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Bioengineering

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse (DESI-MS) est une méthode ambiant par lequel des échantillons, y compris les tissus biologiques, peuvent être imagées avec une préparation minimale de l'échantillon. Par rastering l'échantillon en dessous de la sonde d'ionisation, cette technique spray à base offre une résolution spatiale suffisante pour discerner les caractéristiques moléculaires d'intérêt au sein des coupes de tissus.

Abstract

L'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) fournit de l'information moléculaire non ciblées avec la plus grande spécificité et la résolution spatiale pour l'étude des tissus biologiques à des centaines à des dizaines d'échelle microns. Quand elle est réalisée dans les conditions ambiantes, l'échantillon de pré-traitement devient inutile, ce qui simplifie le protocole tout en maintenant la haute qualité des renseignements obtenus. La désorption ionisation électrospray (DESI) est une technique de MSI ambiante à base de pulvérisation que permet l'échantillonnage direct de surfaces à l'air libre, même in vivo. Lorsqu'il est utilisé avec un étage d'échantillon commandé par logiciel, l'échantillon est tramé en dessous de la sonde d'ionisation DESI, et à travers le domaine du temps, m / z information est corrélée avec la répartition spatiale de l'espèce chimique. La fidélité de la sortie DESI-MSI dépend de l'orientation de la source et de positionnement par rapport à la surface de l'échantillon et d'une entrée de spectromètre de masse. Ici, nous examinons la façon de préparer des coupes de tissus pour DESI iforgemagie et conditions expérimentales supplémentaires qui influent directement sur la qualité de l'image. Plus précisément, nous décrivons le protocole pour l'imagerie des coupes de tissus de cerveau de rat par DESI-MSI.

Introduction

Imagerie non ciblée par spectrométrie de masse facilite l'acquisition de l'information chimique pour des applications de découverte et génératrice d'hypothèses. Imagerie ciblée d'un produit chimique connu sous le nom de l'intérêt, d'autre part, peut faciliter l'augmentation de la sensibilité et de sélectivité par le développement de la méthode spécifique. Spectrométrie de masse d'imagerie (MSI) est le plus souvent réalisée sur les tissus en utilisant MALDI, 1 spectrométrie de masse d'ions secondaires (SIMS), 2 et techniques d'ionisation ambiantes, y compris désorption ionisation électrospray (DESI), 3 ionisation laser ablation électrospray (LAESI), 4, 5 et liquide micro-jonction de la surface sonde de prélèvement (LMJ-SSP). 6 Dans MALDI et SIMS, les échantillons doivent être éliminés physiquement de l'échantillon, et doivent être plate et mince, comme elles sont analysées sous un vide poussé. MALDI nécessite revêtement de l'échantillon avec une matrice d'absorption de rayonnement, l'ajout d'une étape supplémentaire et encombrant pour la préparation de l'échantillon. SIMSa la résolution latérale la plus élevée, mais bombardement avec des particules de haute énergie provoque une fragmentation moléculaire. Par conséquent, MSI par des méthodes ambiantes occuper un créneau où l'analyse doux avec une préparation minimale de l'échantillon est souhaitable. Cependant, à ce jour, toutes les méthodes sont encore limités par l'exigence de surfaces d'échantillons plats.

DESI utilise un spray solvant chargé ASSISTEE dirigé à la surface de l'échantillon pour désorber et ioniser les analytes. 7 Le modèle de travail pour la désorption et l'ionisation ultérieure par DESI est connue comme la "goutte modèle pick-up". 8-10 Les gouttelettes chargées primaires produite par la sonde de DESI entrer en collision avec la surface, le mouillant et en formant un film mince dans laquelle la substance à analyser est dissous par un mécanisme de micro-extraction solide-liquide 8 ultérieur gouttelette collisions se traduisent par transfert de quantité de mouvement et de décollage de gouttelettes secondaires contenant la matière extraite de la surface 9,10. Finalement, le gazions en phase sont soupçonnés d'être générées par des processus ESI-comme la suite de l'évaporation de l'ion, modèles de résidus de charge ou d'autres modèles, 11 mais le processus de formation des ions précis dans DESI doit encore être prouvé expérimentalement. 12 sensibilité de DESI est fortement dépendante de la solubilité l'analyte dans le solvant de pulvérisation, que la désorption se fonde sur la micro-extraction localisée 13.

