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).
  33. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier. Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).
  34. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  35. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).
  36. Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).
  37. Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain. Brain Res. 867, 9-18 (2000).
  38. Han, X., et al. Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study. Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 77، علم الأحياء الجزيئية، والهندسة الطبية الحيوية، الكيمياء، الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية، الفيزياء، علم الأحياء الخلوي، تصوير الجزيئي، الطيف الكتلي، MS، MSI، الامتزاز electrospray التأين، ديسي، المحيطة مطياف الكتلة، والأنسجة، باجتزاء، العلامات البيولوجية، والتصوير

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

التصوير من الأنسجة البيولوجية بواسطة الامتزاز Electrospray التأين الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter