Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדמיה של רקמות ביולוגיות על ידי Desorption electrospray יינון המוני ספקטרומטריית

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Desorption electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (דסי-MS) היא שיטה שבאמצעותו דגימות סביבה, כולל רקמות ביולוגיות, יכולות להיות צילמו עם הכנת מדגם מינימאלית. על ידי rastering המדגם מתחת לחללית היינון, טכניקה מבוססת ספריי זה מספקת רזולוציה מרחבית מספיק כדי להבחין במאפיינים מולקולריים של עניין בתוך סעיפי רקמות.

Abstract

ספקטרומטריית מסת הדמיה (MSI) מספקת מידע מולקולרי לא ממוקד עם סגוליות הגבוהה ביותר והרזולוציה מרחבית לחקירת רקמות ביולוגיות במאות עד עשרות מיקרונים קנה מידה. כאשר היא מבוצעת בתנאי הסביבה, מדגם טרום טיפול הופך להיות מיותר, ובכך לפשט את הפרוטוקול תוך השמירה על האיכות הגבוהה של מידע שהושג. יינון electrospray desorption (דסי) הוא טכניקת MSI סביבה מבוססת ספריי המאפשרת דגימה הישירה של משטחים באוויר הפתוח, גם in vivo. כאשר בשימוש עם תוכנת שלב דגימה מבוקרת, מדגם rastered מתחת לחללית יינון דסי, ודרך מישור הזמן, מידע מ '/ z הוא מתואם עם הפריסה המרחבית המינים כימיים ". נאמנותו של פלט דסי-MSI תלויה בנטיית המקור והמיצוב ביחס למדגם השטח וכניסת ספקטרומטר מסה. בזאת, אנו בודקים כיצד להכין סעיפי רקמות לדסי אניmaging ותנאי ניסוי נוספים שמשפיעים ישירות על איכות תמונה. באופן ספציפי, אנו מתארים את הפרוטוקול להדמיה של חלקי רקמות מוח חולדה על ידי דסי-MSI.

Introduction

הדמיה לא ממוקדת על ידי ספקטרומטריית מסה מאפשרת רכישת המידע כימי ליישומי גילוי והשערה מניבים. הדמיה ממוקדת של חומר כימי בשמו של עניין, ומצד שני, יכולה להקל על רגישות וסלקטיביות מוגברת באמצעות פיתוח שיטה ספציפי. ספקטרומטריית מסת הדמיה (MSI) מתבצעת לרוב על רקמות באמצעות טכניקות יינון סביבה, כוללים יינון desorption electrospray (דסי), 3 יינון אבלציה-electrospray לייזר (LAESI), 4, MALDI, יון משנית 1 ספקטרומטריית מסה (SIMS), 2 ו 5 ונוזל מייקר צומת משטח דגימת בדיקה (LMJ-SSP). 6 בMALDI וסימס, יש דוגמאות להסרה פיזית מהדגימה, וצריכה להיות שטוחה ודק, כפי שהם ניתחו תחת ואקום גבוה. MALDI דורש ציפוי של המדגם עם ספיגת קרינת מטריצה, והוסיף נדבך נוסף ומסורבל להכנת המדגם. SIMSיש לו את הרזולוציה לרוחב הגבוהה ביותר, אך הפגזה עם חלקיקים אנרגטיים ביותר גורמת לפיצול מולקולרי נרחב. לכן, על ידי שיטות MSI הסביבה למלא נישה שבה ניתוח רך עם הכנת מדגם מינימאלית רצוי. עם זאת, נכון להיום, כל השיטות עדיין מוגבלות על ידי הדרישה של משטחי מדגם שטוחים.

דסי משתמש בספריי ממס פניאומטית בסיוע מחויב כלפי שטח המדגם לdesorb ויינן analytes. 7 מודל העבודה לdesorption ויינון לאחר מכן על ידי דסי שמכונה "טיפת מודל איסוף". 8-10 הטיפין העיקריות המופקדות הופק על ידי חללית דסי מתנגש עם פני השטח, להרטיב אותו ויוצר סרט דק שלתוכו אנליטי הוא מומס על ידי מנגנון microextraction מוצק נוזל תוצאת 8 לאחר התנגשויות טיפה בהעברת מומנטום והמראה של טיפות משניים המכילות את החומר המופק מהמשטח . 9,10 סופו של דבר, גזיוני שלב הם האמינו להיות מיוצרים באמצעות תהליכים כמו 'חדשות ארכיאולוגיות בעקבות אידוי יון, מודלים שאריות חיוב או דגמים אחרים, 11 לעומת זאת את תהליך היווצרות יון המדויק בדסי טרם יהיה בניסוי מוכח. רגישות דסי 12 היא מאוד תלויה במסיסות של אנליטי בתרסיס הממס, כdesorption מסתמך על microextraction המקומי. 13

כאשר בשימוש עם תוכנת שלב דגימה מבוקרת, המדגם נסרק unidirectionally עם נתיב קפיצה מתחת לחללית יינון דסי, ודרך מישור הזמן, מידע מ '/ z הוא מתואם עם הפריסה המרחבית המינים כימיים' (איור 1). מאז את ההוכחה הראשונה של ניסוי דסי-MSI עיקרון שדווח על ידי ואן Berkel וקרטס בשנת 2006, 14 הטכניקה התבגרה במידה ניכרת, 15 עם יישומים שדווחו בניתוח של שומנים, 3,16 מטבוליטים סמים, 17,18 diseaסמנים ביולוגיים SE, רקמות, רקמות מוח 19 3,18,20 ריאות, רקמת הכליה 18, רקמת אשך 18, 18 בלוטת יותרת הכליה, 17 צלחות כרומטוגרפיה שכבה דקות, 21 ומשטחי אצות. 22 הרזולוציה השגרתית של תמונות שהושגו על ידי דסי-MSI הוא 100-200 מיקרומטר, אשר נקבע על ידי סופו של דבר את שטח הפנים היעיל שחולצו על ידי ספריי, אבל רזולוציות נמוכות כמו 40 מיקרומטר כבר דיווחה. החלטה כזו 23-25 ​​והקלות של ניתוח הופכת דסי-MSI המתאים לניתוח המהיר ופשוט של דגימות רקמה ביולוגיות עם שטח פנים בטווח 0.5-5 ס"מ 2, המאפשר הרכישה של מידע מרחבי רב ערך כדי להבין טוב יותר את התהליכים ביולוגיים 26. כאן, כדוגמה ליישום דסי-MSI טיפוסי, אנו בודקים את הפרטים פרוצדורליים של ניהול ניסוי מוצלח הכולל הדמיה של שומנים ברקמות מוח חולדה. את שני שלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הםהכנת 27 ודסי אופטימיזציה מקור יון רקמות, כפי שיתואר להלן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. רקמת חתך

  1. חנות רקמות פלאש קפוא, כולו במקפיא -80 ° C עד מוכן לחתך.
  2. לאפשר דגימת הרקמה כדי להגיע לטמפרטורה בcryomicrotome לפני חתך (30 דקות). הגדר את הלהב וטמפרטורת מדגם ל-30 ° C.
  3. ברגע שרקמה הגיעה הטמפרטורה, טיפול בדגימה עם פינצטה, חתכה קדמי או אחורי של מוח, תלוי מה חלק של המוח הוא עניין למשטח התקנה מספיק (כלומר, אם החלק הקדמי של המוח הוא הראשונה בחשיבותו, הר אחורי של המוח על צ'אק).
    1. החל ~ מגרש 0.5 מ"ל אופטימלי חיתוך טמפרטורה (אוקטובר, רקמות-Tek, סאקורה) לצ'אק במרכז ו, באמצעות פינצטה, מחזיק במקום מדגם ב אוקטובר עד שמתמצק. ברגע שאוקטובר הוא קפוא לחלוטין, ההר צ'אק בבעל מדגם.
    2. כמות מינימאלית של אוקטובר משמשת הר המדגם העדיפה (בניגוד להרכבה את הדגימה בבלוק של אוקטובר כפי שנעשתה בדרך כלל בhisto האחרנהלים לוגיים) כדי למזער את הזיהום של המדגם. זיהום של המדגם על ידי אוקטובר הוא מזיק לדסי ותהליך הדמיה בשל דיכוי יון.
  4. סעיפי רקמות אופייניים הנדרשים למגוון ההדמיה MS בין 12-18 מיקרומטר בעובי. רקמות סעיף בעובי רצוי בתוך הטווח המומלץ. הפשירי את המתלה כל רקמה מחולק על ידי נגיעה קלה שקופיות זכוכית מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר במשך סעיף. ברגע שמדגם הוא רכוב, היזהר שלא לגעת בקטע הרקמה כפי שהוא ישנה את ההפצות הכימיות וקומפוזיציות.