Lorsqu'il est utilisé avec un stade de l'échantillon contrôlé par logiciel, l'échantillon est analysé unidirectionnelle avec voie marcher sous la sonde d'ionisation de DESI, et à travers le domaine temporel, m / z information est corrélée avec la distribution spatiale de l'espèce chimique (figure 1). Depuis la première preuve de principe expérience DESI-MSI rapporté par Van Berkel et Kertesz en 2006, 14 la technique a considérablement évolué, avec 15 applications signalées dans l'analyse des lipides, 3,16 métabolites de drogues, 17,18 diseabiomarqueurs soi, 19 tissus du cerveau, 3,18,20 tissus du poumon, 18 tissu rénal, 18 tissu testiculaire, 18 glandes surrénales, 17 plaques de chromatographie sur couche mince, 21 et surfaces d'algues. 22 La résolution de routine des images obtenues par DESI-MSI est 100-200 um, ce qui est finalement déterminé par la surface effective extraite par les embruns, mais résolutions aussi basses que 40 um ont été rapportés. telle résolution et la facilité d'analyse 23-25 ​​rend DESI-MSI approprié pour l'analyse rapide et simple des échantillons de tissus biologiques avec des zones de surface dans la gamme 0,5-5 cm 2, ce qui permet l'acquisition de données spatiales utiles pour mieux comprendre les processus biologiques 26. Voici, à titre d'exemple d'application typique DESI-MSI, nous passons en revue les détails de la procédure de réalisation d'une expérience réussie impliquant l'imagerie de lipides dans les tissus du cerveau de rat. Les deux étapes les plus critiques dans le protocole sont lestissus préparation 27 et l'optimisation de la source d'ions de DESI, comme décrit ci-dessous.

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Protocol

1. Tissue sectionnement

  1. Magasin, tout le tissu surgelé en -80 ° C congélateur jusqu'au moment de la coupe.
  2. Permettre à l'échantillon de tissu pour atteindre la température dans la cryomicrotome avant la coupe (30 min). Régler la lame et la température de l'échantillon à -30 ° C.
  3. Une fois que le tissu a atteint la température, la manipulation de l'échantillon avec des pincettes, couper avant ou l'arrière du cerveau en fonction de quelle partie du cerveau est d'intérêt pour montage en surface suffisante (c'est à dire si l'avant du cerveau est d'une importance primordiale, monter à l'arrière du cerveau le mandrin).
    1. Appliquer ~ 0,5 ml coupe optimale composé de température (OCT, Tissue-Tek, Sakura) à mandrin dans le centre et, en utilisant des pinces, maintenez échantillon en place en octobre jusqu'à ce qu'il se solidifie. Une fois que octobre est complètement gelé, montage mandrin porte-échantillon.
    2. Un montant minimal de l'OCT utilisé pour monter l'échantillon est préférable (contrairement à monter le spécimen dans un bloc de l'OCT comme cela se fait couramment dans d'autres histoprocédures logiques) afin de minimiser la contamination de l'échantillon. La contamination de l'échantillon par OPO est préjudiciable à la DESI et le processus d'imagerie raison de la suppression d'ions.
  4. Coupes de tissus typiques nécessaires pour la gamme MS imagerie 12-18 um d'épaisseur. Section tissus à l'épaisseur désirée dans la fourchette recommandée. Décongelez-monter chaque tissu sectionnée par un léger toucher une lame de verre microscope à température ambiante sur l'article. Une fois qu'un échantillon est monté, soyez prudent de ne pas toucher la coupe de tissu que cela va changer les distributions et compositions chimiques.

Remarque: Nous recommandons le montage de deux sections par lame, en utilisant une section d'optimisation, et l'autre pour l'imagerie. Si les articles ne sont pas pour l'imagerie immédiate, conserver les lames à -80 ° C dans un congélateur boîte à lames jusqu'au moment de l'analyse.

