Summary
Биосовместимые рН реагирующие наносенсоры золь-гель могут быть включены в поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA) electrospun леса. Полученные самоотчетности леса могут быть использованы для мониторинга в месте из микроокружения условиях в то время культивирования клеток на эшафот. Это выгодно, поскольку 3D сотовой конструкцией можно контролировать в реальном времени без нарушения эксперимент.
Abstract
Культивирования клеток в 3D на соответствующих строительных лесов, как полагают, лучше имитировать в естественных условиях микросреды и увеличить межклеточные взаимодействия. В результате 3D сотовой конструкцией часто может быть более актуальными для изучения молекулярных событий и межклеточные взаимодействия, чем аналогичных экспериментов, изучаемых в 2D. Чтобы создать эффективные 3D культуры с высокой жизнеспособностью клеток по всему помост Условия культивирования, такие как кислород и рН в необходимости тщательно контролировать как градиенты концентрации анализируемого вещества может существовать во всем 3D конструкции. Здесь описаны способы получения биосовместимых рН реагирующие наносенсоры золь-гель и их включение в поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA) electrospun леса вместе с их последующей подготовки к культуре клеток млекопитающих. РН реагирующие каркасы могут быть использованы в качестве инструментов для определения микроокружения рН в 3D-сотовой конструкции. Кроме того, мы подробно доставку рН реагировать nanosensors к внутриклеточной среде клеток млекопитающих, рост был поддержан electrospun лесов ПМГК. Цитоплазматический расположение рН реагирующих наносенсоры могут быть использованы для мониторинга внутриклеточного рН (PHI) во время выполнения экспериментов.
Introduction
Ключевая стратегия в тканевой инженерии является использование биосовместимых материалов для изготовления строительных лесов, чьи морфология напоминает ткань, что собирается заменить, а также способен поддерживать рост и функцию 1,2 клеток. Каркас обеспечивает механическую опору, позволяя вложение и пролиферации клеток еще позволяет миграцию клеток по всему промежутках 3D-сотовой конструкции. Леса также должны позволить для массового транспорта клеточных питательных веществ, а не препятствовать удаление метаболические отходы 3.
Электропрядения возник как перспективный метод для изготовления полимерных строительных лесов, способных поддерживать клеточную 4-6 роста. Нетканые electrospun волокна, полученные подходят для роста клеток, поскольку они часто пористыми и обеспечения взаимодействия клетка-клетка, а также миграцию клеток в течение промежутках между 3D сотовой конструкции 7. Важно контролировать жизнеспособность клеток в течение тон Период культуры и обеспечить, чтобы жизнеспособность клеток сохраняется в течение всей 3D конструкции. Например, условия культивирования, такие как кислород и рН требуют тщательного контроля, как градиенты в концентрации анализируемого вещества могут существовать в 3D конструкции. Биореакторы или перфузии системы могут быть использованы, чтобы имитировать в естественных условиях интерстициального потока и, как результат передачи увеличение питательных веществ и удаление отходов метаболизма 8. Вопрос о том, такие системы обеспечения постоянные микросреды условия могут быть решены путем оценки клеточного микроокружения в режиме реального времени.
Основные показатели микроокружение, которые могут контролироваться в режиме реального времени, включают: температуру, химический состав клеточных сред, концентрации растворенного кислорода и углекислого газа, рН и влажности. Из этих показателей, температура может быть наиболее легко контролируется с использованием в точке зондов. Методы мониторинга оставшиеся перечисленные показатели обычно вУдаление Volve аликвоты для отбора проб и, следовательно, нарушить культуры клеток и увеличить риск загрязнения. Непрерывные, методы реального времени в настоящее время изыскиваются. Современные методы мониторинга, как правило, полагаются на инструменты, которые физически исследовать сотовую конструкцию, например монитор рН или кислорода зонда. Тем не менее, эти навязчивые методы могут повредить клеточную конструкцию и нарушить текущий эксперимент. Неинвазивная мониторинг концентрации анализируемых в рамках 3D конструкции может позволить мониторинг в реальном времени различных экологических аспектов, таких как питательной истощения 9. Это позволило бы оценку питательных веществ в более глубокие регионов в структуре и определить, был ли метаболические отходы удаляются эффективно 10,11. Система, призванная решить проблему инвазии как правило, предполагает использование камеры перфузии, которая проходит культуральной среды как через сосуда для культивирования и внешних датчиков для мониторинга рН, кислорода и глюкозы 12.вновь растет интерес к разработке датчиков, которые могут быть непосредственно интегрированы в культурную судна, которые не требуют удаления аликвоты для отбора проб и как таковая будет обеспечить в мониторинге месте.