הערה: אנו ממליצים הרכבה שני חלקים לכל שקופית, תוך שימוש בסעיף אחד לאופטימיזציה, והשני להדמיה. אם חלקים אינם הדמיה מיידית, שקופיות בחנות ב -80 ° C במקפיא עד שקופית תיבה מוכנים לניתוח.

  1. אם ניתוח סעיפים מאוחסנים, להסיר את השקופית מהמקפיא, פנה מייד לייבוש ואקום, ולאפשר 15-20 ~דקות להפשיר. עוזב את הדגימה בייבוש כבר יתייבש המדגם ולהפחית את יעילות דסי. אופטימיזציה של מקור יון דסי תיעשה עם דגימת רקמת פעם זה מופשר, לעומת זאת, בעניין של זמן, התקופה שבה מדגם ההפשרה משמשת כזמן אידיאלי עבור האתחול של הציוד.
    1. שימוש אצטוניטריל עם 1% חומצה אצטית כדסי הממס, להפעיל את משאבת המזרק עם קצב זרימה של 5 μl / דקה. קצב זרימה נמוך יותר יקטין את צד נקודת ההשפעה של ספריי דסי וגודל פיקסל אפקטיבי, אבל קצב זרימה גבוה יותר עשוי להיות נחוץ לרגישות מספקת. לכן שיעור הזרימה (בדרך כלל 1-5 μl / min) צריך להיות מותאם לכל יישום ואת הרגישות והרזולוציה הרצויה. להבטיח כי המזרק מכיל מספיק ממס לאופטימיזציה מלאה והדמיה בקצב זרימה נתון.
    2. ברגע שמופיע הממס נוטף מקצה המקור, מדליק את גז חנקן nebulizing עם pressurדואר של 160 psi.
    3. הפעל את אספקת החשמל במתח הגבוהה מחוברת למקור יון החלת 3,600 V.
  2. הר השקופית על הבמה התנועה ותתחיל מקור יון ו-MS אופטימיזציה

