Biosensors Ratiométrique qui mesurent l'état redox mitochondrial et de l'ATP dans les cellules vivantes de levure

Summary

Nous décrivons l'utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés, qui sont fondés sur la GFP, pour surveiller l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivantes.

Abstract

Les mitochondries jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires, du métabolisme énergétique et l'homéostasie du calcium au contrôle de la durée de vie cellulaire et la mort cellulaire programmée. Ces processus affectent et sont affectés par l'état redox et la production d'ATP par les mitochondries. Ici, nous décrivons l'utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés qui peuvent détecter l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivante. État redox mitochondrial est mesurée à l'aide Green Fluorescent Protein redox-sensibles (roGFP) qui est destiné à la matrice mitochondriale. Mito-roGFP contient résidus cystéine en positions 147 et 204 de la GFP, qui subissent une oxydation et une réduction réversible et dépendant de l'environnement, qui à son tour modifie le spectre d'excitation de la protéine. MitGO-ATeam est un transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde, dans lequel la sous-unité de l'ε _o F F _1-ATP synthase est prise en sandwich entre donneur et l'accepteur FRET fluoprotéines centes. La liaison de l'ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements de conformation de la protéine qui apportent le donneur et l'accepteur de FRET à proximité immédiate et de permettre un transfert d'énergie de fluorescence par résonance à partir du donneur à l'accepteur.

Introduction

Les mitochondries sont des organites essentiels pour la production d'ATP, la biosynthèse des acides aminés, des acides gras, l'hème, clusters fer-soufre et pyrimidines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans l'homéostasie du calcium, et dans la régulation de l'apoptose. ¹ en plus de preuves des liens mitochondries au vieillissement et aux maladies liées au vieillissement, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington. ² Bien que les individus vivent leur vie entière avec des mutations dans des protéines mitochondriales qui sont associés à des maladies neurodégénératives, les symptômes de la maladie se produisent seulement plus tard dans la vie. Cela indique que les changements se produisent dans les mitochondries avec l'âge qui permet maladie pathologie à émerger. En effet, fitness mitochondrial est corrélée à la santé globale de la cellule et la durée de vie de la levure et des cellules de mammifères ^3,4 Ici., Nous décrivons comment utiliser biocapteurs fluorescents génétiquement codés, ratiométriques d'évaluer deux caractéristiques essentielles de Mitochondria dans les cellules de levure vivantes: état redox et les niveaux d'ATP.

La fonction mitochondriale dans la mobilisation de l'énergie aérobie est bien établie. L'état d'oxydo-réduction des mitochondries est un produit de réduction et d'oxydation des espèces dans l'organite, comprenant du NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, le glutathion / glutathion disulfure (GSH / GSSG) et les espèces réactives de l'oxygène (ROS). Découplage mitochondries ou hypoxie affecte l'activité respiratoire mitochondriale et modifie le rapport de NAD ⁺ en NADH dans l'organite. ROS, qui sont produits à partir de transfert d'électrons inefficace entre les complexes de la chaîne de transport des électrons dans la membrane mitochondriale interne, ainsi que de la désamination des amines par la monoamine oxydase dans la membrane mitochondriale externe ^5, les lipides des dommages, des protéines et des acides nucléiques et avoir été lié au vieillissement et les maladies neurodégénératives liées à l'âge ^6,7,8. ROS jouent également un rôle dans la transduction du signal en mitochondria, par oxydation du GSH. Par exemple, le NADH déshydrogénase contribue non seulement à la production de ROS, mais aussi est régulée par des interactions avec la piscine glutathion ^9,10. déshydrogénase α-cétoglutarate et aconitase, les composantes du cycle de Krebs, présentent une activité réduite en environnements oxydants ^11,12.

En effet, la régulation redox dépendant de l'activité aconitase est conservée, des bactéries aux mammifères ^13,14. Ainsi, la surveillance de l'état redox et les niveaux d'ATP des mitochondries est cruciale pour comprendre leur fonction et leur rôle dans la pathologie de la maladie.

