Summary
現在の記事は、真菌の病原性のメカニズムの知識を進めるために有用なツールとなり、人間のマクロファージとの通性細胞内のヒトの真菌病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を研究するためのin vitroでの細胞培養モデル系を確立するためのプロトコルの概要を説明します。
Abstract
細胞培養モデル系では、ホスト環境条件の近隣模倣場合、微生物病原体感染の特定の段階の研究のための動物モデル系を、安価で再現性があり、容易に操作可能な代替物として機能することができる。 、ホルボールエステル治療の際に、マクロファージに分化されたTHP-1ヒト単球細胞株は、以前に結核菌を含む多くの細胞内病原体の病原性戦略を研究するために使用されている。ここでは、in vitro細胞培養モデルを制定するためのプロトコルを議論ホスト貪食細胞と日和見人間酵母病原体のカンジダ·グラブラタの相互作用を記述するために、THP-1マクロファージを用いたシステム。このモデル系は、簡単、迅速、ハイスループット変異スクリーニングに適しており、まだ高度な機器を必要としない。典型的なTHP-1マクロファージ感染実験を回収し、細胞内を可能にするために、追加の24〜48時間で約24時間を要するコロニー形成単位ベースの実行可能性の分析のための富栄養培地上で増殖する酵母。他のin vitroモデル系と同様に、このアプローチの可能な限界は、ヒト宿主に存在する非常に複雑な免疫細胞回路に得られた結果を外挿することが困難なことである。しかし、これにもかかわらず、現在のプロトコルは、真菌病原体が、抗菌応答に対抗して生き残る/回避適応し、宿主免疫細胞の貧栄養環境下で増殖するように使用することができる戦略を解明することは非常に便利です。
Introduction
カンジダ種は、免疫不全患者の生命を脅かす侵襲性真菌感染症の1の主要な原因である。 カンジダ·グラブラタ 、新興院内病原体は、地理的な位置1-3に応じて、集中治療室の患者からの第二または第三の最も頻繁に孤立したカンジダ種である。系統発生的に、C.グラブラタ 、半数体出芽酵母、より密接に病原性カンジダ属に比べcerevisiaeの非病原性のモデル酵母サッカロミセスに関連しています。Cを含むカンス 4。これと一致して、C.グラブラタ交配 、分泌されたタンパク質分解活性及び形態学的可塑性4-5を含むいくつかの重要な真菌の病原性の特徴を欠いている。
C.もののグラブラタが菌糸を形成しない、それが生き残るためには、6〜8は、それが独特の病因メカニズムを開発したことを示唆しているマウスおよびヒトのマクロファージ内で複製することができます。限られた情報は、C.戦略について提供されていますグラブラタは、栄養の乏しい細胞内マクロファージ環境を生き残るためには、酸化および5宿主免疫細胞によって取り付けられた非酸化宿主応答に対抗するために採用しています。関連マクロファージモデル系は、Cの相互作用を描写する前提条件である機能的ゲノムおよびプロテオミクスのアプローチを介してホスト貪食細胞とグラブラタ 。末梢血単核細胞（PBMC）及びヒトおよびマウス由来の骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は、それぞれ、以前のC.の相互作用を研究するために使用されている宿主免疫細胞7,9とグラブラタ 。しかし、PBMCおよびBMDMsを得ることが困難、その限られた寿命と異なる哺乳動物ドナー間本質的な変化は、これらの細胞の活用など多彩なモデルシステムを制限します。
ここでは、intracellulを研究するためのin vitro系の確立のための方法を説明しますCの ARの挙動ヒト単球細胞株THP-1由来マクロファージにおける細胞グラブラタ 。このプロトコルの全体的な目標は、簡単にホスト真菌病原体の相互作用の様々な側面を研究するために操作することができる、簡単で、安価、迅速、かつ再現性の細胞培養モデル系を制定することでした。
THP-1細胞は、以前は、細菌、ウイルス、および真菌10-12を含む広範囲の病原体に対する宿主免疫応答を解読するために使用されている。単球THP-1細胞を維持するのに容易であり、ヒトの単球由来のマクロファージを模倣し、適切なマクロファージマーカー13を発現するマクロファージ、ホルボールエステル治療の際に、区別することができる。 THP-1マクロファージモデル系の主な利点は、使いやすさと洗練された機器の必要がないことである。
ここで紹介するプロトコルは、HOSで、他の人間の真菌病原体の相互作用を研究する容易に適応される免疫細胞をトン。現在の手順はまた、ハイスループット変異スクリーニングを使用して、関心対象の病原体の病原性因子を同定するために用いることができる。この概念実証は、ヒトマクロファージ8にC.グラブラタの生存のために必要とされる56遺伝子のセットを同定するために、THP-1培養モデルシステムの使用の成功により例示した。
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Protocol
これは、Cを実行することをお勧めしますバイオセーフティ封じ込めレベル2（BSL-2）との実験室でグラブラタ感染実験。
- THP-1マクロファージ単層の調製。
- Cの準備グラブラタ細胞懸濁液。
- CとTHP-1マクロファージの感染グラブラタ細胞。
- コロニー形成単位アッセイによって貪食率および細胞内複製を測定する。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて細胞内複製のモニタリング。
1。 THP-1マクロファージ単層の調製
- THP-1は急性単球性白血病を患っている14 1歳の男児の末梢血由来のヒト単球細胞株である。 THP-1懸濁細胞株は、日常的に、10％FBS（ウシ胎児血清）を補充したRPMI-1640培養培地中、加湿5％CO 2中37℃で維持する。ホルボール12 - myristaによる治療テ13 - アセテート（PMA、ホルボールエステル）がマクロファージにTHP-1単球細胞の最終分化をもたらす。重要なことに、PMA処理は細胞生存率に影響を与えず、分化した細胞は分裂しない。
- シードRPMI-1640完全培地中で100mmの培養皿中約1.5×10 6個のTHP-1単球（10％血清、2mMグルタミンおよび1×抗生物質を補充したRPMI-1640培地、10ミリリットル/ディッシュ）細胞を、37℃で増殖およびlet 2日間、5％CO 2でCが°。
- THP-1細胞を8×10 5細胞/ mlの密度に達した後、細胞培養層流フードに培養皿に移し、穏やかに沈降した細胞を再懸濁するためにそれを旋回させる。
- 細胞懸濁液をピペットで、4分間1,000 rpmで（130×g）で15ミリリットル滅菌チューブと遠心分離機に入れる。上澄み液を捨て、5ミリリットルの新鮮な、予め温め、RPMI-1640完全培地中のTHP-1細胞ペレットを一時停止。
- 血球計数器を用いて細胞を列挙し、セル画を希釈予め加温したRPMI-1640完全培地で10 6細胞/ mlの最終濃度までリットルの懸濁液
- （ホル12 - ミリステート13 - アセテート溶液は、ジメチルスルホキシドで製造）10ミリリットルのTHP-1細胞懸濁液（最終濃度16 nM）を160 mMのPMAストックを1μLを加え、よく混ぜる。 24ウェル組織培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを分配し、12時間、5％CO 2、37℃で維持したインキュベーター中でプレートをインキュベートする。
- 古いメディアを削除するには、1ミリリットルのRPMI-1640完全培地を予め暖め追加し、細胞を5％CO 2中37℃で12時間かけて回復することができます。
- 懸濁液中のその楕円形のTHP-1単球細胞は平らに、紡錘型、付着マクロファージに分化したことを確認するために倒立顕微鏡下で細胞を観察します。これらの分化した細胞は、現在で調査を行って準備ができているグラブラタ感染実験。
2。 Cの準備グラブラタ ＆＃160;細胞懸濁液
C.グラブラタ野生型株のBG2は、THP-1マクロファージを感染させるために使用される。C.グラブラタ細胞は、液体YPD（酵母エキス（1％）、ペプトン（2％）、デキストロース（2％））培地中で日常的に培養される。固形YPD培地は、オートクレーブ処理前に培地、2％寒天を添加することにより調製される。
- Cの文化を準備するにはグラブラタ 、滅菌された使い捨ての耳で寒天プレートからシングルコロニーを上にピックアップし、10ミリリットルにYPD液体培地に接種し、30℃で（200回転）しながら14〜16時間インキュベート
- テーブルトップマイクロ遠心で5分間4,000 rpmで（1,800×g）で遠心この培養物（1ml）を、滅菌PBS（リン酸緩衝食塩水、pH 7.4）で3回細胞を洗浄し、1mlのPBS中に細胞ペレットを再懸濁する。