2. דסי אופטימיזציה

  1. דסי המערכת מורכבת מבדיקת מקור (ראה איור 2), מערכת מסירת ממס אלטרנטיבית מזרק ומשאבה או, חנקן דחוס, במה מדגם תרגום והר. להמשיך באופטימיזציה של קוד דסי פעם ספקטרומטר המסה כבר מכוון לטווח המסה המתאים וanalytes של עניין.
    1. אם רכיבי הקוד לא הופעלו עדיין, ראה סעיפים 1.5.1-3 לכיוונים.
    2. המשתנים שנדונו בסעיפים אלו מומלצים להדמיה של רקמות ביולוגיות. עם זאת המשתנים הללו צריכים להיות מותאמים לסוגים שונים של רקמות או מדגם. ממסים חלופיים, ספיקות, לחצים ומתחי גז nebulizing דווחו לImaging של רקמות ביולוגיות. 16-18
  2. להבטיח כי בתחילה מקור דסי לא נוגע בשקופיות הזכוכית, ואינו מכוון לכל חלק של קטע הרקמה. זה יבטיח כי הבדיקה אינה פגומה בתהליך האופטימיזציה הראשוני ולא לזהם כל חלק של שהוקם על ידי באים במגע עם דגימת הרקמה.
    1. עמדת פתיחה טובה היא עם מ"מ קצה 3 ממדגם השטח ו5 מ"מ מכניסת נימי הטרשת הנפוצה, עם החללית בזווית של 55 מעלות ביחס למשטח המדגם. הנימים פנימית של חללית דסי צריכה להרחיב ~ 1 מ"מ מעבר לנימים חיצונית. כל הפרמטרים הללו יהיו מותאמים.
  3. ממשק MS הנימים צריך זווית אוסף של ~ 15 ° ביחס לשטח המדגם להעברה אופטימלית של יונים. התאם את גובה הבמה, כך שמרחף מעל נימי MS מדגם השטח; הנימים צריך להיות <1 מ"מ מהמשטח, קרוב ככל האפשרבלי לגעת.
  4. יישר את חללית דסי בממד X ביחס לכניסת נימי הטרשת הנפוצה, כך שהם בקו ישר.
  5. התאם את עמדות y, z של דסי המקור לרגישות אופטימלית באמצעות קטע רקמה נוסף. שים לב שככל שבדיקת דסי מופנה לאזור דגימה אחת, זה יהיה סופו של הדבר desorb ויינן את כל analytes באזור זה ואות יקטן בהדרגה כזה קורה. ביצוע שלב זה במהירות האפשרית הוא חשוב.
    1. לכן, לאורך כל תהליך אופטימיזציה, מדגם צריך להיות עבר מתחת לראש ספריי כדי להבטיח שדגימה טריה להיות מנותחת, וכי כל שינוי באות הן בשל מקור אופטימיזציה, לא דלדול מדגם. עם זאת, בהתחשב בעובדה שההרכב הכימי המגוון של אזורים של הרקמה שונות, השוואה ישירה של עוצמת יונים על פני קטע הרקמה כולו אינו מדויקת לגמרי. התלמוס של המוח מספק אזור גדול בגודל סביר עםהרכב כימי עקבי יותר, אבל עדיין לא אחיד בצורה מושלמת. לחלופין, סימון אדום לנוכל, אשר מכיל את צבע rhodamine 6G ([ז] + מ '/ z 443), בשקופית הזכוכית מן המדגם נותן מענה MS חזק על ידי דסי ויכול לשמש גם לאופטימיזציה, אבל בהתחשב בצורת המדגם שונה ואנליטי, תנאים אלה עשויים עדיין לא תואמים להגדרה אידיאלית לרקמות ביולוגיות.
    2. הפרדת y מומלץ בין קצה מקור וכניסת נימים: ~ 4 מ"מ, מומלץ הפרדה בין z קצה ושטח מדגם: ~ 1.5 מ"מ. למרות שפרמטרים אלה יהיו שונים במקצת עבור כל ניסיון ההגדרה.
    3. בהתחשב בגיאומטריה והזווית של החללית, קח בחשבון שY ו-Z-עמדות ממד הם בין קשורים ביחס להעברה היעילה של טיפות המכילות ממס ואנליטי. שינוי במשתנה אחד ידרוש שינוי שלאחר מכן בשנייה כדי לשמור על אותה עמדת השפעה והתרסיסזוויות השידור שלה.
  6. התאם את המרחק את extrudes הנימים הפנימי מהנימים חיצונית של המקור לרגישות מרבי, וגודל נקודת השפעה מינימאלי. זהירות: ודא שהמתח הגבוה כבוי בעת ביצוע התאמה זו.
  7. הגיאומטריה המקור תיחשב אופטימלית כאשר האות המקסימלי הוא ציינה.
    1. המשתנים המותאמים בסעיפים 2.5-2.6 הם בין קשורים, ולכן ההתאמה של מטבע אחד לא דורשת התאמה מחדש של האחר כדי לשמור על הגיאומטריה צורך מקור-מדגם-מפרצון, או התאמה של תנאים אמורים בסעיף 1.5.1- 3.
  8. בנוסף, גוף חימום המקיף את הנימים להעברת ספקטרומטר המסה עשוי לשפר את הרגישות על ידי הקלת desolvation של טיפות הטעונות אנליטי המיוצרות בתהליך היינון. כאן אנו משתמשים בתנור חבל נכרך סביב העברת נימי נקבעו על 100 ° C.

