Summary
Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l'interaction d'un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons.
Abstract
Un système modèle de culture cellulaire, si un synoptique proche des conditions d'environnement de l'hôte, peut servir comme une alternative peu coûteuse, facilement manipulable et reproductible pour des systèmes de modèles animaux pour l'étude d'une étape spécifique de l'infection par le pathogène microbien. Une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 qui, lors du traitement de l'ester de phorbol, se différencie en macrophages, a déjà été utilisé pour étudier les stratégies de virulence de nombreux pathogènes intracellulaires, y compris Mycobacterium tuberculosis. Ici, nous discutons d'un protocole d'adopter un modèle in vitro de culture cellulaire dans système à l'aide de macrophages THP-1 pour délimiter l'interaction d'un agent pathogène opportuniste humain de la levure Candida glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte. Ce système de modèle est simple, rapide, prête à écrans mutantes à haut débit, et ne nécessite pas de matériel sophistiqué. Un THP-1 expérience d'infection des macrophages typique prend environ 24 heures avec un 24-48 heures supplémentaires pour permettre intracellulaire récupérélevure de se développer sur un milieu riche pour colony forming analyse de la viabilité à base de parts. Comme d'autres systèmes modèles in vitro dans une éventuelle limitation de cette approche est la difficulté d'extrapoler les résultats obtenus à un circuit de cellule immunitaire très complexe existant dans l'hôte humain. Cependant, malgré cela, le protocole actuel est très utile pour élucider les stratégies d'un agent pathogène fongique peut employer pour échapper / contrecarrer réponse antimicrobienne et survivre, s'adapter, et de proliférer dans l'environnement pauvre en nutriments des cellules immunitaires de l'hôte.
Introduction
Espèces de Candida sont la principale cause des infections fongiques invasives potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés 1. Candida glabrata, un pathogène nosocomial émergents, est la deuxième ou troisième plus fréquemment isolés espèces de Candida chez des patients de l'unité de soins intensifs en fonction de la situation géographique 1-3. Phylogénétiquement, C. glabrata, une levure bourgeonnante haploïde, est plus étroitement liée aux Saccharomyces non pathogène modèle cerevisiae que de pathogène Candida spp., y compris C. albicans 4. Conformément à cela, C. glabrata manque quelques traits de virulence fongiques clés, y compris l'accouplement, l'activité protéolytique sécrétée et la plasticité morphologique 4-5.
Bien que C. glabrata ne fait pas hyphes, il peut survivre et se répliquer dans les macrophages murins et humains 6-8 suggérant qu'il a développé des mécanismes de pathogenèse uniques. Peu d'informations sont disponibles sur les stratégies que C. glabrata emploie pour survivre environnement macrophages intracellulaire pauvres en éléments nutritifs et de contrer oxydation et réponses de l'hôte non oxydants montés par les cellules immunitaires de l'hôte 5. Un système de modèle de macrophage pertinente est une condition préalable pour délimiter l'interaction de C. glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte par des approches génomiques et protéomiques fonctionnels. Les cellules mononucléées du sang (PBMC) et des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) d'origine humaine et murine, respectivement, ont précédemment été utilisées pour étudier l'interaction de C. glabrata avec des cellules immunitaires de l'hôte 7,9. Cependant, la difficulté à obtenir les CMSP et BMDMs, leur durée de vie limitée et variation intrinsèque entre les différents bailleurs de fonds de mammifères limitent l'utilisation de ces cellules des systèmes modèles comme polyvalents.
Ici, nous décrivons une méthode pour l'établissement d'un système in vitro pour étudier la intracellulcomportement ar de C. glabrata cellules dans les macrophages issus de la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1. L'objectif global de ce protocole était d'adopter un système de modèle de culture cellulaire simple, peu coûteux, rapide et reproductible qui peut être facilement manipulé pour étudier différents aspects du pathogène interaction hôte-fongique.
Cellules THP-1 ont déjà été utilisées pour déchiffrer la réponse immunitaire de l'hôte contre une large gamme d'agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des champignons 10-12. Cellules monocytaires THP-1 sont faciles à entretenir et peuvent être différenciées, par traitement de l'ester de phorbol, de macrophages qui imitent les macrophages dérivés de monocytes humains et des macrophages expriment des marqueurs appropriés 13. Les principaux avantages de THP-1 système de modèle de macrophage sont la facilité d'usage et l'absence d'exigence d'un équipement sophistiqué.