Méthodes biochimiques ont été utilisés pour évaluer l'état d'oxydoréduction ou les niveaux d'ATP des cellules entières ou des mitochondries isolées. Méthodes largement utilisée pour évaluer l'état redox des cellules entières ou des mitochondries isolées sont basés sur la mesure des niveaux de la paire redox GSH / GSSG ^15. Le système luciférine-luciférase est couramment utilisé pour mesurer mitochondrialLes niveaux d'ATP dans les deux cellules entières perméabilisées ou les mitochondries isolées. ^{16,17,18,19,20} Dans cet essai, la luciférase se lie à l'ATP et catalyse l'oxydation de chimiluminescence et de luciférine. ²¹ L'intensité de la lumière émise est proportionnelle à la quantité de l'ATP dans le milieu réactionnel. ²²

Ces méthodes ont révélé des informations fondamentales sur la fonction mitochondriale, y compris la constatation que les patients atteints de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, ont des niveaux anormalement bas d'ATP. ²³ Toutefois, ils ne peuvent être utilisés à l'image vivants, des cellules intactes. En outre, les méthodes basées sur l'analyse de cellules entières fournissent une moyenne de l'état d'oxydoréduction ou les niveaux d'ATP dans tous les compartiments de la cellule. Mesures en organites isolés sont potentiellement problématique car l'état redox mitochondrial ou les niveaux d'ATP peuvent changer au cours du fractionnement subcellulaire. Enfin, des études récentes de notre laboratoire et d'autres indiquent quemitochondries dans les cellules individuelles sont hétérogènes en fonction, ce qui influe sur la durée de vie des cellules de la mère et la fille. ³ Ainsi, il est nécessaire de mesurer les niveaux d'ATP mitochondriale et de l'état d'oxydo-réduction dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire.

Les biocapteurs pour la fonction mitochondriale décrites ici sont toutes deux basées sur la GFP. GFP redox sensible (roGFP) ^24,25 est un variant de la GFP dans lequel cystéines exposées à la surface sont ajoutés à la molécule. roGFP, comme GFP de type sauvage, présente deux pics d'excitation (à ~ 400 nm et ~ 480 nm) et une pointe d'émission à ~ 510 nm. L'oxydation des résidus cystéine dans les résultats roGFP par une augmentation de l'excitation à ~ 400 nm. La réduction de ces cystéines favorise excitation à ~ 480 nm. Ainsi, le rapport entre l'émission de 510 nm lors d'une excitation de roGFP à 480 nm et 400 nm révèle la quantité relative de roGFP réduite et oxydée, qui reflète l'état d'oxydo-réduction de l'environnement du fluorophore.

Deux versions de roGFP sont largement utilisés: roGFP1 et roGFP2. Les deux contiennent les mêmes insertions de cystéine. roGFP1 sont basées sur le GFP de type sauvage et roGFP2 est basée sur S65T GFP, qui a une excitation efficace à 480 nm et inférieure d'excitation efficace à 400 nm par rapport à wtGFP ^24. roGFP1 est moins sensible au pH que roGFP2 et sa gamme dynamique s'étend plus loin dans la plage réduite. Ainsi, roGFP1 peut être plus utile pour surveiller les compartiments plus réducteurs tels que les mitochondries ou le cytosol, et des compartiments dont le pH est variable, comme les endosomes. roGFP2 propose signaux lumineux et, dans certaines études, une gamme dynamique supérieure à roGFP1 ^24,26. Des études chez Arabidopsis thaliana indiquent que le temps nécessaire pour une réponse à des changements dans l'état d'oxydo-réduction est similaire pour les deux capteurs (t ½ pour l'oxydation, 65 et 95 secondes et t ½ de la réduction, 272 et 206 secondes, par roGFP1 et roGFP2, respectivement) ^26.

MitGO-ATeam2 est un mini-invasive, fiablecapteur qui mesure ATP mitochondrial chez la levure Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam est un transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde qui se compose de la sous-unité ε du F _o F _1-ATP synthase en sandwich entre donneur de FRET et protéines fluorescentes accepteurs (GFP et orange fluorescent protein (OFP), respectivement). ²⁷ La liaison de l'ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements conformationnels de la protéine qui apportent le FRET donneur à proximité immédiate de l'accepteur et pour permettre un transfert d'énergie du donneur à l'accepteur. Il existe deux variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 et ATeam2. GO-ATeam2 a une plus grande affinité pour MgATP que GO-ATeam1, le rendant plus adapté pour mesurer le typiquement inférieure [ATP] dans les mitochondries par rapport au cytosol. ²⁷

Afin de sonder l'état redox mitochondrial, nous avons construit une protéine de fusion (mito-roGFP1) composé de roGFP1 fusionnée à la séquence leader ATP9 unend exprimé à partir d'une expression de levure centromere basé (faible nombre de copies) plasmide sous le contrôle de la forte glycéraldéhyde-3-phosphate (GPD) promoteur (p416GPD, Addgene). Nous avons utilisé roGFP1 pour sonder l'état d'oxydo-réduction des mitochondries dans le contexte de vieillissement du modèle champignon Saccharomyces cerevisiae. Nous constatons que roGFP1 peut détecter des changements dans l'état redox mitochondrial qui se produisent au cours du vieillissement et en réponse à la disponibilité des nutriments mais n'a aucun effet néfaste apparent sur des cellules de levure. Nous voyons aussi une variabilité dans l'état redox des mitochondries dans les cellules de levure de vie individuels, une constatation qui souligne l'importance d'un biocapteur avec une résolution spatiale subcellulaire.