3. Tissuדואר הדמיה

  1. במהלך תהליך ההדמיה, הדגימה עובר שלב המדגם מתחת לחללית דסי וכניסת MS נימים וכל הרכיבים האחרים להישאר נייחים. פרמטרי התנועה של השלב יש לבחור בהתבסס על גודל השפעת פלומת דסי ורגישות אופטימלית.
    1. פלומת השפעה גדולה יותר תגרום בעוצמת יון גבוהה יותר, בהתחשב בכך שהוא להיות desorbed יותר מדגם, לעומת זאת להדמיה, זה יהיה גם לגרום לגודל פיקסל גדול יותר ורזולוציה של תמונה ובכך גרועה.
  2. תרגום הבמה משמשת בניסוי זה היא הבית שנבנה ובשליטה על ידי תכנית LabVIEW המאפשרת שליטה על מהירות rastering ומרווח בין שורות לתמונה של ממדים נתון. VI בקרת תנועת הבמה השתמש בניסוי זה זמין בomnispect.bme.gatech.edu. לחלופין, מקור דסי, זמין מסחרי ובמה יכולים לשמש כמקור כזה 2D האוטומטי אומני הריסוס מProsolia Inc (אינדיאנפוליס, ארה"ב).
    1. לרקמות מוחגודל תמונה טיפוסי הוא 10 x 15 מ"מ, ובהתחשב בפרמטרים המשמשים במה התנועה, התמונה תיקח כ -3 שעות.
      1. התכנית השישי LabVIEW או תוכנות שליטה שווה ערך לתנאי הדמיה רצויים, תוך שימוש במהירות שלב סריקה של 80 מיקרומטר / שנייה, ומרווח בין שורות בין השורות של 200 מיקרומטר. בעת שימוש במקור ריסוס אומני, הפרמטרים תנועה צריכים להיות מוגדרים למהירות סריקה של 100-200 מיקרומטר / sec ומרווח בין שורות של 200 מיקרומטר. שימו לב שניתן לשנות פרמטרים אלה התנועה בהתאם למספר הפיקסלים רצויים בכל ממד והכרחי רגישות.
        1. מרווח בין שורות קטנות הוכח כדי לשפר את איכות התמונה, עם מהירות הסריקה שיש פחות השפעה. 25 עם זאת, חשוב לציין שזה לא בהכרח מצביע ורזולוציית תמונה משופרת, כפי שתלוי מאוד בנקודה השפעה גודל. מהירות סריקה איטית יותר ומרווח בין שורות קטנות יותר תהיה להגדיל באופן משמעותי את זמן ניתוח ולכן צריך להיות optimized לכל סוג של רקמה או מדגם.
      2. עם סט רכישת הרפאים MS בסריקה 1 / שנייה, והתמונה שנוצרה כפיקסל 1 / סריקה, מהירות השלב מגדירה את גודל פיקסל בממד X, בעוד שהמרווח בין השורות קובע את גודל פיקסל בממד y. למרות שגודל פיקסל של התמונה האמיתי הוא גדול יותר מזה בשל לרסס מתפשט, תנועה איטית מאפשרת זמן לdesorption וזיהוי של analytes יותר.
    2. תן נתיב ספרייה ואת שם קובץ עבור קבצי מיקום וזמן שיירשמו בתמונות בתוך VI LabVIEW.
  3. במסגרת הכנות לרכישת נתונים ספקטרלי המונית, לחשב את הזמן הכולל נדרש להדמיה. תכנית Labview בשימוש על ידי הקבוצה שלנו באופן אוטומטי מספקת ערך זה, אבל אם הוא משמש חלופת שליטת במה, חישוב זה הוא הכרחי לקבלת הגדרות איסוף נתוני MS.
    1. בעת שימוש במקור ובשלב אוטומטי ריסוס אומני, כל שורה של התמונה נרכשה כבdividual פועל. הזמן לכל הקו ומספר הקווים הדרושים לממדי גיוון אימג'ינג מחושבים באמצעות תוכנות שליטת תרסיס אומני להיות קלט לתוך תוכנת ספקטרומטר המסה.
  4. ודא שמהירות סריקת ספקטרומטר המסה היא ספקטרום 1 / שנייה, ולהגדיר את זמן רכישת המכשיר כדי להתאים את הסך כל הזמן המחושב.
    1. הגדרת מהירות סריקת רפאים לספקטרום 1 / שנייה.
    2. רוכש את הנתונים במצב פרופיל ולהבטיח כי מגוון מ '/ z הוא מתאים למינים השונים של עניין. זכור את דסי שגם מייצר analytes טעון מתרבה, כמו בESI.
    3. להגדיר זמן רכישה כדי להתאים זמן תמונה כולל שניתן על ידי LabVIEW.
  5. מקם את נקודת השפעת הריסוס בחלק העליונה השמאלי של האזור להיות צילמו.
  6. בגין רכישת נתונים MS ותנועת במה בו זמנית.
  7. עם סיום רכישת נתונים, תחזור ספקטרומטר מסה למצב מתנה.
  8. כבה את המתח גבוה ממקור דסי.
  9. הפעל Oגז חנקן FF.
  10. כבה את משאבת מזרק.