Для решения таких недостатков для на месте и неинвазивной мониторинга микроокружения условиях мы включили анализируемого отзывчивые наносенсоров в electrospun лесов для производства самоотчетности строительных лесов 13. Леса, которые действуют как устройства зондирования путем мониторинга флуоресценции активность была подготовлена заранее, где чувствительный элемент был или фактическое полимерный леса создан электропрядения или посредством использования аналита реагировать красителем, который включен в полимер перед формированием лесов 14,15 . Однако эти зондирования устройства имеют потенциал, чтобы дать ошибочные оптических выхода, вызванные возможной помех от других веществ. Использование логометрического сенсорного устройства суCH как полученные в описанном протокола имеет потенциал для устранения этих возможных негативных последствий и обеспечить специфическую реакцию с аналитом котором идет речь.
В electrospun леса, представленные здесь, были получены из синтетического сополимера поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA), выбран из-за наличия пищевых продуктов и медикаментов (FDA) утверждения, благодаря своей биоразлагаемых и биосовместимых свойств и дорожки запись поддерживать рост и функцию различных типах клеток 16-18. Подготовленные логометрический анализируемого отзывчивые наносенсоры реагируют на рН. В наносенсоры включать два флуоресцентных красителей в биосовместимого матрицы золь-гель, где один краситель, FAM является чувствительным к рН и с другой стороны, TAMRA действует в качестве внутреннего стандарта, поскольку это не реагируют на рН. Кроме того флуоресценция как FAM и TAMRA могут быть проанализированы по отдельности, поскольку они существенно не перекрывались. Определение отношение флуоресценции EMIssion обоих красителей при определенных длин волн дает ответа рН независимо от других условий окружающей среды. С собственной отчетности леса может позволить проведены повторные рН на месте и в режиме реального времени, не прерывая разработанный 3D модель. Мы показали, что эти строительные леса способны поддерживать прикрепление клеток и пролиферацию и продолжать реагировать с аналитом в вопросе. Кинетика кислой побочных продуктов в инженерных конструкций остается недостаточно изученной, и как таковой с использованием рН отзывчивые строительных лесов могло бы значительно облегчить такие исследования 19. Кроме того, использование само-отчетности лесов для тканевой инженерии представляет возможность в полной мере понять, контроля и оптимизации рост 3d модель ткани конструкций в пробирке, неинвазивно и в режиме реального времени.
РН отзывчивые наносенсоры также был доставлен с внутриклеточным среды фибробластов культивируемых на electrospun PLGA scaffolспуск. Отношение флуоресценции от красителей были использованы для контроля Пхи и по сравнению с самостоятельной отчетности лесов, включающих рН наносенсоров. Доставка наносенсоров для клеток, культивируемых в 3D-среде может позволить мониторинг концентрации анализируемого вещества глубоко внутри конструкции в неразрушающего образом. Поэтому наносенсоры может быть жизнеспособным инструментом визуализации для неразрушающего оценить поведение клеток на протяжении 3D строит позволяя долгосрочный анализ. Скрининг концентрации анализируемого вещества отдельных клеток в 3D-конструкции может гарантировать, что они получают достаточное количество питательных веществ и кислорода. Параметры процесса мониторинга может помочь в разработке стандартизированных методов для эффективного переноса массы кислорода и питательных веществ. Доставка наносенсоров с внутриклеточным окружающей среды и включения наносенсоров в полимерные лесов могут быть объединены, чтобы позволить оценку жизнеспособности клеток, а также производительность эшафот в 3D сопзructs в процессе роста тканей. Это может привести к увеличению знаний этих конструкций и прогрессировать изготовление биологически соответствующих заменителей тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Обзор
Раздел 1 описывает приготовление рН отзывчивых наносенсоров и характеристики наносенсор ответ на рН с использованием флуоресцентной спектрометрии и их размер с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Раздел 2 описывает получение electrospun полимерных каркасов и характеризация их морфологии и размера с помощью сканирующего электронного микроскопа. Раздел 2 также описывает получение внутренней отчетности лесов, которые electrospun леса с включением рН отзывчивых наносенсоров. Полученные леса самоотчеты характеризуются SEM оценить, имело ли место какие-либо морфологические изменения в electrospun волокон. Флуоресценции от само-отчетности лесов в результате объединенных наносенсоров оценивается с помощью конфокальной микроскопии.