MitGO-ATeam2 est une variante du GO-ATeam2, qui a la séquence signal mitochondrial du cytochrome c oxydase sous-unité VIII inséré à l'extrémité amino-terminale de GO-ATeam2 ^27. Nous avons modifié la sonde mitGO-ATeam2 (aimablement fourni par le laboratoire de H. Noji, Institut of recherche scientifique et industrielle, Université d'Osaka, Japon) pour une utilisation dans la levure par sous-clonage, via les sites HindIII Xba1 et, dans le vecteur d'expression de levure pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), qui est un faible nombre de copies de plasmide contenant le promoteur constitutif fort GPD. Nous avons exprimé mitGO-ATeam2 dans la levure bourgeonnante, et de trouver, par la contre avec la liaison à l'ADN colorant DAPI, qu'il localise exclusivement vers les mitochondries, où il sert comme une sonde efficace pour mesurer les changements physiologiques dans les niveaux d'ATP mitochondrial.

roGFP et GO-ATeam sont à la fois codées génétiquement. En conséquence, ils peuvent être introduits et maintenus de façon stable dans des cellules intactes, et fournissent des informations sur l'état d'oxydoréduction ou ATP dans les cellules vivantes, individuels. En outre, les deux biocapteurs surveiller les changements dans l'état d'oxydoréduction ou les niveaux d'ATP qui se produisent dans des conditions physiologiques. ²⁸ Les deux sondes sont également quotientométrique. En conséquence, les mesures faites avec ces sondes ne sont pas affectés par changes de concentration biocapteur ou un éclairage ou une épaisseur échantillon. Enfin, les deux biocapteurs offrent une résolution spatiale subcellulaire. En effet, roGFP a été ciblé à la mitochondrie, ER, les endosomes et les peroxysomes ^24, et peut détecter des changements dans l'état redox de chacun de ces organites, largement indépendantes du pH.

Protocol

1. Transformation des cellules de levure avec les biocapteurs

1. Transformer la souche de levure désirée avec plasmide portant mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 selon la méthode de l'acétate de lithium ^27.
2. Pour confirmer transformation avec le biocapteur plasmidique et pour éviter la perte du plasmide, sélectionner et maintenir transformants sur milieu complet synthétique sélectif approprié (SC-Ura pour mito-roGFP, ou SC-Leu pour mitGo-ATeam2). Si la sonde fluorescente a été sous-cloné dans un plasmide différent de ceux décrits ici, utiliser le milieu sélectif approprié. Visualisez transformants par microscopie à fluorescence pour confirmer qu'ils expriment le biocapteur fluorescent et de morphologie mitochondrial normal.

2. La croissance des cellules et la préparation pour l'imagerie

fonction cellulaire et la réponse au traitement de la toxicomanie sont fortement tributaires de la densité cellulaire et l'activité métabolique. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les cellulessont en division active (phase mid-log, ~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ cellules / ml). Le moyen le plus fiable pour produire des cultures en phase mi-log de densité uniforme est d'inoculer à partir d'une pré-culture en phase stationnaire.

1. Préparer une pré-culture en phase stationnaire: choisir une seule colonie de cellules transformées à partir d'une plaque et inoculer des milieux liquides sélectifs (5 ml dans un tube conique à fond 50 ml). Croître à 30 ° C sous agitation à 225 rpm jusqu'à ce que la densité optique de la culture à 600 nm _(DO600) a atteint un plateau (24-48 h).
2. Préparer une culture en phase semi-logarithmique pour l'observation: utiliser le volume approprié de pré-culture pour inoculer 5 ml de milieux sélectifs dans un tube conique à fond 50 ml. Médias YPD est autofluorescente et ne doit pas être utilisé pour ces études. Utilisez, glucose, sur la base abandon des supports synthétiques complètes (SC-Ura). Cultiver des cellules à 30 ° C, en agitant à 225 rpm, pendant 4-16 heures, jusqu'à ce qu'ils atteignent la phase semi-log (~ 0.5 - 1 x 10 ⁷ cellules / ml). La densité cellulaire peut être déterminéepar mesure de la DO _600; calibrer le spectrophotomètre pour déterminer la bonne _DO600 lecture. Sur notre Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), la phase semi-logarithmique correspond à une _DO600 de 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 détecte les fluctuations de l'organite en réponse à des changements métaboliques. Par exemple, dans cet essai mitochondriales changements d'état redox lorsque la levure pousse pas sur les sources de carbone fermentescibles (par exemple le glucose, comme dans les médias SC) et de sources de carbone non fermentescibles (par exemple le glycérol, comme dans les médias SGlyc), et même dans les différents lots de la même médias. Par conséquent, utiliser le même lot de médias pour toutes les expériences.