4. עיבוד תמונה

  1. נתונים ספקטרליים המוניים, בשילוב עם זמן במה ונתוני מיקום שנשמרו כקבצי טקסט באמצעות LabVIEW חייבים להיות "מקופלים" לתוך תמונת 2D correlating קואורדינטות של פיקסלים עם הספקטרום המקביל. את התמונות שהוצגו כאן עובדו באמצעות תוכנות מבוססות Matlab כי הוא זמין באופן חופשי ב: omnispect.bme.gatech.edu. אם הנתונים נרכשים באמצעות מקור ריסוס אומני, נעשתה שימוש בתוכנת המרת נתונים Firefly כדי ליצור את קוביית נתונים להדמיה תמונה בBioMAP (www.maldi-msi.org).
  2. לנתונים שהושגו בספקטרומטר מסת AccuTOF JEOL, הכרומתוגרמה נרשמה חייבת להיות מיוצאות בפורמט. CDF לניתוח נוסף.
    1. שימוש DataManager בתוך MassCenter, תחילה להמיר את הנתונים שנרכשו לנתונים centroided (כלים → להמיר את נתוני Acquistion לcentroid). לאחר מכן לייצא את הנתונים בפורמט. CDF באמצעות שילוב מקשי Ctrl + Shift + E תחשיב היחסיםגעה בכלי → יצוא.
  3. להעלות את הנתונים גולמיים. CDF המוני רפאים ואת שני קבצי הטקסט, מיקום וזמן, לאתר OmniSpect. נתוני הדמיה גחלילית-מעובדים יכולים להיות דמיינו בBioMAP.
    1. עיבוד נוסף של הנתונים, כולל ניתוח סטטיסטי על ידי פירוק לגורמי מטריקס ללא שלילי או זוממים של יון אחד של עניין יכול להתבצע ישירות באתר.
    2. לחלופין, קוביית הנתונים הגולמית ניתן לייצא לניתוח ב-Matlab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3 מציג ספקטרום נציג המתקבל מסעיף מוח חולדה שלא טופל. במצב החיובי, הספקטרום ההמוני הוא נשלט על ידי phosphatidylcholines בשל היעילות גבוהה שלהם היינון (מיוחסת לקבוצת אמוניום רבעוני הטעונה חיובי). תמונת יון הכוללת של קטע הרקמה היא גם מוצגת באיור 3, מראה אות בשפע על פני הקטע במוח כולו. שומנים עיקריים שזוהו מזוהים בטבלה מס '1 באמצעות השוואות ספרות.

הפריסה המרחבית של שומני דוגמה (איור 4) להראות כיצד השפע היחסי של מינים שונים phosphatidylcholine משתנה בין אפורה וחומר לבן של המוח. לדוגמה, [מחשב 34:1 + K] + מ '/ z 798.5364, מציג בעוצמה מוגברת בקליפת המוח הקטנה (חומר אפור), ואילו [מחשב 36:1 + K] + מ' / z 826.5558, מציג בעוצמה מוגברת ב peduncle המוח הקטן (WHIעניין טה). התמונה המורכבת המתקבלת עבור שני היונים (איור 4 ג') מדגישה את הניגוד בחלוקת שומנים על פני קטע הרקמה. ההתפלגויות המרחביות של שומנים מרכזיים אחרים במוח גם מופיעות בטבלה 1. הפצות אלה מסכימים עם מחקרים קודמים. 28-30

איור 1
איור 1. סכמטי של דסי-MSI תהליך הדמיה. דסי () משמש לניתוח השטח של רקמות, וכאשר המדגם הוא rastered בתנועה מבוקרת (ב) מתחת למקור, נתונים ספקטרליים המוניים, בעוצמה נגד מ '/ z (ג ), כפונקציה של זמן (ד) הוא רכש. מידע זה נמצא בקורלציה לאחר מכן דרך מישור הזמן עם פרמטרי התנועה כדי ליצור תמונה כימית(ה). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. סכמטי של מקור דסי.