Раздел 3 описывает культуру клеток на electrospun эшафот и само-отчетности эшафот. В леса сначала стерилизуют в preparatионный для сотового следующем культуры которых леса оцениваются для определения, влияют ли стерилизация и культура клеток флуоресценции возможность само-отчетности лесов. Протокол также описывает доставку наносенсоров для клеток, которые культивировали на electrospun лесов. Lysotracker краситель используется для того, чтобы наносенсоры не были приняты во сотовой кислых отсеков.
1. Подготовка и анализ рН Отзывчивой Наносенсоры золь-гель
1.1 Подготовка рН Отзывчивой Наносенсоры золь-гель
Примечание: Эта подготовка должна быть выполнена в вытяжной шкаф.
- Подготовка флуорофоров для использования в пределах рН наносенсоры растворением 5 - (и-6)-карбоксифлуоресцеина, сукцинимидил эфир (FAM-SE) (1,5 мг) в диметилформамиде (ДМФ) (1 мл) в круглодонной колбе и 6-carboxytetramethylrhodamine , сукцинимидил эфир (TAMRA-SE) (1,5 мг) в ДМФА (1 мл) в другом круглодонную колбу.Добавить 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) (1,5 мл) в каждую колбу и перемешивают в атмосфере сухого азота (21 ° C) в течение 24 ч в темноте т.е. обернуть образцов в фольгу.
- Добавить обоих вышеуказанных красителей (250 мкл) в смеси этанола (6 мл) и гидроксида аммония (30 мас%, 4 мл), содержащегося в круглодонную колбу и перемешивают в течение 1 часа (21 ° C).
- Медленно добавить тетраэтилортосиликата (ТЭОС) (0,5 мл) к смеси продолжают перемешивание еще в течение 2 часов. Смесь получится облачность. В наносенсоры могут быть собраны на роторном испарителе. Наносенсоры могут быть сохранены в стекл нный сосудик на 4 ° С для последующего использования.
ВНИМАНИЕ: дальнейшее обращение с наносенсоров в их сухом виде должны быть выполнены в вытяжном шкафу или в случае взвешивания их баланс должен быть заключен, например, в Weighsafe.
1.2 наносенсоров Ответ на рН
- Подготовка фосфатные буферные растворы Соренсена, начиная от рН 5.5-8.0 по Mixiнг конкретные соотношения одноосновного фосфата натрия (0,2 М) и двухосновного фосфата натрия (0,2 М) Исходные растворы. Проверьте конечного рН с помощью рН-метра. Внесите небольшие изменения в рН, используя гидроксид натрия (NaOH) (4 M) или соляной кислоты (HCl) (2 м).
- Приостановка рН наносенсоры в рН-буферов (5 мг / мл) на проведение во-первых сосуд, содержащий раствор на наносенсорные вихря в течение 3 мин, затем погружением в сосуд ультразвукового пока раствор не станет мутным (примерно 5 мин). Повторите эти действия, чтобы полностью приостановить наносенсоров в растворе.
- Поместите первое решение в оптический кюветы и использовать длины волн возбуждения 488 нм в течение 5 - (и-6)-карбоксифлуоресцеин (FAM) и 568 нм для 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). Сбор длины волн излучения в 500-530 нм для FAM и 558-580 нм для TAMRA использованием флуоресцентного спектрометра.
- Изменение решения в оптической кювете, так что рН может наблюдаться при различных значениях рН и продолжить грollecting спектры излучения.
- Рассчитать отношение максимумов излучения, полученного при каждом значении рН для получения калибровочной кривой.
1.3 СЭМ Наносенсоры
- Поместите образец на наносенсоры на углеродной покрытием электронного микроскопа заглушки и распыления слой с золотом в течение 5 мин в атмосфере аргона.
- Заметим, сканирующей электронной микроскопией (SEM). Во время визуализации регулировать рабочее расстояние, напряжение и увеличение минимизировать электронный заряд (рис. 1).
2. Подготовка и анализ PLGA строительные леса
2.1 Электропрядения ПМГК Строительные леса
- В вытяжном шкафу растворить поли (молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA) в дихлорметане (ДХМ) (20% (вес / вес)) пиридиний формиата (PF) (1% (вес / вес)). Поместите раствор в 10 мл шприц с 18 G тупым заполнения иглы и надежно нужным шприцевой насос.
- Расстояние кончик иглы 20 см от 20-см х 15 см алюминий сбор пластины.
- Прикрепите электрод из высоковольтного источника питания до кончика шприца и Земли до алюминия сбора пластины.