3. Les cellules sont prêtes pour la concentration (voir l'étape 2.4) et l'imagerie si aucun traitement n'est effectué. Si les cellules sont traitées, incuber les cellules avec le traitement approprié et passez à l'étape suivante.
4. Concentrez 1 ml de culture par centrifugation à 6000 g pendant 15 sec etremise en suspension du culot cellulaire dans 20 ul de médias. Ces conditions de maximiser le nombre de cellules distincts dans le champ de vision.
5. Appliquer 2 pl des cellules remises en suspension à une diapositive. Couvrir avec une lamelle (n ° 1,5, de préférence à haute performance 170 ± 5 um d'épaisseur), et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles ou valap (voir réactifs). Pour sceller avec valap, faire fondre une petite quantité sur une spatule métallique en le tenant sur une flamme du bec Bunsen, puis étaler une petite quantité sur les bords de la lamelle.
6. Maintenir les cellules à 30 ° C pendant l'imagerie. Un chauffe-objectif sur l'objectif à immersion d'huile 100x utilisés pour l'imagerie fonctionne bien pour cette application. Dans ces conditions, la morphologie mitochondriale, état redox et les niveaux d'ATP restent inchangés lors de l'imagerie pendant 10-15 min.

3. Configuration Imaging

1. Configuration pour l'imagerie mito-roGFP1 sur un microscope de fluorescence à champ large
   Les étapes sont ici adaptées à la AxioObserver.Z1 microscope équipé d'une source Colibri LED d'excitation, un grand champ Orca caméra ER et le logiciel d'acquisition Axiovision. Photoblanchiment des deux canaux et photoconversion de oxydés mito-roGFP1 est considérablement réduite en utilisant un éclairage à LED par rapport au mercure arc lampe d'éclairage (voir ci-dessous).
   Pour maximiser signal et résolution, utilisez l'ouverture numérique plus possible de l'objectif, et le plus faible grossissement qui offre une résolution spatiale suffisante. En outre, pour l'imagerie mito-roGFP, vérifiez que l'objectif transmet ainsi à 365 nm. Le 100x/1.3NA CE PlanNeofluar objectif (Zeiss) fonctionne bien pour cette application.
   Configurez le logiciel d'acquisition pour capturer les espèces mito-roGFP1 oxydé et réduit. Nous utilisons les conditions suivantes.
   1. Configurez le canal pour oxydé mito-roGFP à utiliser excitation à 365 nm (100% LED de puissance) et un filtre d'émission approprié pour la GFP, comme le 38 HE set (Zeiss), avec la excitatio inclusFiltre n retiré du cube. L'élimination du filtre à l'excitation permet l'excitation à la fois 365 nm et 470 nm, sans avoir à changer les filtres, augmentant ainsi la résolution de temps réalisables.
   2. Configurer le canal pour réduire mito-roGFP utiliser excitation à 470 nm (100% LED de puissance) et, comme mentionné ci-dessus, le même cube filtre d'émission utilisé pour la oxydé mito-roGFP. Réglez l'appareil photo 1x1 binning pour optimiser la résolution spatiale.
   3. Réglez le logiciel à acquérir az pile constituée de 11 tranches avec un espacement de 0,5 um, la collecte de deux canaux à chaque position z. Ce mode d'acquisition est plus lente que l'acquisition de chaque pile z, à son tour, mais il empêche les artefacts provenant de mouvement mitochondrial entre l'acquisition des chaînes oxydées et réduites.
   4. plusieurs cellules d'image pour déterminer un temps d'exposition approprié, produire un signal de saturation forte mais pas. Il est important de maintenir le ratio de temps d'exposition pour oxydé et réduit mito-roGFP1 pour tout expérimenters. Par exemple, si les temps d'exposition pour oxydé et réduit mito-roGFP1 sont 300 et 100 msec, respectivement, le temps d'exposition pour oxydé mito-roGFP1 devrait être 3 fois plus que pour réduire mito-roGFP pour toutes les expériences.
2. Configuration pour l'imagerie mitGO-ATeam2 sur un microscope confocal spectral
   Pour quantifier les niveaux d'ATP en utilisant mitGO-ATeam2, la fluorescence de la GFP (émission maximale 510 nm) doit être distinguée de celle de OFP (maximum d'émission 560 nm). Il ya des jeux de filtres de fluorescence qui résolvent la fluorescence émise par ces fluorophores. Cependant, nous constatons qu'un détecteur spectral, disponible sur de nombreux balayage laser microscopie confocale, qui fonctionne le mieux pour cette application. Un détecteur spectral sépare l'émission de fluorescence en plusieurs composantes (généralement 32 ou plus) selon la longueur d'onde. Plusieurs bandes de longueurs d'onde adjacents peuvent être combinés en une voie d'image. Les longueurs d'onde à combiner sont choisis de manière empirique afin de maximiser signal GFP et OFP tout en évitant croisement de signal qui serait confondre la mesure de FRET. Utilisez l'objectif d'ouverture numérique élevée disponible. Nous utilisons un 100x/1.49 ou 60x/1.49 objectif Apo-FRBR. Nous utilisons le Nikon A1R microscope confocal exécutant le logiciel NIS Elements. Configurez le logiciel d'acquisition pour capturer les espèces mitGO-ATeam2 liée à l'ATP et ATP-lié. Nous utilisons les conditions suivantes.
   1. Set sténopé à 1,0 unités Airy (UA), qui sur notre système correspond à la résolution az d'environ 0,42 um.
   2. Réglez le zoom de numérisation d'approcher la limite de Nyquist, ce qui permettra de maximiser l'information spatiale dans l'image. Sur notre système, la taille du pixel est de 0,12 um.
   3. Parce que les mitochondries peuvent se déplacer lors de l'imagerie, il peut être utile d'augmenter la vitesse d'imagerie en recadrant le champ à 512 x 256 pixels. Le temps total nécessaire à l'image d'une image dans notre système est de 1,0 sec, y compris un moyen de balayage de 2 fois. Selon la résolution spatiale souhaitée, le domaine peut encore être recadrée pour de pluse de résolution temporelle.
   4. Excite à 488 nm, et de recueillir des émissions de 500 à 520 nm pour la GFP, et de 550 à 580 nm pour OFP. Valeurs optimales réels peuvent varier selon les caractéristiques du système d'imagerie.
   5. La puissance du laser optimale pour notre système est compris entre 6,0 et 6,4%. La puissance du laser optimale variera pour chaque système de microscope, mais idéalement être aussi bas que possible tout en produisant une image interprétable. Utilisez un mesureur de puissance interne ou externe à suivre l'évolution de la puissance du laser, qui se produisent normalement au fil du temps dans tout système optique.
   6. Régler le gain du détecteur et l'intensité de la lumière d'éclairage afin de maximiser l'intervalle de valeurs de pixel détecté mais ne pas saturer le signal, pour autant de cellules que possible. Ne pas analyser toutes les cellules contenant plus de 1% pixels saturés. Image Tous les échantillons en utilisant le même objectif, la puissance du laser, balayage zoom, la taille des pixels, le gain et offset.