איור 3
איור 3. קשת שלמה של רקמות ממוצעת עם ערכי m / z שופעים יותר שכותרתו () ותמונה כוללת יון (ב) נרכשה על ידי דסי-MSI במצב יון חיובי.

איור 4 איור 4. נבחר תמונות של יון phosphocholines מפתח ברקמת מוח החולדה נרכשה על ידי דסי-MSI במצב יון חיובי; (א) [מחשב 34:1 + K] + מ '/ z 798.5364, (ב) [מחשב 36:1 + K] + , מ '/ z 826.5558; (ג) תמונה מורכבת של מ' / 798 Z, כחול, ו826, אדום.

מין מ '/ z לוקליזציה (עניין)
[מחשב 32:0 + Na] + 756.5335 אפור
[מחשב 32:0 + K] + 772.5165 אפור
[מחשב 36:4 + H] + 782.5477 לבן
[מחשב 34:1 + K] + 798.5364 אפור
[מחשב 38:4 + H] + לבן
[מחשב 36:1 + K] + 826.5558 לבן

טבלת מס '1. זהויות מפתח שומנים בדם ולוקליזציה בתוך סעיף המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אופטימיזציה של הגיאומטריה מקור דסי היא קריטית עבור ניסויי MSI מוצלחים. המשתנים מרובים תורמים ליישור של מערכת משפיעים ישירות על רגישות ורזולוציה של תמונה. אם במהלך חיפוש, יש לו את הקשיים בקבלת אות הנסיין, מומלץ להשתמש בנקודת טוש אדומה מצוירת על השקופית כאמת מידה; הצבע, rhodamine 6G, מ '/ z 443, מייצר אות חזקה במצב יון החיובי וניתן להשתמש בו עבור אופטימיזציה ראשונית. בנוסף, בחירת הממס לדסי היא חיונית לרגישות, כהעברת אנליטי ויינון תלויה במיצוי של אנליטי מפני השטח אל תוך הסרט הדק נוצר. -13 יינון תואם ממסים electrospray רבים ותערובות ניתן להשתמש כדי לסייע בdesolvation ויינון תהליך בהתאם למחלקה של תרכובת של ריבית במהלך הניתוח.

כפי שהוזכר קודם לכן, ברזולוציה של דסי-MS תמונת DepeNDS בעיקר על הגיאומטריה המקור. רזולוציית תמונה בצו של 200 מיקרומטר מתקבלת באופן קבוע על ידי דסי-MSI, אם כי זה גבוה יותר מאשר לייזר מבוסס ו / או בשיטות ההדמיה החלל ריקות אשר יכול לנוע בין ~ 10-150 מיקרומטר. -40 מיקרומטר כגבוהים כ5,31 רזולוציה כבר דיווח על השימוש בדסי, 24 לעומת זאת, 200 מיקרומטר להדמיה שגרתית מספיק לצורך הניתוח של סעיפי רקמות ביולוגיים גדולים. האיכות של סיליקה התמזגו הנימים הפנימית של מקור דסי תשפיע גם על איכות תמונה ורזולוציה. הקוטר הפנימי המומלץ של הנימים הוא 50 מיקרומטר, כגדולים id נימים לייצר תרסיסים גדולים יותר ורזולוציה תמונה גדולה יותר. 25 אם זה נימים לא לחתוך ישר או סדוק, ספריי לא יהיו חרוטי וכתוצאה מנקודת השפעה בצורה לא סדיר, ירודה איכות תמונות וirreproducible.

לא רק שגיאומטרית המקור להשפיע הרזולוציה של דסי-MSI, זה גם משחק תפקיד משמעותי ברגישותשל השיטה. לכן הגיאומטריה חייבת להיות מותאמת ונשמרה קבועים לאורך כל ההליך. אם המדגם הוא לא מישוריים, או שהוא לא מקובעים בצורה מושלמת בצורה אופקית, הגיאומטריה המקור תשתנה, ובכך לשנות את התגובה ויצירת חפץ בתוך התמונה. למרות דסי 23-MSI מוגבל לדגימות מישוריים, 3D הדמיה של רקמות ביולוגיות מורכבת אפשרי באמצעות ההדמיה 2D של סעיפי רקמות סדרתיים אשר לאחר מכן נערמו לתמונה תלת ממדים. גם יכולה להיות מועסק 32 גישה זו לשיטות אחרות, כולל MSI סימס, MALDI, LAESI, וכו '33 תמונות ספקטרומטריית מסה תלת ממדיות יכולות להיות גם נוצר על ידי ההסרה ההדרגתית של שכבות של חומר, על ידי פעימות לייזר לדוגמה, וreimaging. 34