ВНИМАНИЕ: Следует проявлять осторожность, как высокое напряжение используется т.е. всегда в первую очередь электропитание от прежде, чем обращаться любой из электропрядения оборудования. - Доставьте решение с использованием постоянного расхода 3,5 м / ч при 12 кВ в течение 2 часов. Электропрядения используя эти условия даст глубину эшафот примерно 60 мкм.
- Оставьте на эшафот в вытяжном шкафу в течение 24 ч, чтобы позволить остаток испарения растворителя.
2.2 Электропрядения рН Отзывчивый ПМГК Строительные леса
- Подготовка строительных лесов, включающих рН реагирующие наносенсоры как описано в разделе 2.1, но с модификацией добавления наносенсоры к раствору полимера (5 мг / мл). Приостановить наносенсоров в решении PLGA при содействии ультразвуком (примерно 5 минут) до размещению в шприц 10 мл.
2.3 СЭМ PLGA строительные леса, и рН Отзывчивый Эшафот
- Поместите образец на эшафот PLGA или рН реагировать эшафот на углерода, покрытой электронного микроскопа заглушки и действуйте, как описано для SEM наносенсоров (рис. 1).
2.4 Калибровка рН Отзывчивый строительные леса
- Поместите образец рН реагировать эшафот в 35 мм пластины культуры и погрузиться в соответствующих буферных растворах.
- На конфокальной микроскопии использовать аргоновый лазер с 488 нм для возбуждения FAM и криптона лазер 568 нм для возбуждения TAMRA течение наносенсоров. Соблюдайте флуоресцентное излучение для рН отзывчивых лесов на 500-530 нм для FAM и 558-580 нм для TAMRA. (Рис. 2). Используйте последовательное сканирование, чтобы избежать коллекцию длинах волн возбуждения.
3. Культура клеток на PLGA Строительные леса и рН Отзывчивый PLGA строительные леса
ntent "> Примечание: Ниже следует проводить в клеточной культуральной шкафу.3.1 Подготовка PLGA строительные леса для сотовых культуры
- Разрежьте PLGA или рН отзывчивые каркасов PLGA в 2 см 2 шт.
- Стерилизовать строительных лесов путем облучения ультрафиолетовым (УФ) света на расстоянии 8 см в течение 15 мин с каждой стороны.
- Передача каркасов в культуральную пластину 12-луночного и поместите стальное кольцо поверх. Добавляют раствор пенициллина / стрептомицина (5% объем / объем) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в внутри и снаружи стального кольца, инкубировать в течение ночи (37 ° C, 5% CO 2). Примечание стальное кольцо было изготовлено в Университете Ноттингема и имеет следующие размеры: 2 см Внешний диаметр 1 см внутренний диаметр 1 см глубины.
- Снимите стерилизации раствор и промыть с PBS.
- Добавить питательных сред клеток к внутренней (500 мкл) и за ее пределами (500 мкл) стального кольца, место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2
- Подготовьте клеточной суспензии и выполнить подсчет клеток с использованием анализа исключения трипанового синий.
- Создание клеточной суспензии для достижения сотовый количество 1 х 10 6 клеток / мл.
- Удалить вложение изнутри и снаружи стальным кольцом.
- Заменить нагретого клеточной культуральной среде на внешней стороне стального кольца (1 м).
- Добавить 300 мкл клеточной суспензии на внутренней стороне стального кольца - рок пластина взад и вперед осторожно, чтобы распределить клетки.
- Поместите клеточной культуры пластину в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2) - привязанность клеток должно было состояться в течение 24 часов, однако по-прежнему культуру тех пор, пока эксперимент требуется - освежающий СМИ каждые 2-3 дня.
3.2 наносенсоров Доставка в клетки, культивируемые на PLGA строительные леса
- Семенной клеток на PLGA эшафот, как описано в разделе 3.1. Для этого исследования пустой ПМГК эшафот (не ContaiНин наносенсоры) был использован в связи с перекрытием флуоресценции при визуализации.
- Поместите семенами эшафот клеток в инкубатор (37 ° С, 5% СО 2) в течение 72 ч, чтобы позволить клеткам расти и мигрировать по всему эшафот до наносенсоров доставку.
- До наносенсоров доставку промыть клетки с PBS и измените носитель из стандартного питательных сред для антибиотиков и сыворотки свободных СМИ, инкубировать (37 ° С, 5% СО 2) в течение 1 часа. Примечание: стандартный культуральные среды для 3T3 клеток состоит из модифицированной среде Дульбекко Игла, дополненной фетальной телячьей сыворотки (10% (объем / объем)), L-глутамин раствора (2 мМ), пенициллин / стрептомицин (1% (объем / объем)) .