Le protocole présenté ici est facilement adaptable pour étudier l'interaction d'autres agents pathogènes fongiques humains avec host cellules immunitaires. La procédure de courant peut également être utilisée pour identifier des facteurs de virulence de l'agent pathogène d'intérêt en utilisant des écrans de mutants à haut débit. Cette preuve de concept a été illustré par l'utilisation réussie de THP-1 système de modèle de culture pour identifier un ensemble de 56 gènes qui sont nécessaires pour la survie de C. glabrata dans les macrophages humains 8.
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Protocol
Il est recommandé d'effectuer C. glabrata expériences d'infection dans un laboratoire avec un niveau de biosécurité de confinement 2 (BSL-2).
- Préparation des cellules THP-1 macrophage monocouche.
- C. Préparation d' glabrata suspension cellulaire.
- L'infection des macrophages THP-1 avec C. cellules glabrata.
- Mesure du taux de phagocytose et de la réplication intracellulaire par l'intermédiaire de formation de colonies dosage unitaire.
- Surveillance de la réplication intracellulaire en utilisant la microscopie confocale à balayage laser.
Une. Préparation de THP-1 macrophages monocouche
- THP-1 est une lignée de cellules monocytes humains provenant du sang périphérique d'un 1 ans garçon atteint de leucémie aiguë monocytaire 14. THP-1, une lignée de cellules en suspension, est habituellement maintenue à 37 ° C humidifié à 5% de CO2 dans du milieu de culture RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal). Le traitement avec du phorbol 12-myrista13-acétate de te (PMA, un ester de phorbol) aboutit à une différenciation terminale des cellules THP-1 de monocytes en macrophages. Fait important, le traitement PMA n'affecte pas la viabilité des cellules et les cellules différenciées ne se divisent pas.
- Graine d'environ 1,5 x 10 6 cellules THP-1 de monocytes dans 100 boîtes de culture mm de milieu RPMI-1640 complet (milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum, 2 mM de glutamine et 1x antibiotiques; 10 ml / boîte) et laisser les cellules se développent à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 2 jours.
- Une fois cellules THP-1 ont atteint une densité de 8 x 10 5 cellules / ml, transférer la boîte de culture de la hotte à flux laminaire de culture cellulaire et agiter doucement pour remettre les cellules installées.
- Introduire à la pipette la suspension cellulaire, placez dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 1000 rpm (130 xg) pendant 4 min. Rejeter le surnageant et suspendre THP-1 culot cellulaire dans 5 ml, préchauffé, milieu complet RPMI-1640 frais.
- Énumérer les cellules avec un hémocytomètre et diluer le cell suspension à une densité finale de 10 6 cellules / ml avec du milieu complet préchauffé RPMI-1640
- Ajouter 1 pl de 160 mM PMA actions (phorbol 12-myristate 13-acétate solution préparée dans du diméthylsulfoxyde) à 10 ml THP-1 cellule suspension (concentration finale de 16 nM) et bien mélanger. Distribuer 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits et incuber la plaque dans l'incubateur maintenu à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 12 heures.
- Enlever le vieux médium, ajouter 1 ml préchauffé milieu RPMI-1640 complet et permettent aux cellules de récupérer pendant 12 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Observer les cellules sous un microscope inversé pour s'assurer que les cellules THP-1 monocytaires de forme ovale en suspension ont été différenciés en macrophages aplatis, en forme de fuseau et adhérentes. Ces cellules différenciées sont maintenant prêts à mener C. études d'infection glabrata.
2. C. Préparation d' glabrata & #160; suspension cellulaire
C. glabrata souche sauvage Bg2 sera utilisé pour infecter les macrophages THP-1. C. glabrata cellules sont cultivées en routine en milieu YPD liquide (extrait de levure (1%)-peptone (2%), de dextrose (2%)) moyenne. Milieu YPD solide est préparé en ajoutant 2% de gélose avant l'autoclavage milieu.
- Pour préparer une culture de C. glabrata, choisissez une seule colonie à partir de la plaque de gélose avec une boucle stérile à usage unique et inoculer dans 10 ml de milieu liquide YPD et incuber pendant 14-16 heures avec agitation (200 rpm) à 30 ° C.
- Centrifugeuse de cette culture (1 ml) à 4 000 tours par minute (1800 x g) pendant 5 min dans une microcentrifugeuse de table, de lavage des cellules trois fois avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4) et la suspension stérile culot cellulaire dans 1 ml de PBS.
- Mesurer la DO 600 C. glabrata suspension de cellules et on dilue avec un volume approprié de PBS stérile pour obtenir une densité de 2 x 10 6 cellules / ml (DO600= 0,1). En variante, la densité de cellules désirée peut être obtenue par comptage des cellules de levure en utilisant un hémocytomètre.