4. Image Acquisition

1. Localisez le pla focal n des cellules d'intérêt à l'aide de la lumière transmise afin de minimiser le blanchiment de la sonde fluorescente.
2. Après localiser une ou plusieurs cellules d'intérêt, de recueillir une série Z à travers toute la profondeur d'une cellule typique (à 7 um) en utilisant une taille de pas de 0,5 pm.
3. Image d'autres cellules d'intérêt sur la diapositive, mais ne pas l'image d'une diapositive pendant plus de 15 min. Après 15 minutes, sur la diapositive, les cellules perdent leur viabilité.

5. Analyse

Taux d'ATP mitochondriale est déterminée en mesurant le rapport de l'émission mitGO-ATeam2 à 560 nm à celle à 510 nm ²⁷ l'état redox de l'organelle est mesurée par la diminution de oxydée (R / S) Rapport de mito-roGFP;. Soit émission à 510 nm après excitation à 470 nm divisée par une émission à 510 nm après excitation à 365 nm. Avant de calculer le rapport, nous soustrayons fond et déterminer une valeur seuil pour les pixels appartenant aux mitochondries fluorescent.

tente "> Domaine public (par exemple ImageJ ³⁰⁾ ou disponibles dans le commerce (par exemple Volocity, Perkin-Elmer) logiciel peut être utilisé pour l'analyse des mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam2. Selon le logiciel utilisé pour l'acquisition d'images et d'analyse, les images peut d'abord être converti en un autre format, tel que TIFF, avant de les ouvrir dans le logiciel d'analyse. Si les images sont converties, il est essentiel de vérifier que les valeurs de pixels ne sont pas modifiés au cours de la conversion. L'analyse des données mito-roGFP1, à l'aide deux programmes sont décrits ci-dessous. menus du programme et des options à choisir au sein de chaque menu sont marquées en italique gras.