ניתוח המצב החיובי של רקמות מוח חולדה מאפשר הדמיה מוצלחת של phosphatidylcholines וכמה תרופות ומטבוליטים. -18 כדי להשלים את הניתוח הזה, הדמיה בnegativדואר מייצר מצב ספקטרום עם מגוון גדול יותר של סוגי שומנים, 28,35 ויכול לשמש כדי לספק ניתוח מקיף של חלקי הרקמות. במקרים בהם ניתן לייחס יותר ממין אחד לשומנים בדם ערך מ '/ z בפרט, בד בבד ספקטרומטריית מסה יכולה לשמש לזיהוי. טנדם ספקטרומטריית מסה משמשת גם כשיטת נוספת של אישור זהות שומנים בדם. 35

ההדמיה ספקטרומטריית מסת אמביינט ידי דסי הוכח כיעילה בהדמיה של מיני שומנים בדם ברקמת מוח חולדה. מידע שהושג באמצעות ניסויי MSI יכול לספק תובנות לגבי מחלות הקשורות לרמות שינה של פוספוליפידים כגון אלצהיימר, תסמונת דאון, וסוכרת, בין יתר. 36-38 בהתחשב בשפע הגבוה של שומנים ותפקידיהם בתהליכים ביולוגיים, מערכות ביולוגיות רבות קיימות שיפיקו תועלת מהמידע שהושג באמצעות ספקטרומטריית מסת הדמיה. עם שיטות פוטנציאליות רבותלדגימות ביולוגיות תמונה באמצעות ספקטרומטריית מסה, שיטות יינון סביבה, דסי בפרט, לספק אמצעי לעשות זאת עם הכנת מדגם מופחתת והגדיל את הקלות של ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מכשיר MRI ערה NSF מענק פיתוח # 0923179 לFMF. אנו מודים אקווה Asberry, רכזת מעבדה לח' פטי מכון פארקר Bioengineering וBiosciences היסטולוגיה הליבה, לקבלת סיוע בחתך רקמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
  3. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).
  4. Nemes, P., Laser Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).
  6. Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -N. T. Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).
  7. Takáts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science. 306, 471-473 (2004).
  8. Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).
  9. Costa, A. B., Cooks, R. G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).
  10. Costa, A. B., Graham Cooks, R. Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).
  11. Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization. Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).
  12. Kebarle, P., Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).
  13. Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 135, 731-737 (2010).
  14. Van Berkel, G. J., Kertesz, V. Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).
  15. Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview. Analyst. 135, 669-681 (2010).
  16. Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).
  17. Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 135, 28-32 (2010).
  18. Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).
  19. Eberlin, L. S., et al. Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry. Cancer Res. 72, 645-654 (2012).
  20. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).
  21. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).
  22. Lane, A. L., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).
  23. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).
  24. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).
  25. Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).
  26. Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).
  27. Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).
  28. Jackson, S. N., Wang, H. -Y. J., Woods, A. S. Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS. Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).
  29. Jackson, S. N., et al. MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue. J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).
  30. Wang, H. -Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections. Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).
  31. Wu, B., Becker, J. S. Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range. Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).
  32. Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).
  33. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier. Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).
  34. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  35. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).
  36. Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).
  37. Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain. Brain Res. 867, 9-18 (2000).
  38. Han, X., et al. Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study. Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).

Tags

Bioengineering גיליון 77 ביולוגיה מולקולרית הנדסה ביו רפואית כימיה ביוכימיה ביופיזיקה פיסיקה ביולוגיה תאית מולקולרי הדמיה ספקטרומטריית מסה טרשת נפוצה MSI יינון electrospray Desorption דסי ספקטרומטריית מסת אמביינט רקמות חתך סמן ביולוגי הדמיה

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

הדמיה של רקמות ביולוגיות על ידי Desorption electrospray יינון המוני ספקטרומטריית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter