Summary
O presente artigo descreve um protocolo para estabelecer um sistema modelo de cultura de células in vitro para estudar a interação de um patógeno humano intracelular facultativo de fungos Candida glabrata com macrófagos humanos, que será uma ferramenta útil para aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de virulência de fungos.
Abstract
Um sistema de modelo de cultura de células, se um mímico de perto as condições ambientais do hospedeiro, pode servir como uma alternativa barata, reprodutível e facilmente manipulável para sistemas de modelo animal para o estudo de um passo específico de uma infecção patogénica microbiana. Uma linha celular monocítica humana THP-1, o qual, após tratamento do éster de forbol, subdivide-se em macrófagos, anteriormente tem sido utilizado para estudar as estratégias de virulência de vários agentes patogénicos intracelulares, incluindo o Mycobacterium tuberculosis. Aqui, discutimos um protocolo para adoptar um modelo in vitro de cultura de células sistema usando THP-1 macrófagos para delinear a interação de um oportunista levedura Candida glabrata patógeno humano com células fagocíticas host. Este sistema modelo é simples, rápido, passíveis de telas de mutantes de alto rendimento, e não requer equipamentos sofisticados. A THP-1 experiência típica a infecção dos macrófagos leva aproximadamente 24 horas, com um adicional de 24-48 horas para permitir intracelular recuperadolevedura de crescer em meio rico para formadoras de colônia análise de viabilidade com base em unidade. Como outros sistemas in vitro do modelo, uma possível limitação dessa abordagem é a dificuldade em extrapolar os resultados obtidos para um circuito de célula imunológica altamente complexo existente no hospedeiro humano. No entanto, apesar disso, o protocolo atual é muito útil para elucidar as estratégias que um fungo pode empregar para evitar / neutralizar resposta antimicrobiana e sobreviver, adaptar e proliferar no ambiente pobre em nutrientes das células do sistema imunológico do hospedeiro.
Introduction
Espécies de Candida são a principal causa de infecções fúngicas invasivas risco de vida em pacientes imunocomprometidos 1. Candida glabrata, um patógeno nosocomial emergente, é o segundo ou terceiro mais frequentemente isoladas espécies de Candida de pacientes unidade de terapia intensiva, dependendo da localização geográfica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, uma levedura de brotamento haplóides, é mais estreitamente relacionado com os Saccharomyces não modelo levedura patogênica cerevisiae do que patogênica Candida spp. incluindo C. albicans 4. Coerente com isso, C. glabrata carece de algumas características de virulência de fungos-chave, incluindo o acasalamento, a actividade proteolítica secretada e plasticidade morfológica 4-5.
Embora C. O glabrata não formam hifas, pode sobreviver e replicar-se em macrófagos de ratinho e humanos 6-8 sugerindo que desenvolveu mecanismos de patogénese únicas. Não existe informação suficiente sobre as estratégias que C. glabrata emprega para sobreviver ambiente intracelular de macrófagos pobres em nutrientes e neutralizar respostas do hospedeiro não oxidativos montados por células do sistema imunológico do hospedeiro 5 oxidativo e. Um sistema modelo de macrófagos pertinente é um pré-requisito para delinear a interação de C. glabrata com células fagocíticas do hospedeiro através de abordagens de genômica e proteômica funcional. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de origem humana e de murino, respectivamente, têm sido anteriormente utilizados para estudar a interacção de C. glabrata com células do sistema imunológico do hospedeiro 7,9. No entanto, a dificuldade na obtenção de PBMC e BMDMs, a sua duração de vida limitada e variação intrínseca entre diferentes doadores de mamíferos restringir a utilização destas células como sistemas modelo versáteis.
Aqui, descrevemos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro para estudar a intracellulcomportamento de ar C. células glabrata em macrófagos derivados da linha celular monocítica humana THP-1. O objetivo geral deste protocolo foi a promulgar um sistema modelo de cultura de células simples, barato, rápido e reprodutível, que pode ser facilmente manipulado para estudar diferentes aspectos da interação patógeno-hospedeiro.
Células THP-1 foram anteriormente usadas para decifrar a resposta imune do hospedeiro contra uma vasta gama de agentes patogénicos, incluindo as bactérias, vírus e fungos 10-12. Monocíticas THP-1, as células são fáceis de manter e podem ser diferenciados, após tratamento do éster de forbol, para os macrófagos, que imitam os macrófagos derivados de monócitos de ser humano e expressam marcadores de macrófagos adequados 13. As principais vantagens do THP-1, do sistema modelo de macrófagos são a facilidade de utilização e a falta de equipamento sofisticado requisito.
O protocolo aqui apresentado é facilmente adaptável para estudar a interação de outros fungos patógenos humanos com hosAs células T do sistema imunológico. O processo actual pode também ser empregue para identificar os factores de virulência para o agente patogénico de interesse, utilizando telas de mutantes de elevada capacidade. Esta prova de conceito foi exemplificado pelo uso bem sucedido de THP-1 sistema de modelo de cultura para identificar um conjunto de 56 genes que são necessários para a sobrevivência de C. glabrata em macrófagos humanos 8.
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Protocol
Recomenda-se a realizar C. experimentos de infecção glabrata em um laboratório com nível de contenção de biossegurança 2 (BSL-2).
- Preparação de células THP-1 monocamada de macrófagos.
- Preparação de C. suspensão de células glabrata.
- A infecção de células THP-1 com os macrófagos C. células glabrata.
- A medição da taxa de fagocitose e replicação intracelular através do ensaio de formação de colónias unidade.
- Monitoramento da replicação intracelular por microscopia confocal a laser.
1. Preparação de células THP-1 macrófago monocamada
- THP-1 é uma linha celular monocítica humana derivada a partir do sangue periférico de um menino de 1 ano de idade, sofrendo de leucemia monocítica aguda 14. THP-1, uma linha de células em suspensão, é habitualmente mantida a 37 ° C em humidade a 5% de CO 2 em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% FBS (soro fetal bovino). O tratamento com forbol 12-myristate 13-acetato (PMA, um éster de forbol) resulta na diferenciação terminal de células THP-1 monocitárias em macrófagos. É importante ressaltar que o tratamento PMA não afeta a viabilidade das células e células diferenciadas não se dividem.
- Semente de aproximadamente 1,5 x 10 6 monócitos THP-1 em placas de 100 mm de cultura em meio RPMI-1640 completo (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro, 2 mM de glutamina e antibióticos 1x, 10 mL / prato) e deixar crescer as células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2 dias.
- Uma vez que as células THP-1 chegaram a uma densidade de 8 x 10 5 células / ml, transferir a placa de cultura para a cultura de células de fluxo laminar vertical e agitar suavemente para ressuspender as células que se estabeleceram.
- Pipetar a suspensão de células para fora, colocar num tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 1000 rpm (130 x g) durante 4 min. Elimine o sobrenadante e suspender de THP-1 sedimento celular em 5 ml, pré-aquecido, de meio completo RPMI-1640 fresco.
- Enumerar as células com um hemocitômetro e diluir o cell suspensão para uma densidade final de 10 6 células / ml com meio completo pré-aquecido RPMI-1640
- Adicionar 1 ml de estoque de 160 mM PMA (12-miristato de solução de 13-acetato de forbol preparada em dimetil-sulfóxido) para 10 ml de THP-1 de suspensão celular (concentração final 16 nM) e misture bem. Repartir 1 ml de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e incubar placa na incubadora mantida a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 12 horas.
- Remover o meio velho, adicionar 1 ml de pré-aquecido de RPMI-1640 completo e permitir que as células recuperar durante 12 horas a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Observar células sob um microscópio invertido para garantir que células THP-1 monocítica ovais em suspensão foram diferenciadas em macrófagos achatados, em forma de fuso e aderentes. Estas células diferenciadas estão agora prontos para conduzir C. estudos de infecção glabrata.
2. Preparação de C. glabrata & #Suspensão celular; 160
C. glabrata estirpe selvagem Bg2 será utilizado para infectar células THP-1 macrófagos. C. glabrata células são rotineiramente cultivadas em meio YPD líquido (extracto de levedura (1%), peptona (2%), dextrose (2%)) médio. Meio YPD sólida é preparada por adição de 2% de agar antes da autoclavagem médio.
- Para preparar uma cultura de C. glabrata, escolhe-se uma única colónia da placa de agar com um lacete estéril, descartável e inocular em 10 ml de meio YPD líquido e incubar durante 14-16 horas, com agitação (200 rpm) a 30 ° C.
- Centrífuga esta cultura (1 ml) a 4000 rpm (1800 xg) durante 5 min, em cima de uma mesa de microcentrífuga, lavar as células três vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) estéril e suspender sedimento celular em 1 ml de PBS.