  1. Si l'analyse des sections stockées, retirez diapositive du congélateur, transférer immédiatement au dessiccateur sous vide, et permettre ~ 15-20min pour dégeler. Laissant le spécimen dans le dessiccateur plus va sécher l'échantillon et réduire l'efficacité de DESI. L'optimisation de la source d'ions de DESI se fera avec l'échantillon de tissu une fois qu'il a dégelé, cependant, dans l'intérêt de temps, la période au cours de laquelle l'échantillon est en train de fondre sert le moment idéal pour l'initialisation de l'appareil.
    1. En utilisant l'acétonitrile avec de l'acide acétique à 1% comme solvant DESI, tourner sur la pompe à seringue avec un débit de 5 pl / min. Un débit inférieur réduit du côté de la tache d'impact du jet de DESI, et la taille effective de pixel, mais une vitesse d'écoulement supérieure peut être nécessaire pour une sensibilité suffisante. Par conséquent, le débit (typiquement 1-5 pl / min) doit être optimisée pour chaque application et de la sensibilité et de la résolution souhaitée. S'assurer que la seringue contient suffisamment de solvant pour l'optimisation complète et d'imagerie à un débit donné.
    2. Une fois le solvant semble dégoulinant de la pointe de la source, allumez le gaz de nébulisation d'azote avec un pressure de 160 psi.
    3. Allumez l'alimentation haute tension relié à la source d'ions appliquer 3,600 V.
  2. Monter la lame sur la platine du mouvement et commencer source d'ions et d'optimisation MS

