Summary
המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו.
Abstract
מערכת מודל תרבית תאים, אם לחקות קרוב של תנאים סביבתיים מארח, יכול לשמש כאלטרנטיבה זולה, לשחזור ובקלות למניפולציה למערכות מודל חיה ללימוד צעד ספציפי של זיהום חיידקים פתוגנים. שורת תאי monocytic אדם THP-1, אשר, על טיפול אסתר phorbol, הוא מובחן למקרופאגים, כבר בעבר נעשתה שימוש כדי ללמוד אסטרטגיות ארסיות רבים פתוגנים תאיים כגון שחפת Mycobacterium. כאן, אנו דנים בפרוטוקול לחוקק במבחנה מודל תרבית תאים מערכת באמצעות THP-1 מקרופאגים להתוות את האינטראקציה של שמרי הפתוגן אנושי אופורטוניסטי קנדידה glabrata עם תאי phagocytic המארח. מערכת מודל זה היא פשוטה, מהיר, נוח למסכי מוטציה תפוקה גבוהה, ואינה דורשת ציוד מתוחכם. ניסוי זיהום מקרופאג טיפוסי THP-1 לוקח כ 24 שעות עם 24-48 שעות נוספות כדי לאפשר תאיים התאושששמרים לגדול על המצע עשיר למושבה להרכיב ניתוח כדאיות מבוסס יחידה. כמו במבחנה מערכות מודל אחרות, מגבלה אפשרית של גישה זו היא קושי בחיוץ התוצאות שהתקבלו למעגלי תא חיסון מורכבים ביותר קיימים במארח האנושי. אולם, למרות זאת, בפרוטוקול הנוכחי הוא מאוד שימושי כדי להבהיר את האסטרטגיות שהפתוגן פטרייתי עשוי להעסיק להתחמק / לנטרל תגובת מיקרוביאלית ולשרוד, להתאים, ולהתרבות בסביבה התזונתית ירודה של תאים חיסוניים מארחים.
Introduction
מיני קנדידה הם הגורם המוביל לזיהומים פטרייתיים פולשניים מסכנות חיים בחולי מדוכאי חיסון 1. קנדידה glabrata, הפתוגן nosocomial מתעוררים, הוא שני או שלישיים מבודד בתדירות הגבוהה ביותר מיני קנדידה מחולי טיפול נמרץ בהתאם למיקום הגיאוגרפי 1-3. פילוגנטית, ג glabrata, שמרי ניצנים הפלואידים, קשור באופן הדוק יותר לSaccharomyces cerevisiae מאשר spp קנדידה פתוגניים אינם שמרי מודל פתוגניים. כולל ג אלביקנס 4. עולה בקנה אחד עם זו, ג glabrata חסר כמה תכונות ארסיות פטרייתי מרכזיות, כולל הזדווגות, פעילות מפרקי חלבונים מופרשת ופלסטיות המורפולוגית 4-5.
למרות שג glabrata אינו טופס העובש, הוא יכול לשרוד ולשכפל במקרופאגים העכבריים והאנושיים 6-8 טוען כי היא פיתחה מנגנוני פתוגנזה ייחודיים. מידע מוגבל זמין על האסטרטגיות שג glabrata מעסיק לשרוד סביבת מקרופאג תאית תזונתית ירודה ולנטרל חמצוני ותגובות מארח nonoxidative רכובים על ידי תאים חיסוניים מארח 5. מערכת מודל מקרופאג רלוונטי היא תנאי הכרחי כדי להתוות את האינטראקציה של ג glabrata עם תאי phagocytic מארח באמצעות גישות הגנומי וproteomic פונקציונליים. תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) ומקרופאגים עצם שמקורם במח (BMDMs) ממקור אנושי ועכברי, בהתאמה, קודם לכן שימשו ללמוד את האינטראקציה של ג glabrata עם תאים חיסוניים מארח 7,9. עם זאת, קושי בהשגת PBMCs וBMDMs, תוחלת שלהם מוגבלת החיים ווריאציה מקומית בין תורמי יונקים שונים להגביל את הניצול של תאים אלה מערכות מודל צדדי כ.