- Medida OD600 de C. suspensão de células glabrata e dilui-se com um volume adequado de PBS estéril para obter uma densidade de 2 x 10 6 células / ml (DO600= 0,1). Em alternativa, a densidade de células desejada pode ser conseguida por meio da contagem de células de levedura usando um hemocitómetro.
3. A infecção de células THP-1 de macrófagos C. Células glabrata
- Adicionar 50 ul C. suspensão de células glabrata THP-1 nos macrófagos (10 6 células semeadas por poço de uma placa de cultura de 24 poços) para obter um MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1 e Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Para determinar as contagens de levedura viáveis, diluir 50 ul C. glabrata de células em suspensão de 100 vezes em PBS estéril e placa 100 uL de meio sólido de YPD. Incubar as placas a 30 ° C, e contar manualmente o número de colónias de levedura que aparecem após 1-2 dias. Esses números serão, doravante, ser referido como 0 hr C. glabrata UFC (unidades formadoras de colônia).
- Depois de 2 horas coculturing de células THP-1 com C. células glabrata, meio de cultura de descarte invertendo placa de 24 poços de cultura de tecidos ina reservatório e lavar cuidadosamente três vezes com PBS estéril pré-aquecido para remover C. extracelular nonphagocytosed células glabrata. Lavagens gentil com PBS são absolutamente essenciais para realizar a remoção completa de todo o fermento extracelular, sem causar qualquer dano ao THP-1 macrófagos monocamada.
4. Medição de fagocitose e Taxa de replicação intracelular via Colony Forming Assay Unit
- Lyse C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos, em 1 ml de H 2 O estéril durante 2 min, raspe para remover os detritos de macrófagos do poço e recolher o lisado celular num tubo de microcentrífuga. Verificação microscópica da lise dos macrófagos completo é fundamental para a recuperação de todas as leveduras internalizadas.
- Prepara-se uma diluição de 100 vezes do lisado em PBS estéril, placa de 100 ul de meio sólido de YPD e incubar as placas a 30 ° C.
- Após 1-2 dias, a contagem manual do número de C. glabrata colônias que apreceu em meio YPD, multiplique com o fator de diluição (2 horas UFC) e calcular a taxa de fagocitose, que se refere à percentagem de C. glabrata células que são ingeridas por THP-1, macrófagos, após co-incubação de 2 horas com a seguinte fórmula.
Fagocitose% = [(UFCs em 2 h) / (CFU em 0 h)] X 100 - Para medir a taxa de replicação intracelular de C. glabrata células THP-1 em macrófagos, recolher levedura intracelular em diferentes momentos pós ie infecção. 4, 6, 8, 10, 12, e 24 horas, repetindo os passos 3,3-4,3.
- Calcule vezes sobrevivência / replicação de C. glabrata em células THP-1, macrófagos, dividindo o total de UFC em qualquer ponto no tempo, com os de 2 horas (de levedura fagocitado).
5. Monitoramento de replicação intracelular Usando confocal Laser Microscopia
- Seguindo os passos descritos na secção 1, as sementes tratadas com PMA 5 x 10 5 células THP-1 em cada poço de dois lâminas de câmara de quatro poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 12 horas.
- Substituir meio velho pré-aquecido com meio RPMI-1640 completo e permitir que as células se recuperar a partir do tratamento de PMA durante 12 horas.
- Prepare GFP (proteína fluorescente verde)-marcado C. suspensão de células glabrata, conforme descrito na Seção 2 e infectar a THP-1 macrófagos para um MOI de 1. Se C. glabrata estirpes expressando GFP não está disponível, as células de levedura marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) pode ser utilizado para monitorar eventos precoces pós infecção viz. taxa de fagocitose e maturação phagolysosomal em 2 horas.
- Incubar durante 2 horas a 37 ° C com 5% de CO 2, inverte-los cuidadosamente para descartar meio e lavar 3x com estéril, pré-aquecido PBS.
- Adicionar 500 mL pré-aquecido RPMI-1640 completo medihum para cada câmara de uma corrediça e incube-a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 22 horas.
- Para corrigir 2 horas C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos, adicionar 500 mL de 3,7% de formaldeído (em PBS) a cada uma das câmaras da outra corrediça e incubar-la à temperatura ambiente durante 20 min no escuro.
- Lavar deslizar três vezes com PBS, adicionar 500 ul de Triton-X (0,7%), e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min no escuro.