2. Optimisation de la DESI

  1. Le système de DESI compose d'une sonde de la source (voir la figure 2), une seringue et d'une pompe ou d'un système de distribution alternatif solvant, l'azote comprimé, le stade de l'échantillon de traduction et de montage. Procéder à l'optimisation de la source de DESI une fois le spectromètre de masse a été réglé pour la gamme et les analytes d'intérêt masse appropriée.
    1. Si les composants de la source n'ont pas été encore activée, se reporter aux sections 1.5.1-3 pour les directions.
    2. Les variables examinées dans les sections suivantes sont recommandées pour l'imagerie des tissus biologiques. Toutefois, ces variables doivent être optimisés pour différents types de tissus ou d'échantillon. D'autres solvants, les débits, les pressions de gaz de nébulisation et les tensions ont été signalées imaginationng de tissus biologiques. 16-18
  2. S'assurer que d'abord la source de DESI n'est en contact avec la lame de verre, et non dirigé sur une partie de la coupe de tissu. Cela permettra d'assurer que la sonde ne soit pas endommagée dans le processus d'optimisation initial et ne sera pas contaminer n'importe quelle partie de la mise en place en entrant en contact avec l'échantillon de tissu.
    1. Une bonne position de départ est à l'extrémité 3 mm de la surface de l'échantillon et de 5 mm à partir de l'entrée capillaire MS, avec la sonde à un angle de 55 ° par rapport à la surface de l'échantillon. Le capillaire interne de la sonde de DESI devrait s'étendre ~ 1 mm au-delà de la capillaire extérieure. Tous ces paramètres seront optimisés.
  3. L'interface MS capillaire doit avoir un angle de collecte de ~ 15 ° par rapport à la surface de l'échantillon pour un transfert optimal d'ions. Réglez la hauteur du stade afin que les capillaires MS plane sur la surface de l'échantillon, le capillaire doit être <1 mm de la surface, aussi près que possiblesans se toucher.
  4. Aligner la sonde de DESI dans la dimension x par rapport au capillaire d'entrée MS afin qu'ils soient directement en ligne.
  5. Réglez les positions y et z de la source de DESI pour une sensibilité optimale en utilisant la section de tissu supplémentaire. Notez que la sonde de DESI est dirigée vers une zone d'échantillonnage, elle finira par désorption et l'ionisation de tous les analytes dans ce domaine et le signal va progressivement diminuer à mesure que cela se produit. L'exécution de cette étape aussi rapidement que possible est important.
    1. Par conséquent, pendant tout le processus d'optimisation, l'échantillon doit être déplacée en dessous de la tête de pulvérisation afin d'assurer que nouvel échantillon est analysé et que tout changement de signal sont dues à l'optimisation de la source, et non pas l'appauvrissement de l'échantillon. Toutefois, étant donné que la composition chimique variée de différentes régions du tissu, une comparaison directe de l'intensité des ions à travers la section de tissu tout n'est pas tout à fait exacte. Le thalamus du cerveau fournit une zone assez grande taille aveccomposition chimique plus cohérent, mais toujours pas parfaitement uniforme. Alternativement, un marquage des Sharpie rouge, qui contient la rhodamine colorant 6G ([M] +, m / z 443), sur la lame de verre à partir de l'échantillon prévoit une forte réponse MS par DESI et peut également être utilisé pour l'optimisation, mais compte tenu de la forme différente de l'échantillon et de l'analyte, ces conditions peuvent toujours pas en corrélation avec un set-up idéal pour les tissus biologiques.
    2. Recommandé séparation y entre la pointe de source et capillaire d'entrée: ~ 4 mm, recommandé séparation z entre la pointe et la surface de l'échantillon: ~ 1,5 mm. Bien que ces paramètres seront légèrement différent pour chaque configuration expérimentale.
    3. Compte tenu de la géométrie et de l'angle de la sonde, il faut tenir compte du fait que la position y et cote z sont liés entre eux par rapport à la transmission efficace du solvant et contenant de l'analyte gouttelettes. Un changement d'une variable de demande une modification ultérieure de l'autre pour maintenir le même point d'impact de jet etles angles de transmission.
  6. Réglez la distance des extrusions capillaires internes du capillaire externe de la source pour une sensibilité maximale et un impact minimal taille de spot. Attention: Assurez-vous que la haute tension est éteint tout en faisant cet ajustement.
  7. La géométrie de la source sera considérée comme optimale lorsque le signal maximal est observé.
    1. Les variables optimisés dans les sections 2.5 à 2.6 sont liés entre eux, donc le réglage d'une façon inhérente nécessite le réajustement de l'autre pour maintenir la géométrie nécessaire source échantillon d'entrée ou le réglage des conditions discutées dans la section 1.5.1- 3.
  8. De plus, un élément chauffant qui entoure le transfert capillaire pour le spectromètre de masse peut améliorer la sensibilité en facilitant désolvatation de gouttelettes de substance à analyser chargées produites pendant le processus d'ionisation. Ici, nous utilisons un appareil de chauffage de la corde enroulée autour du transfert capillaire réglé à 100 ° C.