5.1 analyse ImageJ

1. Ouvrir les images et le type de changement à 32 bits: image → → type 32 bits.
2. Dessiner une région d'intérêt (ROI) dans une zone où il n'y a pas de cellules. Calculer l'intensité moyenne dans ce ROI: Analyser → Mesure.
3. Soustraire le fond de la moyenne calculée à partir de la pile: Processus → Math → Soustraire.
4. En utilisant le z-stack soustrait, trouver la tranche moyenne et le seuil sur les mitochondries: image → Ajuster → Seuil et cliquez sur Appliquer dans la fenêtre de seuil. Appliquer à toutes les tranches de la pile. Cochez la case Définir des pixels de fond à NaN.
5. Créer le rapport z pile: Processus → Calculatrice de l'image Diviser la pile réduite par le z pile oxydé pour l'analyse mito-roGFP1. Diviser la nm image de 560 (ATP bound) par les 510 nm d'image (ATP non liée) pour l'analyse mitGO-ATeam2.
6. Dessinez un retour sur investissement autour de la zone d'intérêt. Choisissez Analyser → Outils → ROI Manager et cliquez sur Ajouter pour enregistrer le retour sur investissement. Plusieurs régions peuvent être stockés dans le gestionnaire. Dans ROI gestionnaire, sélectionnez toutes les ROI, puis choisissez Mminerai → Multi-mesures pour mesurer toutes les tranches de la pile. Exporter des données vers un tableur pour analyse.

5.2 Analyse des Volocity

1. Importer des images dans une bibliothèque de Volocity et créer une séquence d'images avec deux canaux.
2. Dessiner une région d'intérêt (ROI) dans une zone où il n'y a pas de cellules. Choisissez Outils → Ratio.
3. Utilisez Volocity pour calculer le fond: Recevez De retour sur investissement.
4. Réglez le seuil d'inclure structures mitochondriales.
5. Cochez l'option d'appliquer une LUT arc en ciel sur le canal de ratio. Le canal à modulation d'intensité peut produire une image moins bruyant pour présentation, mais il ne doit pas être utilisé pour la quantification de ratio moyen.
6. Sélectionnez l'onglet mesure, sélectionnez le canal de rapport et d'en tirer un retour sur investissement autour de la zone d'intérêt. Mesurer le canal de rapport, à l'exception des valeurs nulles. Plusieurs régions peuvent être choisies et doséesdans le même temps. Exporter des données vers un tableur pour analyse.

Representative Results

Mesurer l'état redox mitochondrial avec mito-roGFP

Ici, nous montrons que mito-roGFP1 a la plage dynamique pour détecter des changements dans l'état redox mitochondrial totalement oxydé à réduit dans les cellules de levure vivante, sans affecter la croissance des cellules de levure ou de la morphologie mitochondriale. Tout d'abord, nous trouvons les cellules exprimant la GFP mitochondries ciblée et roGFP1 croître à des taux normaux (figure 1A). Le taux de croissance maximale, telle que mesurée par la pente maximale de la courbe de croissance au cours de la croissance en phase logarithmique et le temps pour atteindre le taux de croissance maximal, est similaire dans les cellules exprimant mito-GFP et mito-roGFP1. En outre, les mitochondries de la levure exprimant mito-roGFP1 exposition morphologie de type sauvage (figure 1B). Plus précisément, ils sont tubulaires, s'alignent le long de l'axe mère-bud, et s'accumulent au bout des cellules mère et fille. Depuis dysfonctionnement mitochondrial induit souvent fragmentation, cette morphologie normale soutient l'idée que mito-roGFP1 faitperturbe pas la fonction mitochondriale.

Pour évaluer la dynamique de mito-roGFP1, nous avons traité la phase des cellules de levure de type sauvage mi-journal avec du peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂₎ et dithiothréitol (DTT), respectivement, et mesuré le ratio R / O mitochondrial moyen d'évaluer mitochondrial état redox (Figure 2). Titration avec H ₂ O ₂ ou TNT 0-10 résultats mM à un changement dose-dépendante ratio moyen cellulaire R / O avec une plage de mesure de 0,6 (dans des conditions oxydantes) à 1,23 (dans des conditions réductrices). Ainsi, mito-roGFP1 est un biocapteur efficace pour l'analyse de l'état redox mitochondrial dans les cellules vivantes.

Mito-roGFP1 offre également la résolution subcellulaire de l'état redox mitochondrial. Cette résolution subcellulaire révèle que les mitochondries dans les cellules de levure individuels diffèrent en état redox relative. Si mitochondries dans une cellule de levure unique sont fonctionnellement distincte, il est possible que l'y sont activement ou passivement distincts (Figure 3). Cette ségrégation pourrait contribuer à l'âge mère-fille asymétrie et le rajeunissement des cellules filles. Ce constat souligne la nécessité d'un biocapteur avec une résolution subcellulaire de l'état redox mitochondrial.

Il a longtemps été connu ³¹ que la lumière peut induire des changements dans le chromophore GFP. Lors de l'exposition à une lumière de haute intensité nm 400, roGFP1 subit photoconversion à une espèce ayant un spectre d'émission différent ^26. Quand photoconversion se produit, il ya une diminution d'émission de vert oxydé mito-roGFP1 et une augmentation des émissions vert lors de l'excitation de la réduction des mito-roGFP1, qui modifie le rapport de R / O mito-roGFP1 (figure 4B). Utilisant une excitation (par exemple l'éclairage à 40% en utilisant les LED de la source de lumière Colibri 400 nm) de faible intensité, il n'ya pas de photoconversion significative au cours de la période analysée (figure 4C). Le p moyen visé à réduire photoconversion est d'exciter la forme oxydée de roGFP à 365 nm (voir la discussion).

Mesure ATP mitochondrial avec mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 se localise dans les mitochondries lorsqu'il est exprimé dans les cellules de mammifères. ²⁷ Nous constatons que mitGO-ATeam2 colocalise avec l'ADN mitochondrial DAPI teinté dans la levure, et se retrouve dans des structures tubulaires typiques de levure de type sauvage mitochondries (figure 5A). Ainsi, nous avons vérifié que la séquence de ciblage mitochondrial de la cytochrome c oxydase mammifères unité VIII localise la sonde vers les mitochondries de la levure sans perturber la morphologie mitochondriale. En outre, nous constatons que le taux de croissance de cellules exprimant mitGO-ATeam2 est similaire à celle des cellules exprimant la GFP mitochondries ciblée en glucose et médias de glycérol (figure 5B). Ainsi, l'expression de mitGO-ATeam2 ne semble pas délétère pour la cellule ou les mitochondries.

_content "> Ensuite, nous avons testé si le mitGO-ATeam2 FRET répond à des changements dans les niveaux d'ATP mitochondriale. Pour ce faire, nous avons traité les cellules avec antimycine A, un agent qui se lie au cytochrome c réductase, inhibe l'oxydation de l'ubiquinol dans la chaîne de transport des électrons , perturbe le gradient de protons, et inhibe la production d'ATP mitochondrial. ²⁰ La médiane FRET rapport diminue dans les cellules traitées avec Antimycin A (Figure 6C).

Compte tenu de la preuve que mitGO-ATeam2 est un biocapteur efficace pour ATP mitochondrial, nous avons utilisé cette sonde pour surveiller les niveaux d'ATP mitochondrial de la levure qui ont été propagées à l'aide d'une source de carbone fermentescible ou non fermentescible (figure 6A et 6B). La réduction de la superficie totale fluorescent dans les cellules cultivées en glucose a confirmé que le glucose résultats de la répression d'une diminution de l'abondance des mitochondries. Nous notons variation de cellule de la cellule dans le niveau de mitGO-ATeam2. Fait intéressant, les données préliminaires indiquent qu'il ya ma y avoir des différences dans les niveaux d'ATP dans les mitochondries différents dans la même cellule (figure 6D).