כאן, אנו מתארים שיטה להקמתה של מערכת במבחנה ללמוד intracellular התנהגות של ג תאי glabrata במקרופאגים נגזרו משורת תאי monocytic אדם THP-1. המטרה הכללית של פרוטוקול זה הייתה לחוקק מערכת מודל פשוטה, זולה, מהירה, ושחזור תרבית תאים שניתן להשפיע בקלות ללמוד היבטים שונים של האינטראקציה הפתוגן מארח פטרייתי.
THP-1 תאים ששמשו בעבר לפענח את התגובה החיסונית המארחת נגד מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות ו10-12. תאי THP-1 monocytic קלים לשמור ויכולים להיות מובחן, על טיפול אסתר phorbol, למקרופאגים אשר לחקות מקרופאגים נגזרות מונוציטים של אדם ומבטאים את סמני מקרופאג מתאימים 13. היתרונות העיקריים של מערכת מודל מקרופאג THP-1 הם קלות השימוש וחוסר דרישת ציוד מתוחכמת.
הפרוטוקול המובא כאן הוא להתאמה בקלות ללמוד את האינטראקציה של פתוגנים פטרייתי אדם אחרים עם הוזt תאים חיסוניים. ההליך הנוכחי גם יכול להיות מועסק על מנת לזהות גורמים ארסי לפתוגן של עניין באמצעות מסכי מוטציה תפוקה גבוהה. הוכחה של רעיון זה באה לידי ביטוי על ידי השימוש המוצלח של מערכת מודל התרבות THP-1 לזהות סט של 56 גנים הנדרשים להישרדותו של ג glabrata במקרופאגים אדם 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מומלץ לבצע ג ניסויי זיהום glabrata במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2).
- הכנת monolayer מקרופאג THP-1.
- הכנת ג השעיה תא glabrata.
- זיהום של מקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata.
- מדידה של קצב phagocytosis ושכפול תאיים באמצעות assay יחידת המושבה להרכיב.
- ניטור של שכפול תאיים באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה.
1. הכנת THP-1 Macrophage חד שכבתי
- THP-1 הוא קו סלולרי monocytic אדם נגזר מהדם ההיקפי של ילד זכר 1 בן סובל מלוקמיה חריפה monocytic 14. THP-1, שורת תאי השעיה, נשמר באופן שיגרתי על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidified במדיום תרבות RPMI-1640 תוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי). טיפול עם phorbol 12 myristate 13 יצטטו (PMA, אסתר phorbol) תוצאות בבידול מסוף של תאי monocytic THP-1 למקרופאגים. חשוב מכך, טיפול PMA אינו משפיע על כדאיות תא ותאים מובחנים לא להתחלק.
- זרע כ 1.5 x 10 6 מונוציטים THP-1 ב100 תרבות מנות מ"מ RPMI-1640 בינוני מלא (מדיום RPMI-1640 תוספת סרום 10%, 2 מ"מ גלוטמין ו 1x אנטיביוטיקה; 10 מיליליטר / צלחת) ולתת לתאים לגדול ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 2 ימים.
- ברגע שTHP-1 תאים הגיעו צפיפות של 8 x 10 5 תאים / מיליליטר, להעביר את המנה התרבות לזרימה למינרית תרבית תאים ובעדינות לערבל אותו לresuspend תאים התיישבו.
- פיפטה ההשעיה התא החוצה, מקום לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 1,000 סל"ד (130 XG) במשך 4 דקות. בטל supernatant ו להשעות תא גלולה THP-1 ב 5 מיליליטר בינוני טרי, prewarmed, RPMI-1640 מלאה.
- ספירת תאים עם hemocytometer ולדלל את celהשעיה ליטר לצפיפות סופית של 10 6 תאים / מיליליטר עם מדיום להשלים RPMI-1640 prewarmed
- הוסף 1 μl של 160 מניית מ"מ PMA (פתרון 13 יצטטו 12 Myristate phorbol הערוך sulfoxide דימתיל) ל10 מיליליטר השעיה תא THP-1 (ריכוז סופי 16 ננומטר) ומערבבים היטב. לוותר על ההשעיה תא 1 מיליליטר לבאר כל צלחת תרבית רקמת 24 היטב דגירה צלחת בחממה נשמרה על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעות 12.
- הסר בינוני ישן, להוסיף 1 מיליליטר prewarmed RPMI-1640 בינוני מלאה ומאפשר לתאים להתאושש במשך שעות 12 על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא שתאי monocytic THP-1 הסגלגל בהשעיה כבר מובחנים למקרופאגים שטוחים, ציר בצורה והחסידה. תאים מובחנים אלה הם עכשיו מוכנים לנהל ג מחקרי זיהום glabrata.
2. הכנת ג glabrata & #תרחיף תא; 160
Bg2 זן ג glabrata פראי מהסוג ישמש להדביק THP-1 מקרופאגים. ג תאי glabrata נמצאים באופן שגרתי בתרבית YPD הנוזלי (תמצית שמרים (1%)-peptone (2%), דקסטרוז (2%)) בינוני. בינוני YPD מוצק הוא הוכן על ידי הוספה אגר 2% לפני מעוקר בינוני.
- כדי להכין את התרבות של ג glabrata, לבחור מושבה את אחת מהצלחת אגר עם לולאה סטריליים, חד פעמים ולחסן ל10 מיליליטר מדיום נוזלי YPD ו דגירה של 14-16 שעה עם הרעד (200 סל"ד) ב30 ° C.
- צנטריפוגה תרבות זו (1 מיליליטר) בשעה 4,000 סל"ד (1,800 XG) במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בראש טבלה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS (פוספט שנאגרו מלוח, pH 7.4) סטרילי ולהשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר PBS.
- מדוד OD 600 של ג ההשעיה glabrata תא ולדלל עם נפח מתאים של PBS סטרילי כדי לקבל צפיפות של 2 x 10 מיליליטר / 6 תאים (OD 600= 0.1). לחלופין, צפיפות התאים הרצויה יכולה להיות מושגת על ידי ספירת תאי שמרים באמצעות hemocytometer.
3. זיהום של המקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata
- הוסף 50 ג μl השעיה תא glabrata לTHP-1 מקרופאגים (10 6 תאי זרע לכל טוב של צלחת תרבות 24 גם) כדי להשיג משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של 0.1 דגירה צלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2.
- כדי לקבוע שמרי ספירות קיימא, לדלל 50 ג μl תא השעיה פי 100 glabrata בPBS סטרילי וצלחת על מצע מוצק YPD 100 μl. דגירה צלחות ב30 מעלות צלזיוס ולספור ידני את מספר מושבות שמרים המופיעות אחרי 1-2 ימים. מספרים אלה יהיו, מכאן ואילך, יופנו כג 0 שעות glabrata CFUs (מושבה להרכיב יחידות).
- לאחר coculturing 2 שעות של תאי THP-1 עם ג תאי glabrata, תרבות בינונית שנזרקו על ידי היפוך צלחת תרבית רקמת 24 גם iמאגר na ולשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS סטרילי prewarmed להסיר ג תאי nonphagocytosed תאי glabrata. שטיפות עדינות עם PBS הן חיוניים כדי להשיג את ההסרה של כל השמרים תאיים שלמה בלי לגרום נזק לmonolayer מקרופאג THP-1.
4. מדידה של Phagocytosis דרג ותאי שכפול באמצעות מושבה להרכיב יחידת Assay
- Lyse ג glabrata נגוע THP-1 מקרופאגים ב 1 מיליליטר סטרילי H 2 O למשך 2 דקות, לגרד בעדינות כדי להסיר את פסולת מקרופאג מהבאר ולאסוף lysate תא בצינור microcentrifuge. אימות מיקרוסקופית של תמוגה מקרופאג המוחלטת היא מרכזית להתאוששות של כל השמרים הפנימו.
- הכן דילול פי 100 של lysate ב PBS סטרילי, צלחת על מצע מוצק YPD 100 μl ודגירת צלחות ב30 ° C.
- אחרי 1-2 ימים, לספור ידני את מספר ג glabrata מושבות ap כיpeared על מדיום YPD, להכפיל בגורם לדילול (2 CFUs שעה) ולחשב את שיעור phagocytosis המתייחס לאחוזים של ג תאי glabrata המעובדים על ידי THP-1 מקרופאגים לאחר coincubation שעה 2 תוך שימוש בנוסחה הבאה.
phagocytosis% = [(CFUs ב2 h) / (CFUs ב 0 h)] X 100 - כדי למדוד את קצב השכפול תאיים של ג תאי glabrata בTHP-1 מקרופאגים, לאסוף שמרים תאיים בזמן שונה נקודות לפרסם כלומר זיהום. 4, 6, 8, 10, 12, ו24 שעות, על ידי חזרה על שלבי 3.3-4.3.