3. Tissue Imaging

  1. Au cours du processus de formation d'image, la phase de l'échantillon se déplace l'échantillon sous la sonde d'admission et DESI MS capillaire et tous les autres composants restent stationnaires. Les paramètres de mouvement de la scène doivent être choisis en fonction de l'impact DESI taille du panache et sensibilité optimale.
    1. Un grand panache de l'impact se traduira par une intensité ionique plus élevée, étant donné que plus l'échantillon est désorbé, mais pour l'imagerie, il entraînera également une taille de pixel plus large et donc plus mauvais résolution d'image.
  2. L'étape de traduction utilisé dans cette expérience est la maison-construit et contrôlé par un programme LabVIEW qui permet de contrôler la vitesse et l'espacement des lignes de tramage pour une image de dimensions données. Le VI de commande de mouvement de scène utilisé dans cette expérience est disponible à omnispect.bme.gatech.edu. Alternativement, une source de DESI disponible dans le commerce et le stade pourraient être utilisés comme source de l'Omni 2D automatisé de pulvérisation Prosolia Inc. (Indianapolis, IN USA).
    1. Pour les tissus du cerveau d'untaille de l'image typique est de 10 x 15 mm, et compte tenu des paramètres de mouvement de la scène, l'image prendra environ 3 heures.
      1. Programme LabView VI ou le logiciel de commande équivalente pour des conditions de formation d'image souhaités, en utilisant une vitesse de phase de balayage de 80 pm / sec, et de l'espacement de ligne entre des rangées de 200 um. Lorsque vous utilisez la source pulvérisation Omni, paramètres de mouvement devraient être fixées pour une vitesse de balayage de 100 à 200 um / s et un espacement des lignes de 200 um. A noter que ces paramètres de mouvement peuvent être modifiés en fonction du nombre de pixels désirées dans chaque dimension et de sensibilité nécessaire.
        1. Un espacement de ligne inférieure a été montré pour améliorer la qualité d'image, avec la vitesse de balayage ayant moins d'effet. 25 Cependant, il est important de noter que cela ne signifie pas nécessairement et une meilleure résolution de l'image, comme c'est fortement dépendante point d'impact taille. Une vitesse de balayage lent et l'espacement des lignes plus petite permettra d'accroître considérablement le temps d'analyse et doivent donc être optized pour chaque type de tissu ou de l'échantillon.
      2. Grâce à l'acquisition spectrale MS fixé à 1 scan / sec, et de l'image créée en tant que 1 pixel / balayage, la vitesse de phase détermine la taille des pixels dans la dimension x, tandis que l'espacement de ligne détermine la taille des pixels dans la dimension y. Bien que la taille réelle de pixel de l'image est plus grande que ce à cause de pulvériser la diffusion, le mouvement lent permet plus de temps pour la désorption et la détection des analytes.
    2. Donnez-chemin du répertoire et nom de fichier pour les fichiers de position et de temps pour être enregistrées au cours des images dans le LabView VI.
  3. En préparation pour l'acquisition des données des spectres de masse, calculer le temps total nécessaire pour l'imagerie. Le programme Labview utilisé par notre groupe fournit automatiquement cette valeur, mais si le contrôle de la scène alternative est utilisée, ce calcul est nécessaire pour que les paramètres d'acquisition de données MS.
    1. Lorsque vous utilisez un spray source et stade automatisé Omni, chaque ligne de l'image est acquise comme dansindividu s'exécute. La-per-ligne du temps et le nombre de lignes nécessaires pour des dimensions d'imagerie sont calculés en utilisant le logiciel de contrôle pulvérisation Omni à entrer dans le logiciel du spectromètre de masse.
  4. S'assurer que la vitesse de balayage d'un spectromètre de masse est une spectre / sec, et de régler le temps d'acquisition de l'appareil pour correspondre à la durée totale calculée.
    1. Réglez la vitesse de balayage spectral à 1 spectre / sec.
    2. Acquérir des données en mode profil et faire en sorte que la gamme m / z est approprié pour les espèces d'intérêt. Rappelez-vous que DESI produit également des analytes à charges multiples, comme dans ESI.
    3. Réglez le temps d'acquisition pour correspondre à la durée totale de l'image donnée par LabView.
  5. Placez le point d'impact de pulvérisation dans le coin supérieur gauche de la zone à imager.
  6. Commencez acquisition de données MS et le mouvement de la scène en même temps.
  7. Lors de la conclusion de l'acquisition de données, retourner spectromètre de masse en mode veille.
  8. Éteignez haute tension de la source de DESI.
  9. Tournez off de l'azote gazeux.
  10. Arrêter la pompe de la seringue.

4. Traitement de l'image

  1. De spectrométrie de masse, en combinaison avec un temps de la scène et les données de position enregistrées sous forme de fichiers texte via LabView doivent être «plié» en une image 2D corrélation coordonnées de pixels avec les spectres correspondants. Les images présentées ici ont été traitées en utilisant le logiciel Matlab basée qui est disponible gratuitement à l'adresse: omnispect.bme.gatech.edu. Si les données sont acquises en utilisant la source de pulvérisation Omni, le logiciel de conversion de données Firefly est utilisé pour créer le cube de données de visualisation de l'image dans BioMAP (www.maldi-msi.org).
  2. Pour les données acquises sur le spectromètre de masse Jeol AccuTOF, le chromatogramme enregistré doit être exporté au format CDF. Pour une analyse ultérieure.
    1. Utilisation du DataManager sein MassCenter, d'abord convertir les données acquises à des données centroided (Outils → convertir les données d'acquistion de Centroid). Puis exporter les données au format CDF. L'aide de la combinaison de touches Ctrl + Maj + E foltiquement en Outils → Exporter.
  3. Télécharger le fichier. Cdf données brutes de masse spectrales et les deux fichiers texte, la position et l'heure, sur le site OmniSpect. Données d'imagerie Firefly-traitées peuvent être visualisées dans BioMAP.
    1. Le traitement ultérieur des données dont l'analyse statistique par factorisation matrices non-négatives ou tracé d'un seul ion d'intérêt peut être effectuée directement sur le site.
    2. Alternativement, le cube de données brutes peuvent être exportées pour analyse dans Matlab.