- Lavar 3x slides com PBS, remova câmara de cultura de slides e ar seque-o por 3-5 min no escuro.
- Monte cuidadosamente uma lamela utilizando meio Vectashield montagem contendo DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) no slide evitando a formação de bolhas. Remova suavemente o excesso de líquido com Kimwipe e selar bordas lamela com unha polonês. Slides loja no escuro a 4 ° C até o uso.
- Repita os passos 5,4 e 5,6-5,9 para processar células THP-1 24 horas após a infecção.
- Células de imagem usando um confo de varredura a lasermicroscópio cal (objetiva 60X de imersão em óleo, a excitação a 405 nm e 488 nm para DAPI e GFP mancha, respectivamente).
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Representative Results
Analisa Infecção tratados com PMA THP-1 macrófagos com C. tipo selvagem glabrata (em peso), as células revelaram que as células wt foram fagocitados por macrófagos, a uma taxa de 55-65%, após co-incubação de 2 horas. Além disso, C. glabrata células foram capazes de resistir a morte por THP-1 macrófagos e passou por uma moderada 5 - para aumento de 7 vezes no UFC após 24 horas de coculturing com THP-1 macrófagos 8. Replicação intracelular de células de tipo selvagem, transformadas com o plasmídeo que expressa a GFP, em células THP-1 macrófagos também foi verificado com microscopia confocal de fluorescência em que o número de células de levedura intracelulares por células THP-1 de macrófagos aumentada de um ou dois para sete a doze durante um período de 24 horas (Figura 1).
Figura 1. A imagem confocal de formaldeído fixo, marcado-GFP C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos exibem replicação intracelular com células THP-1 abrigando 1-2 e 5-8 levedura em 2 horas e 24 horas, respectivamente. núcleos são corados com DAPI. Barra = 10 m.
Figura 2. Representação esquemática da C. rastreio da biblioteca mutante glabrata para perfis alterados de sobrevivência em células THP-1 através de mutagénese macrófagos marcado com assinatura (STM) abordagem. vermelha e verde em círculos membranas hibridadas denotam reduzida e elevada representação das etiquetas, respectivamente, nas amostras de saída em comparação com amostras de entrada.
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Discussion
Sistema imune inata desempenha um papel importante no controle de infecções causadas por fungos oportunistas. Os macrófagos contribuem para antifúngicos defesa por ingestão e destruição do patógeno. Assim, a elucidação de fatores que são necessários para a sobrevivência e / ou neutralizar as funções antimicrobianas de macrófagos permitirão uma melhor compreensão das estratégias de virulência de fungos. Neste contexto, nós estabelecemos um sistema in vitro de modelo de cultura celular, utilizando macrófagos derivados de uma linha celular monocítica humana THP-1 para caracterizar a interacção de um fungo patogénico oportunista humano C. glabrata com células hospedeiras fagocíticas. Embora este sistema de THP-1, macrófagos modelo com sucesso tem sido utilizado para identificar C. mutantes glabrata com menor sobrevida que exibiu virulência atenuada em um modelo murino de candidíase sistêmica 8, uma limitação plausível deste sistema é isolado de seu contexto e, portanto, os resultados obtidos não podemser sempre aplicável ao sistema imune do hospedeiro mamífero complexo. Além disso, este sistema, ao contrário dos métodos de célula de imagem ao vivo, é incapaz de explicar as células de levedura que, ou não são tomadas por THP1-macrófagos ou mortos durante a fagocitose.
A importância deste protocolo reside na sua simplicidade, reprodutibilidade e escalabilidade. O método pode ser reduzida para uma placa de 96 poços e dimensionados para um frasco de cultura de tecido de 150 centímetros 2. Os passos críticos neste protocolo são a seleção de um MOI apropriado e extensas lavagens PBS para minimizar a replicação extracelular e chapeamento de diluição lisado adequado para obter 100-200 colônias de leveduras por placa. Uma MOI de 0,1 é ideal para monitorizar a replicação intracelular ao longo de um período de 24 horas como o número de células de levedura extracelulares permanece mínima durante este coculturing prolongada de THP-1, macrófagos com C. células glabrata. Além disso, um MOI de 1,0 é ideal para a visualização do número máximo de
Para enumerar especificamente intracelular sobrevivência / replicação, CFU comparação deve ser feita entre o número de levedura internalizado em 2 horas e aqueles em pontos de tempo posteriores. A comparação com 0 hr UFC vai distorcer os resultados, se as taxas de fixação e fagocitose iniciais são diferentes para diferentes linhagens. É de notar aqui que o número de células de levedura intracelulares durante o período de infecção também pode ser medida por citometria de fluxo e confocal / vivo abordagens microscopia de imagem de células.