- לחשב הישרדות / שכפול של פי ג תאי glabrata בTHP-1 מקרופאגים על ידי חלוקת סך CFUs בכל נקודת זמן נתון עם אלה בשעה 2 (שמרי phagocytosed).
5. ניטור של תאיים שכפול באמצעות Confocal אסאה סריקה מיקרוסקופית
- ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 1, זרע 5 x 10 5 תאים THP-1 שטופל ב-PMA בכל טוב של שתי שקופיות קאמריות ארבעה היטב ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך שעות 12.
- החלף בינוני ישן עם מדיום מלא prewarmed RPMI-1640 ולאפשר לתאים להתאושש מטיפול PMA עבור שעות 12.
- הכן את ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) מתויג ג ההשעיה תא glabrata כפי שתואר בסעיף 2 ולהדביק לTHP-1 מקרופאגים למשרד הפנים של 1. אם ג glabrata זנים להביע GFP אינם זמינים, תאי שמרים שכותרתו עם FITC (isothiocyanate והעמסת) ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר המתרחשים בתחילת לפרסם דהינו זיהום. שיעור phagocytosis והתבגרות phagolysosomal בשעה 2.
- דגירה שקופיות במשך שעה 2 ב37 ° C עם 5% CO 2, להפוך אותם בקפידה כדי לבטל בינוני ולשטוף 3x עם סטרילי, prewarmed PBS.
- הוסף 500 μl prewarmed RPMI-1640 Medi מלאאממ לכל תא של שקופית אחת ודגירה אותו על 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 22 שעה.
- כדי לתקן 2 ג hr מקרופאגים THP-1-נגועים glabrata, להוסיף 500 μl של פורמלדהיד .3.7% (שהוכן PBS) לכל תא של שקופית אחרת ודגירה אותו בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות בחושך.
- לשטוף להחליק שלוש פעמים עם PBS, להוסיף 500 μl Triton-X (0.7%), ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך.
- 3x שקופיות לשטוף עם PBS, להסיר קאמרי משקופית התרבות ואוויר לייבש אותו ל3-5 דקות בחושך.
- הר בזהירות coverslip באמצעות מדיום Vectashield הרכבה המכיל DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) בשקופית הימנעות היווצרות בועה. להסיר בעדינות את הנוזל העודף עם Kimwipe ולאטום קצות coverslip עם לכה לציפורניים. שקופיות חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- חזור על שלבים 5.4 ו5.6-5.9 לעבד THP-1 תאים 24 הודעה hr זיהום.
- תאי תמונה באמצעות confo סריקת לייזרמיקרוסקופ קאל (אובייקטיבי 60x נפט טבילה, עירור ב 405 ננומטר ו488 ננומטר לDAPI וכתם ה-GFP, בהתאמה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהום ניתוחים של מקרופאגים THP-1 שטופל ב-PMA עם ג תאים מהסוג בר glabrata (WT) גילו כי תאי WT היו phagocytosed ידי מקרופאגים בשיעור של 55-65% אחרי 2 coincubation שעה. יתר על כן, ג תאי glabrata היו מסוגלים להתנגד להריגתו על ידי THP-1 מקרופאגים ועברו 5 מתונות - לגידול פי 7 בCFUs לאחר 24 שעות של coculturing עם THP-1 מקרופאגים 8. שכפול תאיים של תאים מסוג בר, הפכו עם פלסמיד-GFP-לבטא, בTHP-1 מקרופאגים גם אושר בידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal בי את מספר תאי שמרים תאיים למקרופאג THP-1 עלה מ אחד או שתיים כדי 7-12 על פני תקופה של 24 שעות (איור 1).
איור 1. תמונת confocal של פורמלדהיד הקבוע, ג GFP-tagged מקרופאגים THP-1-הנגועים glabrata מוצגות שכפול תאיים עם THP-1 תאים מחסה 1-2 5-8 ושמרים בשעה 2 ו24 שעות, בהתאמה. גרעינים מגואלות DAPI. בר = 10 מיקרומטר.