- Во время инкубационного периода подготовки наносенсор-липосом комплекс кратко ультразвуком наносенсоров (5 мг) с Optimem (50 мкл) для создания раствора А.
- Создание раствора В, добавив Lipofectamine 2000 (5 мкл) в Optimem (45 мкл), инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить решениеК раствору В, инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин с образованием раствора С, которая является наносенсор-липосома комплекс.
- Добавить раствор С (100 мкл) к клеткам и инкубируют (37 ° C, 5% CO 2) в течение 3 часов.
- Удалить клеточные высевают каркасов из инкубатора, аспирация сред и дважды промывали PBS перед добавлением PBS (1 мл), чтобы позволить визуализации живых клеток с помощью конфокальной микроскопии. Примечание: PBS был использован в данном протоколе, так что фенол красный индикатор присутствует в культуральной среде клеток не вызывает аутофлюоресценция а также потому, калибровка при различных рН может быть исполнено. Однако фенолового красного носители могут быть использованы для долгосрочного анализа клеточных культур.
- Погрузите семенами эшафот клеток в буферы различных рН и следить за реакцией из наносенсоров, связанных с клетками.
- Мониторинг Phi путем определения соотношения интенсивностей флуоресценции от FAM и TAMRA наблюдая флуоресценцию с помощью конфокальной микроскопии (FIGURe 3).
3.3 наносенсоров Расположение в клетках млекопитающих
- Инкубируйте клетки с наносенсоров, содержащих только FAM краситель, как описано в разделе 3.2 (это потому, что флуоресцентное излучение TAMRA находится в той же спектральной области как Lysotracker красный). Подготовьте эти наносенсоров, как описано в разделе 1.1, но с пропуском подготовке и добавив TAMRA.
- После периода поставки наносенсор разбавить Lysotracker Red маточного раствора до 50 нм.
- Добавить аликвоты разбавленного раствора (2 мкл) в клетках, культивируемых на PLGA строительных лесов.
- Инкубируйте клетки с Lysotracker красный в течение 1 часа (37 ° C, 5% СО 2).
- После инкубационного периода не вынуть, и промыть клетки дважды PBS (рН 7,4) до изменения массовой информации для PBS (рН 7,4) (2 мл) в ходе подготовки к просмотра с помощью конфокальной микроскопии. Примечание: фенолового красного носители могут быть использованы вместо PBS.
- Добавить ядерной пятно DraQ5 в PBS так, чтобы конечная концентрация составляет 5 мкм и инкубировать с клетками в течение 3 мин (37 ° C 5% СО 2). Это не обязательно, чтобы изменить медиа после инкубационного периода при Draq5.
- Используйте 488 нм аргонового лазера для возбуждения FAM только наносенсоры, криптона лазер 568 нм для возбуждения Lysotracker красный и 633 нм гелий / неоновый лазер для возбуждения Draq5 хромофора и наблюдать флуоресценции при 500-530 нм, 580-600 нм, 650 -750 нм соответственно (рис. 3). Используйте последовательное сканирование, чтобы избежать коллекцию длинах волн возбуждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Распределение размера подготовленных рН отзывчивых наносенсоров характеризовался помощью сканирующего электронного микроскопа, где население наносенсоров отображаемого были измерены и признаны имеют размеры нанометрового в диапазоне 240-470 нм (рис. 1А). Достижение узком и достаточно малого диаметра согласуется с использованием метода Stober подготовить наночастиц. Было обнаружено, что при использовании основной среды с рН в процессе синтеза наночастиц, т.е. наночастицы получают, используя способ Stober, позволяет хороший контроль размеров, тогда как препарат с использованием кислых условий производит широкий дисперсии в размера частиц. Представительства SEM микрофотографии electrospun волокон ПМГК изготовленных с использованием описанных методов показаны на рисунке 1b демонстрируя, что произведено ПМГК леса состоит из нетканых волокон отображения минимальное бисером или поломки, где волокна имеют размеры нанометрового. Фиг.1С фиг.1В, Микрофотографии РЭМ свидетельствуют о наносенсор ассоциации на поверхности волокон однако они могут также быть включены в эшафот волокон, деградация исследования этих эшафот / наносенсор лесов может осуществляться в сочетании с SEM и / или конфокальной микроскопии для определения, если это влияет на производительность наносенсоров.
Возможность из наносенсоров, чтобы удержать свою оптическую активность следующие включения в волокнах ПМГК была проверена путем изучения строительных лесов самостоятельно отчетности с использованием конфокальной микроскопии. Сохранение способности остаются оптически и химически активными, когда включены в каркасных волокон может позволить концентраций аналита, подлежащих мониторингу. Флуоресценции, испускаемой из наносенсоры показали, что наносенсоры гetained их оптическую активность и связаны с эшафота волокон. Флуоресценции, испускаемой из красителей FAM (зеленый) и TAMRA (красный) включены в рН реагирующих наносенсоры показано на фиг.2А и 2В соответственно. Это положительный результат, что делает возможным для концентрации аналита, подлежащих мониторингу на месте. Это также первый случай, когда оптически активные логометрических наносенсоры были включены в ПМГК лесов волокон с использованием процесса электропрядения. Подтвердив, что наносенсоры могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии следующие включения в ПМГК волокон, ответ наносенсор к изменениям в концентрации анализируемого вещества была проверена. Погружение на эшафот в буферы различной рН привело к изменению интенсивности флуоресценции от FAM красителя в то время как флуоресценции, испускаемой эталонного красителя TAMRA не заметно измениться. Отношение интенсивности флуоресценции обоих красителей можно использовать, чтобы побудитьUce калибровочной кривой, как показано на рисунке 2C. Калибровочная кривая для наносенсоров оценивается в покое и при введении в electrospun PLGA эшафот сравнима и показывает, что наносенсоры сохраняют свою оптическую активность следующие включения в само-отчетности лесов. Способность самостоятельной отчетности строительных лесов обратимо реагировать на различных значениях рН оценивали путем поочередного погружения каркас в буферы с рН от 5,5 до 7,5. Обратимость было установлено, что очень хорошо, как показано на рисунке 2D, где по сообщениям участников леса может ответить на многочисленные циклических изменений в рН. Долгосрочные исследования не выполнялась для оценки эффекта деградации PLGA на наносенсор регистрации; считается, что поскольку наносенсоры обеспечить логометрические ответ количество наносенсоров присутствующих не повлияет на результат.
Исследуемого вещества, реагирующие наносенсоры были доставлены использовании liposomаль трансфекции агент с внутриклеточным среде 3T3 фибробластов, рост которых поддержали пустых лесов ПМГК. Конфокальной микроскопии изображения 3Т3 фибробластов культивируемых на пустых лесов PLGA показывают, что наносенсоры связаны с фибробластов с флуоресценции, наблюдаемых с FAM и TAMRA, показанном на фиг.3А и В соответственно. Наложение флуоресценции от этих каналов показывает, что флуоресценция из двух красителей совместно локализованы, предполагая, что красители остались в ловушке внутри биосовместимого матрицы Наносенсоры "(как изображено на желтой флуоресценции в фиг.3С). В наносенсоры, как считается, в цитоплазме 3T3 фибробласты и не содержащихся в кислых отсеков о чем свидетельствует отсутствие со-локализованной флуоресценции FAM только наносенсоры и Lysotracker Красный краситель изображен на рисунке 3D. Интенсивность флуоресценции рН отзывчивых наносенсоров доставитьред в 3Т3 фибробластов контролировали в то время как клетки подвергали изменения рН результаты которого показаны на рисунке 3E. График производства показывает, что клетки, культивируемые на electrospun PLGA эшафот сохранили Phi в диапазоне 6,8-7,0.
Рисунок 1. SEM микрофотографии наносенсоров, ПМГК волокон и внутренней отчетности лесов. (А) рН отзывчивые наносенсоры золь-гель, показывающие размеру частицы сферической нанометровых (B) ПМГК electrospun нетканые волокна, где волокна морфологии регулярно с минимальным бисером и поломок (C) рН отзывчивые строительных лесов самоотчеты где наносенсоры можно наблюдать быть торчащий из PLGA еще остается волокно морфология сравнима с контрольными PLGA волокон, не содержащих наночастицыensors. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Конфокальной микроскопии образы рН отзывчивых лесов самостоятельно отчетности, где флуоресценции можно наблюдать из наносенсоров, связанных с лесов волокон ПМГК. (А) FAM (зеленый) рН реагировать на красителях и (Б) TAMRA (красный) ссылка краситель. (С) калибровки графики рН отзывчивых наносенсоров золь-гель и рН отзывчивых лесов demonstСкорость, что оптическая и химическая реакция из наносенсоров не пострадал, когда включены в эшафот волокон ПМГК. (D) Обратимость самостоятельной отчетности эшафот проводят погружением на эшафот в альтернативных буферных растворах рН 5,5 и рН 7,5. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Конфокальной микроскопии изображения клеточных интернализованных наносенсоров и графиков рН и Phi ответ. Флуоресценции от интернализированного наносенсоров (А) FAM (зеленый) (В) TAMRA (красный) (С) совместная локализация флуоресценции от FAM и TAMRA (желтый) ( D) FAM только наносенсоры (зеленый) доставлен 3Т3 фибробластов культурыг на PLGA эшафот с Draq5 (пурпурный) маркировки ядра и Lysotracker Красной (красный) маркировки лизосом. Fluoresence из FAM и Lysotracker красный не колокализуются поэтому демонстрируя, что маловероятно, что наносенсоры были усвоены в клеточные кислых отсеков измерения (Е) Фи взяты из наносенсоров, доставленных 3T3 фибробластов культивируемых на пустой PLGA эшафот по сравнению с калибровкой рН из рН чувствительного помост без культуре клеток. Это также показывает, что выполняется измерения рН с помощью интернализованные наносенсоры не кислой, как клетки, культивируемые на electrospun PLGA эшафот сохранили Phi в диапазоне 6,8-7,0. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тканевая инженерия стремится создать биологические заменители, которые могут быть использованы как в естественных условиях, как в пробирке моделей тканей и в заместительной терапии ткани для ремонта, замены, поддерживать или улучшать функцию определенной ткани или органа. Синтетические заменители были использованы в течение многих лет, чтобы заменить или отремонтировать помощь тканей, но они часто не из-за плохой интеграции с тканями организма и / или инфекции, которая в конечном итоге приводит к отказу или дальнейшей ревизионной операции. Создание живой ткани в лаборатории до имплантации может рассмотреть вопрос о достижении полной интеграции и снизить потребность в ревизионной операции. Тем не менее, для этой цели не раскрытым необходимости распространения в пробирке и манипуляции клеток в 3D-конструкций следует сочетать с соответствующей физической подготовки ткани в пробирке. Это может быть достигнуто несколькими способами одна из которых продолжать исследования в фундаментальной биологииучастие, но и исследовать вопросы инженерные и производственные, связанные с производством синтетических заменителей. Именно этот последний вопрос, что описанный протокол направлен на содействие.
Предполагаемое использование описанных PLGA строительных лесов является создание временной поддержки в клетках млекопитающих, чтобы помочь их рост в биологически соответствующей структуры. Включение аналита, реагирующих наносенсоры в каркасах PLGA может позволить локальные концентрации аналита, подлежащих мониторингу на протяжении 3D-конструкции в процессе роста тканей. Использование рН отзывчивых лесов может позволить определить, соответствует ли кислой побочных продуктов, образующихся в эшафот деградирует и клетки растут в настоящее время эффективно удаляется изнутри 3D конструкции. Это шаг на пути к решению отсутствие в настоящее время мониторинга и контроля в пробирке процессов регенерации тканей процесса. Использование лесов, которые сами зондирования устройств может позволить вСиту, оценка микросреды в режиме реального времени. Мониторинг конструктную микросреду, не повреждая ткани имеет важное значение и позволит мониторинг процесса на всех этапах производства тканей.
Способность производства рН реагирующей помост, чтобы сообщить местную концентрацию анализируемого вещества оценивали путем мониторинга выходного сигнала флуоресценции от наносенсоры с использованием конфокальной микроскопии. Калибровка эксперимент проводили для рН чувствительного строительных лесов и доказал, что сопоставимо с рН реагирующих наносенсоры не включены в PLGA волокон. Способность продуцировать калибровочной кривой показывает, что наносенсоры оставаться реагировать на изменения рН при введении в полимерную строительные леса, а также, что процесс стерилизации каркасов не вызывало отрицательных последствий для чувствительного способности рН наносенсоры. Кроме того, наносенсоры были доставлены в внутриклеточного среды клеток, культивируемых на ПМГК лесов порогае клеточный ответ на изменения в PHI может контролироваться. Отношение интенсивности флуоресценции от FAM и TAMRA были использованы для контроля Пхи и по сравнению с рН реагировать эшафот, предполагая, что фибробласты 3Т3 сохранили Phi в диапазоне рН 6.8-7. Инкубация 3Т3 фибробласты, трансфецированные наносенсоры с ядерным красителем Draq5 показали, что большинство клеток, связанных наносенсоры не были расположены в ядерной области. Наносенсоров расположение, кажется, не быть в кислых отсеков, таких как эндосомах или лизосом, как это определено путем инкубации наносенсоров трансфицированную 3T3 фибробласты с Lysotracker красный, где совместная локализация FAM и Lysotracker Red бы быть изображен желтый пикселей в конфокальных изображений. Дальнейшие исследования, такие как анализ по просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и идентификации биологических маркеров для интернализации путей может убедиться в этом дальше. Кроме того, долгосрочные исследования, такие как временным разрешением конфокальной микроскопииможет определить долгосрочную судьбу наносенсоров внутри клеток, культивируемых на само-отчетности лесов. Если наносенсоры должны были быть доставлены в других типах клеток, то их расположение должны быть определены в результате не может быть такой же, как показано здесь.