Além disso, intracelular recuperam leveduravermelho em diferentes momentos após a infecção utilizando este protocolo pode ser usado para várias análises, incluindo microscopia, espécies reativas de oxigênio (ROS) acumulação, a extração da cromatina, RNA e proteínas e isolamento de discernir a epigenética, transcricional e resposta metabólica de C. glabrata células para o meio interno de macrófagos. É importante para eliminar completamente a levedura extracelular e os detritos de macrófagos antes da execução de qualquer análise bioquímica em levedura internalizado e macrófagos.
Outra aplicação deste sistema modelo de cultura de células in vitro é a sua adaptabilidade para mutantes de tela para os perfis de sobrevivência alterados, de forma individual ou multiplexados em uma piscina de 96 cepas via assinatura-marcado mutagênese (STM) abordagem. Uma vantagem da estratégia STM é o rastreio paralelo de centenas de mutantes de uma única experiência. Esta abordagem tem sido recentemente utilizada para pesquisar um C. li mutante glabratabrary que é composta de 18.350 aleatórios Tn 7 mutantes de inserção e montados em um total de 192 conjuntos em que cada conjunto é composto por 96 mutantes exclusivamente oligonucleótido marcadas com 8 '15. Figura 2 ilustra graficamente o contorno da metodologia tela STM que consiste em três principais passos. Em primeiro lugar, uma piscina durante a noite-adulto de 96 C. mutantes glabrata é cultivados em meio rico (de entrada) ou infectadas com células THP-1 em macrófagos uma placa de 24 poços de cultura de tecidos. Depois de 2 horas de infecção, as células de levedura extracelulares são removidos por lavagens com PBS e infectados células THP-1 são incubadas a 37 ° C. Após a infecção de 24 h, as células de levedura intracelulares (saída) são recuperados por osmolysis de células THP-1. O segundo passo envolve a extracção de ADN genómico a partir de amostras de entrada e de saída, seguido de amplificação de etiquetas de assinatura original com 32 P-dCTP marcado usando primers complementar à região invariante flanqueando cada sequência oligonucleotídica original. Em terceiro lugar, as etiquetas radiomarcados de piscinas de entrada e de saída são hibridizadas para uma membrana de nylon Hybond-96, que contém os plasmídeos transportando cada um uma marca única assinatura. Sinal de hibridização para uma seqüência de oligonucleotídeos único reflete a abundância da estirpe mutante, carregando essa marca particular, em uma piscina de 96 mutantes. Saída (Op) entrada (Ip) a proporção de cada marca é calculada dividindo-se a intensidade do sinal de saída, a intensidade do sinal de entrada. Mutantes exibindo pelo menos seis vezes maior e 10 vezes menor sobrevivência pode ser considerado como 'up' (Op / Ip = 6,0, o aumento da sobrevivência) e (Op / Ip = 0,1, de sobrevivência reduzida) mutantes "para baixo", respectivamente (Figura 2). Alternativamente, microarrays de ADN dependente de sonda fluorescentemente marcadas podem ser usadas para determinar qualquer alteração na intensidade do sinal da etiqueta na entrada e na saída da amostra que espelha a comporta intracelularior do mutante.
Este método também pode ser utilizado para estudar ROS e da resposta de citocinas e phagolysosomal acidificação das células fagocíticas por infecção com fungos patogénicos. Por último, devido à capacidade de adaptação deste processo para ambos, vários tipos de células imunitárias, incluindo células primárias, bem como organismos fúngicos, este protocolo é adequado para resolver vários aspectos da interacção hospedeiro-fungo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Inovador Jovem Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e concessão BT/PR13289/BRB/10/745/2009 do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia e os fundos centrais do Centro de Impressões Digitais de DNA e Diagnóstico, Hyderabad. MNR e GB são os destinatários de júnior e sênior de pesquisa Bolsas de Estudo do Conselho de Pesquisa Científica e Industrial para a busca de um doutorado da Universidade Manipal. SB é o destinatário de Júnior e Sociedade do Departamento de Biotecnologia de Pesquisa Sênior para a busca de um doutorado da Universidade Manipal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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