איור 2. ייצוג סכמטי של ג מסך glabrata מוטציה ספרייה לפרופילי הישרדות שינו בTHP-1 מקרופאגים באמצעות mutagenesis מתויג חתימת גישה (STM). אדום ועיגולים ירוקים על קרומי הכלאה לציין מופחתים וייצוג גבוה של התגים, בהתאמה, בדגימות תפוקה בהשוואה לדגימות קלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת חיסון מולדת משחקת תפקיד חשוב בשליטה על זיהומים פטרייתיים אופורטוניסטיים. המקרופאגים תורמים להגנה נגד פטריות על ידי בליעה והרס של הפתוגן פטרייתי. לפיכך, הבהרה של גורמים הנדרשים להישרדות ו / או מנטרל את הפונקציות מיקרוביאלית של מקרופאגים תקדם את ההבנה של אסטרטגיות ארסיות פטרייתי שלנו. בהקשר זה, הקמנו מערכת מודל תרבית תאים במבחנה באמצעות מקרופאגים הנגזרים משורת תאי monocytic אדם THP-1 כדי לאפיין את האינטראקציה של הפתוגן פטרייה אופורטוניסטי אדם ג glabrata עם תאי phagocytic מארחים. למרות שמערכת מודל מקרופאג זה THP-1 בהצלחה נעשתה שימוש כדי לזהות ג מוטציות glabrata בהישרדות מופחתת שמוצגת ארסיות מוחלשת במודל עכברי של קנדידה המערכתית 8, הגבלה סבירה של מערכת זו היא ההקשר המבודד שלה, ולכן תוצאות שהתקבלו אינך רשאיתמיד יהיה ישים למערכת המארחת של יונקים המורכבת חיסון. יתר על כן, מערכת זו, בניגוד לשיטות תא הדמיה לחיות, אין ביכולתה לתת דין וחשבון לתאי שמרים, כי הם גם לא נלקחו על ידי THP1-מקרופאגים או נהרגו במהלך phagocytosis.
משמעותו של פרוטוקול זה טמונה בפשטות, שחזור ויכולת ההרחבה שלה. השיטה וניתן לשנותם עד לצלחת 96 היטב וטפסה עד לבקבוק תרבית רקמה 150 2 סנטימטר. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם בחירה של משרד הפנים מתאימים ושוטף PBS הנרחב כדי למזער את השכפול וציפוי תאיים של דילול lysate המתאים כדי להשיג 100-200 מושבות שמרים לכל צלחת. משרד הפנים של 0.1 הוא אידיאלי כדי לפקח על שכפול תאיים על פני תקופה של 24 שעות כמספר תאי שמרים תאיים נותר מינימאלי במהלך coculturing הממושך זו של מקרופאגים THP-1 עם ג תאי glabrata. יתר על כן, משרד הפנים של 1.0 הוא אופטימלי עבור לדמיין את המספר המקסימאלי של
במיוחד כדי למנות את הישרדות / שכפול תאיים, השוואת CFU צריכה להיעשות בין מספר השמרים הפנימו בשעה 2 ואלה שנמצאים בנקודות זמן מאוחר יותר. השוואה עם 0 CFUs שעה תהיה להטות את התוצאות אם שיעורים מצורפים וphagocytosis ראשוניים שונים לזנים שונים. ראוי לציין כאן כי מספר תאי שמרים תאיים בתקופת הזיהום יכול גם להימדד על ידי cytometry הזרימה וconfocal / חי גישות מיקרוסקופיה ההדמיה תא.
בנוסף, שמרי recove תאייםאדום בנקודות זמן שונות לאחר זיהום באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש לכמה ניתוחים כולל מיקרוסקופיה, הצטברות מיני חמצן תגובתי (ROS), מיצוי הכרומטין, ו-RNA ובידוד חלבון להבחין אפיגנטיים, תעתיק, ותגובה המטבולית של תאי glabrata ג לסביבה הפנימית מקרופאג. זה חשוב כדי לבטל לחלוטין את השמרים תאיים ופסולת מקרופאג לפני ביצוע כל ניתוח ביוכימי על שמרים-הפנים מקרופאג.