- C.のOD 600を測定しますグラブラタ細胞懸濁液を2×10 6細胞/ mlの密度を得るために、滅菌PBSの適切な容量で希釈した（OD 600= 0.1）。あるいは、所望の細胞密度を、血球計数器を用いて酵母細胞を計数することによって達成することができる。
3。 CとTHP-1マクロファージの感染グラブラタ細胞
- 50μLCを追加0.1のMOI（感染多重度）を取得し、5％CO 2、37℃でプレートをインキュベートするTHP-1マクロファージ（24ウェル培養プレートのウェルに播種10 6細胞）にグラブラタ細胞懸濁液。
- 実行可能な酵母数を決定するために、50μlの温度を希釈グラブラタ細胞懸濁液を滅菌PBS中で100倍にYPD固体培地上に100μlをプレート。 30℃で培養すると、手動で1〜2日後に現れる酵母コロニーの数を数える。これらの数は、今後、0時間のC.として呼ばれるグラブラタのCFU（コロニー形成単位）。
- CとTHP-1細胞の2時間の共培養の後24ウェル組織培養プレートを反転させることにより細胞グラブラタ 、廃棄培地iを貯水池Naおよびnonphagocytosed細胞外Cを削除するに予熱無菌PBSで3回優しく洗うグラブラタ細胞。 PBSで穏やかな洗浄は、THP-1マクロファージ単層に損傷を引き起こすことなく、全ての細胞外酵母の完全な除去を達成するために必要不可欠である。
4。コロニー形成単位アッセイを経由して貪食率と細胞内複製の測定
- 溶解温度 1ml中グラブラタ感染THP-1マクロファージ2分間の滅菌H 2 O、ならびにマクロファージから破片を除去し、微量遠心管中で細胞溶解物を収集するために穏やかにこすり。完全なマクロファージ溶解の微視的な検証は、すべての内部化酵母の回復のために極めて重要である。
- 滅菌PBS中の溶解液の100倍希釈液を調製、YPD固体培地上に100μlをプレートに30℃で培養する
- 1-2日後、手動C.数を数えるそのAP グラブラタコロニーYPD培地にしまっ、希釈倍率（2時間のCFU）で乗算し、Cのパーセントを指す貪食率を計算する以下の式を用いて2時間の同時インキュベーションの後にTHP-1マクロファージによって摂取されるグラブラタ細胞。
％の貪食= [（2時間でのCFU）/（0時間でのCFU）]×100 - C.の細胞内複製の速度を測定するためにTHP-1マクロファージにおけるグラブラタ細胞が、ポイントは、感染、すなわちポスト異なる時間に、細胞内の酵母を収集します。 4、6、8、10、12、および24時間、3.3から4.3の手順を繰り返すこと。
- Cの倍生存/複製を計算する2時間（貪食酵母）におけるそれらと任意の所与の時点での合計のCFUを分割することによりTHP-1マクロファージにおける細胞グラブラタ 。
5。共焦点ラスを使用して、細胞内複製を監視するER走査顕微鏡
- 第1節に記載の手順に従って、2つの4ウェルチャンバースライドの各ウェル内のPMA処理した5×10 5 THP-1細胞を播種し、12時間、5％CO 2、37℃でインキュベートする。
- あらかじめ温めておいたRPMI-1640完全培地で古い培地を交換し、細胞は12時間、PMA処理から回復することができます。
- 調製GFP（緑色蛍光タンパク質）タグ付きC.グラブラタ細胞懸濁液2章で説明され、1のMOIのTHP-1マクロファージに感染するように。 C.もしGFPを発現するグラブラタ株が利用できない、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）で標識された酵母細胞は、感染を転記すなわち初期の事象を監視するために使用することができる。 2時間で貪食率およびファゴリソソーム成熟。
- 5％CO 2、37℃で2時間スライドをインキュベート培地を廃棄し、滅菌で3回洗浄するために注意深く反転し、PBSで予め温め。
- RPMI-1640完全MEDIを予め温め500μLを追加UM 1スライドの各チャンバーにし、22時間、5％CO 2、37℃で静置する。
- 2時間Cを修正するにはグラブラタ感染THP-1マクロファージは、他のスライドの各チャンバーに（PBS中で調製）3.7％ホルムアルデヒドを500μlを加え、暗所で20分間室温で静置する。
- 洗浄は、PBSで3回スライドさせ、500μlのトリトン-X（0.7％）を添加し、暗所で5分間室温でインキュベートする。
- PBSで洗浄スライド3X、暗闇の中で3〜5分間乾かし培養スライドや空気から容器を外します。
- 注意深くスライド回避気泡形成にDAPI（4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）を含むベクタシールド封入剤を用いてカバースリップをマウント。優しくキムワイプで過剰な液体を除去し、マニキュアでカバースリップの端をシールします。使用するまで4℃の暗所に保管してスライド。
- 繰り返しますTHP-1細胞24時間後に感染を処理するために5.4および5.6から5.9を繰り返します。
- レーザ走査confoを用いて画像セルCAL顕微鏡（60X油浸対物レンズ、DAPI及びGFP染色のための405 nmおよび488 nmで励起、それぞれ）。
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Representative Results
CとPMA処理したTHP-1マクロファージの感染分析グラブラタ野生型（wt）細胞は、wt細胞を、2時間の同時インキュベーション後に55〜65％の割合でマクロファージによって貪食されたことを明らかにした。さらに、C.グラブラタ細胞は、THP-1マクロファージによる殺傷に抵抗することができましたし、中程度の5を受けた- THP-1マクロファージ8と共培養の24時間後のCFUでの7倍に増加した。 THP-1マクロファージあたりの細胞内酵母細胞の数をかけ七から一二に1つまたは2つの増加を特徴とTHP-1マクロファージにおけるGFP発現プラスミドで形質転換された野生型細胞の細胞内複製もまた、共焦点蛍光顕微鏡で確認した24時間の（ 図1）。
図1。固定ホルムアルデヒドの共焦点画像を、GFPタグでそれぞれ、2時間および24時間の時点で1-2と5-8酵母を保有するTHP-1細胞を用いた細胞内複製を表示グラブラタ感染THP-1マクロファージ。核をDAPIで染色されています。バー=10μmである。
図2。 C.の略図署名タグ付き誘発（STM）のアプローチを経由して、THP-1マクロファージにおける変化した生存プロファイル用グラブラタ変異体ライブラリ画面。赤と緑の円ハイブリダイズされた膜上の入力サンプルと比較した出力サンプルでは、それぞれのタグの減少および上昇表現を表す。
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Discussion
自然免疫系は、日和見真菌感染症の制御に重要な役割を果たしている。マクロファージは、摂取および真菌病原体の破壊によって防衛を抗真菌に貢献。このように、生存および/またはマクロファージの抗菌機能に対抗するために必要な要因の解明は、真菌の病原性戦略の我々の理解を進める。この文脈において、我々は、ヒトの日和見真菌病原C.の相互作用を特徴づけるために、ヒト単球細胞株THP-1由来マクロファージを用いたin vitro細胞培養モデル系を確立したホスト貪食細胞とグラブラタ 。このTHP-1マクロファージモデル系が正常C.を同定するために使用されてきたが全身性カンジダ症8のマウスモデルにおいて弱毒化した病原性を表示された縮小生存とグラブラタ変異体は、このシステムの妥当な制限は、その孤立したコンテキストで、このようにして、得られた結果ではないかもしれない常に複雑な哺乳動物宿主の免疫系にも適用できる。また、このシステムは、生細胞イメージング方法とは異なり、どちらTHP1マクロファージによって取り込ままたは食作用の間に殺されていない酵母細胞を考慮することができない。
このプロトコルの重要性は、そのシンプルさ、再現性と拡張性にある。この方法は、96ウェルプレートにスケールダウンし、150cm 2の組織培養フラスコにスケールアップすることができる。このプロトコルの重要なステップは、プレート当たり100〜200酵母コロニーを得るために、適切な溶解液の希釈の細胞外複製、メッキを最小化するよう適切なMOIと豊富なPBS洗浄の選択である。 0.1のMOIは、理想的には、細胞外の酵母細胞の数は、C.とTHP-1マクロファージのこの延長された共培養中に最小限のままであるように、24時間にわたって細胞内複製をモニターするために適しているグラブラタ細胞。さらに、1.0のMOIは、最大数を可視化するための最適です。
特に細胞内生存/複製を列挙するには、CFUの比較は2時間、後の時点でのこれらの内面化酵母の数との間でなされるべきである。初期付着と貪食率が異なる株のために異なっている場合0時間のCFUをとの比較結果を歪曲します。それは、感染期間中の細胞内酵母細胞の数は、フローサイトメトリーおよび共焦点/生細胞イメージング顕微鏡のアプローチによって測定することができることに注目すべきである。
さらに、細胞内酵母カーヴ異なる時点で、このプロトコルを使用して、感染後の赤色はエピジェネティックな、転写、およびC.グラブラタ細胞の代謝応答を識別する顕微鏡法、活性酸素種（ROS）の蓄積、クロマチン抽出、RNAおよびタンパク質の単離を含むいくつかの分析のために使用することができるマクロファージ内部環境に。それは完全にマクロファージに内在化酵母上の任意の生化学的解析を実行する前に、細胞外酵母およびマクロファージの破片を除去することが重要です。
このin vitro細胞培養モデル系の別の用途は、個々に、または署名タグ化変異誘発（STM）アプローチを介して、96の株のプールに多重化され、改変された生存プロファイルの画面突然変異体へのその適応性である。 STM戦略の利点は、単一の実験で突然変異体の何百もの並列スクリーニングである。このアプローチは、最近、C.をスクリーニングするために使用されているグラブラタ変異型のLi18350ランダムTnは7挿入突然変異体で構成され、各プールは96一意オリゴヌクレオチドタグ付き突然変異体8 '15からなることを特徴と192プールの合計で組み立てられるbraryは、図2に図式3で構成さSTM画面手法の概要を示す図主な手順。まず、96℃で一晩成長プールグラブラタ変異体は、富栄養培地（入力）又は24ウェル組織培養プレート中のTHP-1マクロファージに感染させいずれかで培養される。 2時間感染後、細胞外の酵母細胞をPBS洗浄によって除去し、感染したTHP-1細胞を、37℃でインキュベートする24時間感染後、細胞内酵母細胞（出力）がTHP-1細胞のosmolysisによって回収される。第二段階は、プリムを用いて32 P-dCTPで標識したユニークな特性タグの増幅に続いて、入力と出力のサンプルからのゲノムDNAの抽出を伴いERSそれぞれのユニークなオリゴヌクレオチド配列に隣接する不変領域に相補。入力と出力のプールから第三に、放射性標識タグは固有の署名タグを担持するプラスミドを、それぞれ96が含まれてハイボンド-ナイロンメンブレンにハイブリダイズさせる。ユニークなオリゴヌクレオチド配列のためのハイブリダイゼーションシグナルは、96の変異体のプールには、その特定のタグを運んで、変異株の豊かさを反映している。各タグの入力に対する出力（オペアンプ）（IP）比、入力信号強度で出力信号強度を割ることによって計算される。少なくとも上位6倍表示変異体および10倍低い生存率は「の上で」と考えることができる（OP / IP = 6.0、生存率を増加）と'ダウン'（OP / IP = 0.1、減少生存）の変異体であった（ 図2）。あるいは、蛍光標識されたプローブに依存するDNAマイクロアレイは、入力中のタグの信号強度の任意のバリエーションおよび細胞内の60695-11-10ミラー出力サンプルを決定するために使用することができる変異体のIOR。
この方法はまた、ROSおよびサイトカイン応答および真菌病原体による感染の際に食細胞のファゴリソソームの酸性化を研究するために用いることができる。最後に、初代細胞、ならびに真菌の両方を含む、様々な免疫細胞型に、この手順の適応性のために、このプロトコルは、ホスト真菌相互作用のいくつかの側面に対処するのに適している。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、DNAフィンガープリントおよび診断のためのバイオテクノロジー本部、インド政府とセンターのコア·ファンドからの革新的な若手生物工学研究者賞BT/BI/12/040/2005とBT/PR13289/BRB/10/745/2009助成金によって支えられて、ハイデラバード。 MNR GBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けた科学産業研究評議会のジュニアとシニアリサーチフェローの受信者です。 SBはマニパル大学の博士号の学位を追求に向けたバイオテクノロジー本部のジュニアとシニアリサーチフェローシップ受賞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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