3. L'infection des macrophages THP-1 avec C. Cellules glabrata
- Ajouter 50 ul C. glabrata suspension de cellules THP-1 pour les macrophages (10 6 cellules ensemencées par puits d'une plaque de culture à 24 puits) pour obtenir une MOI (multiplicité d'infection) de 0,1 et incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Pour déterminer les chiffres de levure viables, diluer 50 pi C. glabrata cellule suspension de 100 fois dans du PBS stérile et de la plaque 100 pl sur milieu YPD solide. Incuber les plaques à 30 ° C et compter manuellement le nombre de colonies de levures apparaissant après 1-2 jours. Ces chiffres seront, désormais, être appelés à 0 h C. glabrata UFC (unités formant colonie).
- Après 2 heures de co-culture des cellules THP-1 avec C. glabrata cellules, le milieu de culture des rejets en inversant la plaque à 24 puits pour culture de tissus iréservoir na et lavez doucement trois fois avec PBS préchauffé stérile pour éliminer nonphagocytosed extracellulaire C. cellules glabrata. Lavages doux avec du PBS sont absolument essentiels pour accomplir l'élimination complète de toute la levure extracellulaire sans causer aucun dommage à la THP-1 macrophages monocouche.
4. Mesure de la phagocytose taux intracellulaire et Réplication via Colony Forming Unit Test
- Lyse C. glabrata infecté THP-1 macrophages dans 1 ml de H 2 O stérile pendant 2 min, gratter doucement pour enlever les débris des macrophages du bien et de recueillir lysat de cellules dans un tube à centrifuger. Vérification microscopique de lyse complète des macrophages est essentiel pour la récupération de toute la levure intériorisé.
- Préparer une dilution de 100 fois de lysat dans du PBS stérile, la plaque 100 pi sur milieu YPD solide et incuber les plaques à 30 ° C.
- Après 1-2 jours, compter manuellement le nombre de C. glabrata colonies qui appeared sur milieu YPD, multiplier par le facteur de dilution (2 h de UFC) et de calculer le taux de phagocytose qui se réfère au pour cent de C. glabrata cellules qui sont ingérés par les cellules THP-1 macrophages après co-incubation de 2 h à l'aide de la formule suivante.
% Phagocytose = [(UFC à 2 h) / (UFC à 0 h)] X 100 - Pour mesurer le taux de réplication intracellulaire de C. cellules glabrata dans les macrophages THP-1, recueillir la levure intracellulaire à des moments différents de points après l'infection dire. 4, 6, 8, 10, 12, et 24 heures, en répétant les étapes 3.3 à 4.3.
- Calculer fois survie / reproduction de C. cellules glabrata dans les macrophages THP-1 en divisant UFC total, à tout point de temps donné avec ceux à 2 h (levure phagocytés).
5. Surveillance de la réplication intracellulaire confocale Laser microscopie à balayage
- Suivant les étapes décrites dans la section 1, de semences traitées au PMA 5 x 10 5 cellules THP-1 dans chaque puits de deux lames de chambre de quatre puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 12 heures.
- Remplacer ancien milieu de préchauffé milieu RPMI-1640 complet et permettent aux cellules de se remettre de traitement au PMA pendant 12 heures.
- Préparer la GFP (green fluorescent protein) marqués C. glabrata suspension cellulaire tel que décrit à la section 2 et à infecter les macrophages THP-1 à une MOI de 1. Si C. glabrata souches exprimant la GFP ne sont pas disponibles, les cellules de levure marqués au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) peuvent être utilisés pour surveiller les événements précoces après l'infection savoir. taux de phagocytose et phagolysosomique maturation à 2 h.
- Incuber les lames pendant 2 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2, inverser les soigneusement à jeter moyen et laver 3 fois avec stérile, préchauffé PBS.
- Ajouter 500 ul préchauffé RPMI-1640 medi completum à chaque chambre d'un toboggan et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 22 heures.
- Pour fixer 2 h C. glabrata infectés macrophages THP-1, ajouter 500 ul de 3,7% de formaldéhyde (préparé dans du PBS) pour chaque chambre de l'autre lame et incuber à température ambiante pendant 20 minutes dans l'obscurité.
- Laver glisser trois fois avec du PBS, ajouter 500 ul de Triton-X (0,7%), et incuber à température ambiante pendant 5 min dans l'obscurité.
- Laver les diapositives 3x avec PBS, supprimer chambre de lame de culture et sécher à l'air pour 3-5 minutes dans l'obscurité.
- Enfoncer délicatement une lamelle en utilisant un milieu Vectashield montage contenant du DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole) sur la glissière en évitant la formation de bulles. Retirez doucement le liquide en excès avec Kimwipe et sceller les bords de lamelle avec du vernis à ongles. glissière de magasin dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Répétez les étapes 5.4 et 5.6 à 5.9 pour traiter cellules THP-1 24 h post infection.
- les cellules de l'éditeur en utilisant un confo à balayage lasercal microscope (60X objectif à immersion d'huile, une excitation à 405 nm et 488 nm pour la GFP et DAPI tache, respectivement).
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Representative Results
Analyse infection de PMA-traités macrophages THP-1 avec C. les cellules de type sauvage glabrata (wt) ont révélé que les cellules wt ont été phagocytés par des macrophages à un taux de 55-65% au bout de 2 h co-incubation. En outre, C. glabrata cellules étaient capables de résister à mort par les macrophages THP-1 et ont subi une moyenne de 5 - à 7 fois plus dans UFC après 24 heures de co-culture avec des macrophages THP-1 8. La réplication intracellulaire de cellules de type sauvage, transformées avec le plasmide exprimant la GFP, dans les cellules THP-1 macrophages a également été vérifiée par microscopie à fluorescence confocale, dans lequel le nombre de cellules de levure intracellulaires par THP-1 macrophage est passé de un ou deux à sept à douze sur une période de 24 h (figure 1).
La figure 1. Une image confocale de formaldéhyde fixe, GFP-étiquetée C. glabrata infectés macrophages THP-1 présentant la réplication intracellulaire de cellules THP-1 héberger 1-2 et 5-8 levure à 2 h et 24 h, respectivement. noyaux sont colorés au DAPI. Bar = 10 um.
Figure 2. Représentation schématique de la C. écran de la bibliothèque mutant glabrata pour les profils de survie modifiés dans THP-1 macrophages par mutagenèse de signature-tagged cercles verts sur les membranes hybridées (STM) approche. Rouge et dénotent réduits et la représentation élevée des balises, respectivement, dans des échantillons de sortie par rapport à des échantillons d'entrée.
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Discussion
Système immunitaire inné joue un rôle important dans le contrôle des infections fongiques opportunistes. Macrophages contribuent à la défense antifongique par ingestion et la destruction de l'agent pathogène fongique. Ainsi, l'élucidation des facteurs qui sont nécessaires pour la survie et / ou contrecarrer les fonctions antimicrobiennes des macrophages fera progresser notre compréhension des stratégies de virulence des champignons. Dans ce contexte, nous avons établi un système modèle in vitro de culture de cellules en utilisant des macrophages dérivés d'une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 pour caractériser l'interaction d'un agent pathogène fongique opportuniste humain C. glabrata avec des cellules phagocytaires d'accueil. Bien que ce THP-1 système de modèle de macrophage a été utilisé avec succès pour identifier C. glabrata mutants avec la survie réduite qui s'affiche virulence atténuée dans un modèle murin de candidose systémique 8, une limitation plausible de ce système est son contexte d'isolement et, par conséquent, les résultats obtenus peuvent ne pastoujours applicable au système complexe de mammifère hôte immunisé. En outre, ce système, contrairement aux méthodes d'imagerie cellulaire en direct, n'est pas en mesure de rendre compte de cellules de levure qui soit ne sont pas prises par THP1-macrophages ou tués lors de la phagocytose.
L'importance de ce protocole réside dans sa simplicité, la reproductibilité et l'évolutivité. Le procédé peut être réduite à une plaque à 96 puits et mis à l'échelle jusqu'à un flacon de culture tissulaire de 150 cm2. Les étapes essentielles de ce protocole sont la sélection d'un MOI approprié et de nombreux lavages au PBS afin de minimiser la réplication extracellulaire et le placage de la dilution du lysat approprié pour obtenir 100-200 colonies de levures par plaque. A MOI de 0,1 est parfaitement adapté à surveiller la réplication intracellulaire au cours d'une période de 24 heures que le nombre de cellules de levure extracellulaires reste minime au cours de cette co-culture prolongée de cellules THP-1 avec des macrophages C. cellules glabrata. En outre, une MOI de 1,0 est optimal pour la visualisation du nombre maximal d'
Pour énumérer spécifiquement intracellulaire survie / réplication, la comparaison UFC doit être faite entre le nombre de levure intériorisé à 2 h et ceux à des moments plus tard. Comparaison avec 0 h UFC va biaiser les résultats si les taux de fixation et phagocytose initiales sont différentes pour les différentes souches. Il est à noter ici que le nombre de cellules de levure intracellulaires pendant la période d'infection peut également être mesurée par cytométrie en flux et la microscopie approches d'imagerie cellulaire confocaux / live.
En outre, la levure intracellulaire Recoverouge à différents points dans le temps après l'infection en utilisant ce protocole peut être utilisé pour plusieurs analyses, notamment la microscopie, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) d'accumulation, de l'extraction de la chromatine, et l'ARN et l'isolement de la protéine de discerner la épigénétique de la transcription, et la réponse métabolique des cellules glabrata C. au milieu interne macrophage. Il est important d'éliminer complètement la levure extracellulaire et les débris des macrophages avant d'effectuer une analyse biochimique sur la levure de macrophage-internalisé.
Une autre application de ce système modèle de culture cellulaire in vitro est sa capacité d'adaptation à des mutants d'écran pour les profils de survie altérées, soit individuellement, soit multiplexé dans un bassin de 96 souches par signature-tagged mutagenèse (STM) approche. Un avantage de cette stratégie est la STM criblage parallèle de plusieurs centaines de mutants dans une seule expérience. Cette approche a été récemment utilisé pour cribler une C. li mutant glabratathèque qui est composé de 18 350 Tn 7 mutants d'insertion aléatoires et assemblé dans un total de 192 piscines dans laquelle chaque groupe est composé de 96 mutants unique oligonucléotide-étiquetés 8 '15. Figure 2 illustre graphiquement la description de la méthodologie de l'écran de la STM qui se compose de trois principales étapes. Tout d'abord, une piscine nuit-adulte de 96 C. mutants glabrata sont cultivées soit en milieu riche (d'entrée) ou infectées de macrophages THP-1 dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Après 2 h d'infection, les cellules de levure extracellulaires sont éliminés par lavages au PBS et infectées cellules THP-1 sont incubées à 37 ° C. Après l'infection de 24 heures, les cellules de levure intracellulaires (de sortie) sont récupérés par osmolyse de cellules THP-1. La seconde étape comprend l'extraction de l'ADN génomique à partir d'échantillons d'entrée et de sortie, suivie par l'amplification des étiquettes uniques de signature avec du 32P-dCTP marqué à l'aide primteurs complémentaire de la région invariante flanquant chaque séquence oligonucléotidique unique. Troisièmement, les balises de radio-marqués pools d'entrée et de sortie sont hybridés sur une membrane de nylon Hybond-96 qui contient les plasmides portant chacun une étiquette de signature unique. signal d'hybridation d'une séquence oligonucléotidique unique reflète l'abondance de la souche mutante, portant cette étiquette particulier, dans un bassin de 96 mutants. Sortie (Op) à l'entrée (Ip) ratio pour chaque mot-clé est calculé en divisant l'intensité du signal de sortie par l'intensité du signal d'entrée. Mutants présentant au moins 6 fois plus élevées et 10 fois la survie inférieure peut être considéré comme le «haut» (Op / Ip = 6,0, a augmenté la survie) et (Op / Ip = 0,1, survie réduite) mutants «descente», respectivement (figure 2). En variante, marqués par fluorescence des puces à ADN-dépendante sondes peuvent être utilisées pour déterminer toute variation de l'intensité du signal de la balise à l'entrée et l'échantillon de sortie qui reflète le comportement de intracellulaireportement du mutant.
Cette méthode peut également être utilisée pour étudier ROS et la réponse de la cytokine et phagolysosomique acidification des cellules phagocytaires à l'infection par des agents pathogènes fongiques. Enfin, en raison de la capacité d'adaptation de cette procédure à la fois, différents types de cellules immunitaires, y compris les cellules primaires ainsi que des organismes fongiques, ce protocole est approprié pour aborder plusieurs aspects de l'interaction hôte-champignon.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Innovative jeune biologiste Prix BT/BI/12/040/2005 et BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subvention du Département de biotechnologie, gouvernement de l'Inde et les ressources de base de Centre pour empreintes génétiques et diagnostics, Hyderabad. MRN et GB sont les bénéficiaires de bourses de recherche junior et senior du Conseil de recherche scientifique et industrielle vers la poursuite d'un diplôme de l'Université de Manipal de doctorat. SB est le récipiendaire du Junior et Senior Research Fellowship du Département de biotechnologie vers la poursuite d'un diplôme de l'Université de Manipal de doctorat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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