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Representative Results

La figure 3 montre un spectre représentant obtenu à partir d'une section de cerveau de rat non traité. Dans le mode positif, le spectre de masse est dominé par les phosphatidylcholines en raison de leur efficacité d'ionisation élevé (attribué au groupe d'ammonium quaternaire chargé positivement). L'image d'ions total de la coupe de tissu est également représenté sur la figure 3, montrant signaux abondante à travers toute la section du cerveau. Lipides clés détectés sont identifiés dans le tableau 1 par des comparaisons de la littérature.

La répartition spatiale des exemples de lipides (Figure 4) montrent comment l'abondance relative des différentes espèces de phosphatidylcholine varie entre matière grise et blanche du cerveau. Par exemple, [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, montre une intensité accrue dans le cortex cérébelleux (matière grise), tandis que [PC 36:1 + K] +, m / z 826,5558, montre une intensité accrue dans le pédoncule cérébelleux (WHIquestion te). L'image composite obtenue pour les deux ions (figure 4c) met en évidence le contraste dans la distribution des lipides dans la section de tissu. Les distributions spatiales des autres lipides clés dans le cerveau sont également répertoriés dans le tableau 1. Ces distributions sont d'accord avec des études précédentes. 28-30

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la DESI-MSI processus d'imagerie. DESI (a) est utilisé pour l'analyse de la surface des tissus, et lorsque l'échantillon est tramé dans un mouvement contrôlé (b) ci-dessous la source, les données de spectre de masse, de l'intensité vs m / z (c ), en fonction du temps (d) est acquise. Ces données sont ensuite corrélés dans le domaine temporel avec des paramètres de mouvement pour former une image chimique(E). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Schéma de source de DESI.

Figure 3
Figure 3. Spectre moyen de tous les tissus avec des valeurs plus abondantes m / z marqué (a) et de l'image totale en ions (b) acquisition par DESI-MSI en mode ion positif.

Figure 4 Figure 4. Sélectionné images ions de phosphocholines clés dans les tissus du cerveau de rat acquis par DESI-MSI en mode d'ions positifs; (a) [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364; (b) [PC 36:1 + K] + , m / z 826.5558; (c) de l'image composite à m / z 798, bleu, et 826, rouge.

Espèce m / z Localisation (la matière)
[PC 32:0 + Na] + 756.5335 Gris
[PC 32:0 + K] + 772.5165 Gris
[PC 36:4 + H] + 782.5477 Blanc
[PC 34:1 + K] + 798.5364 Gris
[PC 38:4 + H] + Blanc
[PC 36:1 + K] + 826.5558 Blanc

Tableau 1. Identités de lipides clés et localisation au sein de la section du cerveau.

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Discussion

L'optimisation de la géométrie de la source de DESI est essentiel pour les expériences de MSI succès. Les multiples variables contribuant à l'alignement du système affectent directement la sensibilité et la résolution d'image. Si lors de l'optimisation, l'expérimentateur a des difficultés à obtenir signaux, nous vous recommandons d'utiliser lieu de Sharpie rouge dessiné sur la diapositive comme point de repère, la teinture, la rhodamine 6G, m / z 443, produit un signal fort dans le mode d'ions positifs et peut être utilisé pour optimisation initial. En outre, la sélection solvant pour DESI est crucial pour la sensibilité, la transmission de l'analyte et de l'ionisation dépend de l'extraction de l'analyte de la surface dans le film mince formé. 13 De nombreux solvants d'ionisation compatibles électrospray et les mélanges peuvent être utilisés pour aider à la désolvatation et le processus d'ionisation en fonction de la classe de composés d'intérêt au cours de l'analyse.