יישום נוסף של מערכת מודל תרבית תאים במבחנה זו הוא ההסתגלות שלה למוטציות מסך לפרופילי הישרדות שינו, בנפרד או multiplexed בבריכה של 96 זנים באמצעות mutagenesis חתימה מתויגת גישה (STM). יתרון של אסטרטגית STM הוא ההקרנה המקבילה של מאות מוטציות בניסוי יחיד. לאחרונה גישה זו נוצלה בעבר על מסך ג li המוטציה glabratabrary שמורכב מ18,350 מוטציות החדרה אקראיות Tn 7 ומורכבים בסך של 192 בריכות שבו כל בריכה מורכבת מ96 מוטציות ייחודי oligonucleotide מתויגים 8 '15. איור 2 ציוריים ממחיש את קווי המתאר של המתודולוגיה מסך STM אשר מורכבת משלושה שלבים עיקריים. ראשית, בריכת הלילה-בוגרת של 96 ג מוטציות glabrata היא בתרבית או במדיום עשיר (קלט) או נגוע לTHP-1 מקרופאגים בצלחת תרבית רקמת 24 גם. תאי THP-1 אחרי 2 זיהום שעות, תאי שמרים תאיים יוסרו על ידי שוטף PBS ונגוע טופחו על 37 ° C. לאחר זיהום 24 שעות, תאים תאיים שמרים (פלט) הם התאוששו על ידי osmolysis של THP-1 תאים. הצעד השני כרוך במיצוי של הדנ"א הגנומי מדוגמאות קלט ופלט ואחריו הגברה של תגי חתימה ייחודיים עם 32 dCTP כותרת P באמצעות חסודERS משלים לאזור שמורת איגוף כל רצף oligonucleotide ייחודי. שלישית, תגי radiolabeled מבריכות קלט ופלט הם הכלאה לקרום Hybond ניילון המכיל 96 פלסמידים כל אחד נושא תג חתימה ייחודי. אות הכלאה עבור רצף oligonucleotide ייחודי משקפת את השפע של זן המוטציה, נושאת תג מסוים, בבריכה של 96 מוטציות. פלט (אופ) ליחס קלט (IP) עבור כל תג מחושב על ידי חלוקת עוצמת אות יציאה מעוצמת אות כניסה. מוטציות בו מוצגות לפחות 6 גבוהות פי ופי 10 הישרדות נמוכה יכולה להיחשב כ 'עד' (אופ / IP = 6.0, הגדיל את ההישרדות) ומוטציות 'למטה' (אופ / IP = 0.1 הישרדות מופחתת,), בהתאמה (איור 2). לחלופין, ניתן להשתמש במערכי DNA בדיקה תלויה fluorescently שכותרתו כדי לקבוע כל שינוי בעוצמת האות של התג בקלט והפלט לדוגמא שמשקף את ההתנהגויות תאיתIOR של המוטציה.
שיטה זו גם יכולה להיות מועסק על מנת ללמוד ROS ותגובת ציטוקינים והחמצת phagolysosomal של תאי phagocytic על זיהום פטרייתי עם פתוגנים. לבסוף, בשל יכולת ההתאמה של הליך זה לשניהם, סוגי תאים חיסוניים שונים, כולל תאים עיקריים, כמו גם אורגניזמים פטרייתי, פרוטוקול זה מתאים כדי לטפל בכמה היבטים של אינטראקציה מארח פטרייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי חדשני הצעיר biotechnologist פרס BT/BI/12/040/2005 ומענק BT/PR13289/BRB/10/745/2009 מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו וקרנות ליבה של המרכז לDNA טביעת אצבעות ואבחון, היידראבאד. MNR וGB הם המקבלים זוטרים ובכירות מלגות מחקר של מועצת המחקר מדעי ותעשייתי למרדף האחר תואר PhD מאוניברסיטת Manipal. SB הוא הנמען של זוטר ובכירה למחקר מלגה מהמחלקה לביוטכנולוגיה לקראת המרדף האחר תואר PhD מאוניברסיטת Manipal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study. J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).
- Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. Overview of opportunistic fungal infections in India. Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).
- Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).
- Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).
- Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).
- Seider, K., Brunke, S., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).
- Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction. PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).
- Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis. Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).
- Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates. Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).
- Murayama, T., Ohara, Y., et al. Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).
- Gross, O., Poeck, H., et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence. Nature. 459, 433-436 (2009).
- Auwerx, J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).
- Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).
- Castaño, I., Kaur, R., et al. Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata. Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).