Использование внутренней отчетности лесов имеют потенциал для неинвазивного мониторинга микросреды условий в ткани инженерии конструкций. Имея возможность выполнять измерения на месте в может позволить оптимизировать рост 3D ткани конструкций в пробирке неинвазивно и в режиме реального времени. Цитоплазматический расположение рН реагирующих наносенсоры могут быть использованы для мониторинга PHI во время выполнения экспериментов. В наносенсоры доставлены внутренней среды клетки или самостоятельно отчетности лесов и могут быть использованы в статических или динамических систем культивирования тканей и может привести к определению условий культивирования, необходимые для оптимального роста тканей инженерии конструкций впробирке. Дальнейшее развитие может привести к он-лайн системе, которые действуют на истощение питательных веществ обеспечения бесперебойное снабжение питательными веществами и кислородом всей конструкции, в конечном счете, дает хорошо воспроизводимый метод для культуры ткани конструкций.
Описанные протоколы приготовили каркасов с размерами, пригодных для обеспечения визуализации с использованием конфокальной микроскопии однако, чтобы позволить большую 3D конструкций для включения в образ возбуждение многофотонной может потребоваться, чтобы позволить изображений в глубоких конструкций. Оптический оборудование, используемое, например, микроскопа линзы должны быть выбраны для определения оптимального рабочего расстояния для линзы и размеры конструкции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Финансирование из BBSRC любезно признал (номер гранта BB H011293 / 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | 32221 | |
| Anhydrous dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547 | |
| Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution | Alfa Aesar | 35574 | diluted to 30% (v/v) with pure water |
| TEOS | Sigma | 13190-3 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma | A3648 | |
| 5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE) | Invitrogen | C1311 | |
| 6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE) | Invitrogen | C1171 | |
| Sodium phosphate monobasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (0.2 M) | Sigma Aldrich | S-0876 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | T4174 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| FBS | Source Bioscience | Batch-213-101992 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Optimem | Invitrogen | 11058-021 | |
| LysoTracker Red | Invitrogen | L-7528 | |
| Draq5 | Biostatus Ltd | DR50050 | |
| Nitrogen gas | BOC | ||
| DCM | Sigma Aldrich | 320269 | |
| TFA | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Confocal microscope | Leica TCS-SP | equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens | |
| UV light | UVLS28 UVP, USA | ||
| Stirrer plate | SB161-3 Jencons-PLS | ||
| pH meter | Jenway model 3510 | ||
| Rotary Evaporator | Buchi Rotary Evaporator R200 | ||
| Centrifuge (nanosensors) | Hermle Z300 | ||
| Centrifuge (cell culture) | Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo | ||
| Vortex | Whirlimixer Fisherbrand | ||
| Ultrasonicator | FB11021 Fisherbrand | ||
| Aluminum sheet | Nottingham University | ||
| 35mm cell culture plate | Iwaki | 3000035 | |
| 10 ml syringe | Becton Dickenson | ||
| 3T3 Fibroblast cells | European Collection of Cell Cultures | ||
| PLGA | Lakeshore Biomaterials | 7525 DLG 7E | |
| Pyridinium formate | Sigma Aldrich | P8535 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 |
References
- Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold. Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).
- Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells. Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).
- Li, D., Xia, Y. N.
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review. Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).
- Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system. Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).
- Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review. Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).
- Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. Enabling tools for tissue engineering. Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).
- You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres. Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).
- Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture. Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).
- Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).
- Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering. Analytical Methods. 5 (1), (2013).
- Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors. Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).
- Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering. Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).
- Blackwood, K. A., McKean, R., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).
- Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes. Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).
- Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis. Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).