Comme mentionné précédemment, la résolution de la DESI-MS images depends principalement sur la géométrie de la source. La résolution d'image de l'ordre de 200 um est régulièrement obtenu par DESI-MSI, si cette valeur est supérieure à base de laser et / ou des méthodes d'imagerie vacuo qui peut varier de 10 à 150 um. ~ 5,31 une résolution aussi élevée que 40 um a été signalé à l'aide DESI, 24 cependant, à 200 um pour l'imagerie de routine est suffisante pour l'analyse de grandes coupes de tissus biologiques. La qualité de la silice fondue interne du capillaire de la source de DESI va également affecter la qualité et la résolution de l'image. Le diamètre interne recommandée du capillaire est de 50 um, aussi grand Identifiant capillaires produire de plus grandes pulvérisations et une grande résolution d'image. 25 Si ce capillaire n'est pas coupé carrément ou est fissurée, la pulvérisation ne sera pas conique entraînant point d'impact de forme irrégulière, de mauvaise qualité et des images reproductibles.

Non seulement la géométrie de la source d'incidence sur la résolution de DESI-MSI, il joue également un rôle important dans la sensibilitédu procédé. Par conséquent, la géométrie doit être optimisée et maintenue constante pendant toute la procédure. Si l'échantillon n'est pas plane, ou n'est pas monté parfaitement à l'horizontale, la géométrie de la source va changer, ce qui modifie la réponse et la création d'un artefact dans l'image. 23 Bien DESI-MSI est limitée aux échantillons planaires, l'imagerie 3D des tissus biologiques est faite possible grâce à l'imagerie 2D des coupes de tissus de série qui sont ensuite empilés dans une image en trois dimensions. 32 Cette approche peut également être utilisé pour d'autres méthodes de MSI, y compris SIMS, MALDI, LAESI, etc 33 images tridimensionnelles de spectrométrie de masse peuvent également être créé par la suppression progressive des couches de matériau, par des impulsions laser par exemple, et reimaging 34.

L'analyse en mode positif des tissus de cerveau de rat facilite l'imagerie réussie de phosphatidylcholine et de certains médicaments et de leurs métabolites. 18 Pour compléter cette analyse, l'imagerie en negativMode e produit un spectre avec une plus grande diversité de classes de lipides, 28,35 et peut être utilisée pour fournir une analyse approfondie des coupes de tissus. Dans les cas où plus d'une espèce de lipides peut être attribué à une valeur m / z particulier, la spectrométrie de masse en tandem peut être utilisé pour l'identification. La spectrométrie de masse en tandem est également un moyen supplémentaire de confirmation de l'identité des lipides. 35

Ambient imagerie par spectrométrie de masse par DESI a été montré pour être efficace dans l'imagerie des espèces de lipides dans les tissus du cerveau de rat. Les informations obtenues grâce à des expériences de MSI peut donner un aperçu sur les maladies associées à des niveaux altérés de phospholipides tels que la maladie d'Alzheimer, le syndrome de Down, et le diabète, entre autres. 36-38 Compte tenu de la forte abondance des lipides et leur rôle dans les processus biologiques, de nombreux systèmes biologiques existent qui bénéficieraient de l'information obtenue par l'imagerie par spectrométrie de masse. Avec de nombreuses méthodes possiblesà des échantillons biologiques d'image en utilisant la spectrométrie de masse, des méthodes d'ionisation ambiante, DESI en particulier, fournir un moyen de le faire avec réduit préparation des échantillons et une plus grande facilité d'analyse.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par l'ARRA NSF IRM Instrument Development Grant # 0923179 de FMF. Nous remercions Aqua Asberry, coordonnateur de laboratoire pour le H. Petit Institut Parker pour bioingénierie et Biosciences histologie de base, à l'aide de coupes de tissus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
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Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse
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Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

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