Figure 1. Mito-roGFP1 détecte état ​​redox mitochondrial sans affecter les taux de croissance des cellules ou de la morphologie mitochondriale. (A) la croissance de la levure qui expriment la GFP mitochondries ciblée ou ro-GFP1 a été mesurée comme le changement de la densité optique à 600 nm en fonction du temps de la croissance en milieu liquide SC-Ura à 30 ° C. (B) panneaux supérieurs: morphologie mitochondriale normale et le canal de la localisation dans les images brutes. Panneaux inférieurs: images Ratio montrent la voie réduite divisé par le canal oxydée (référence de couleur à droite). Les images montrent l'effet du choix de seuil sur les résultats. Le seuil optimal comprend des structures mitochondriales et exclut fond.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 2. Mito-roGFP1 détecte les changements de l'état redox mitochondrial en réponse au traitement avec du peroxyde d'hydrogène ou des cellules de levure de phase mi-log dithiotréitol. (AB) exprimant mito-roGFP1 ont été incubés dans les médias SC-Ura sans traitement (0) ou avec les concentrations indiquées de H ₂ O ₂ ou DTT pendant 20 min à 30 ° C (A) les projections d'intensité maximale des images de ratio mito-roGFP1 R / O sont superposées sur les images lumineuses transmises, qui montrent des contours cellulaires. La référence de couleur pour mito-roGFP1 est indiqué en haut à droite. Bar:. 5 um (B) Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 3. Mito-roGFP1 offre une résolution subcellulaire de l'état redox mitochondrial. Une projection d'intensité maximale du canal de rapport mito-roGFP1 R / O est superposée sur une image de lumière transmise. La référence de couleur pour mito-roGFP1 est indiqué en haut à droite. Bar: 5 pm. Cette cellule particulière a un rapport moyen R / O mito-roGFP1 de 0,88. Cependant, personne mitochondries à l'intérieur de cette cellule montrent différents états redox. Les chiffres indiqués sont les mito-roGFP1 ratio calculé R / O pour différentes re mitochondrialgions. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 4. Excitation à haute intensité conduit à photoconversion et mito-roGFP1 ratios altéré R / S. Levure de phase semi-logarithmique exprimant mito-roGFP1 ont été illuminés avec 400 nm lumière à 40% (A) ou 100% (B) alimenté par une source de lumière LED , et la fluorescence de oxydé et réduit mito-roGFP1 a été capturé toutes les 4 secondes. Les images présentées sont des projections maximales dans les couleurs qui représentent le ratio R / O de mito-roGFP1 (voir échelle des couleurs en bas à droite). Bar:. 5uM (C) Le ratio R / O de mito-roGFP1 resté constant au cours de la période de l'imagerie lors de l'éclairage à 40% de la puissance LED. Cependant, lors de l'illumination à 100% de la puissance LED, nousobserver un changement en fonction du temps dans un rapport R / S des mito-roGFP1, qui reflète photocommutation du fluorophore. Les carrés noirs, 40% de la puissance LED;. Diamants gris, 100% Power LED Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 5. MitGO-ATeam2 se localise dans les mitochondries de la levure et n'affecte pas les taux de croissance des cellules de levure. (A) Les cellules de levure exprimant mitGO-ATeam2 ont été cultivées jusqu'à la phase semi-log, fixée à l'aide de paraformaldéhyde et colorées avec la liaison à l'ADN colorant DAPI, comme décrit précédemment . ¹⁹ Les images présentées sont des prévisions au maximum d'intensité de déconvolutée z-series. Pour plus de simplicité, les images mitGO-ATeam2 ont été obtenus en utilisant un filtre GFP conventionnel, alors qu'ils ne représentent que la population non liée à l'ATP. Cell Outlignes apparaissent en blanc. N: ADN nucléaire. ADNmt: l'ADN mitochondrial. Bar: 1 pm (B) courbes de croissance des cellules de levure de type sauvage exprimant la GFP mitochondries ciblée ou mitGO-ATeam2 à base de glucose (SC) et à base de glycérol (SGlyc) milieu liquide à 30 ° C.. Ces données sont la moyenne des quadruplicates pour chaque souche à chaque point de temps, et est représentative de deux expériences indépendantes. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 6. Mesures MitGO-ATeam2 changements dans les niveaux d'ATP dans les mitochondries de levure à une résolution subcellulaire et suborganellar. (AB) Emission de mitGO-ATeam2 de la GFP (510 nm) et OFP (560 nm), et la quantification du taux d'émission de 560/510 nm de la levure cellules cultivées pendant la nuit dans glucoSE basé (SC) (A) ou à base de glycérol (SGlyc) (B) des médias. La couleur de référence pour le canal de rapport 560/510 est affiché en bas à droite. Bar: 1. Um (C) Quantification du rapport 560/510 pour les cellules propagées dans les médias SGlyc avec ou sans antimycine A (2 pg / ml) pendant 1 heure à 30 ° C. La baisse des niveaux d'ATP sur antimycine Un traitement est statistiquement significative (test de signification Kruskal-Wallis). (D) 560 nm/510 ratio nm de mitGO-ATeam2 d'une phase cellulaire de type sauvage mi-log propagée sur les médias SC. La couleur de référence pour le canal de rapport 560/510 est affiché en bas à droite. Le contour de la cellule est représenté en blanc. Le ratio moyen 560/510 nm pour l'ensemble de la cellule est de 0,43. Les chiffres indiqués sont les ratios 560/510 nm de régions spécifiques dans les mitochondries. Bar: 1 um. Cliquez ici pour agrandir la figure.

Discussion

Ici, nous décrivons les méthodes à utiliser mito-roGFP1 et mitGO-ATeam2 comme biocapteurs pour évaluer l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP dans les cellules de levure vivante. Nous constatons que l'expression du plasmide d'origine mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam résultats dans le ciblage quantitatif aux mitochondries, sans aucun effet évident sur ​​la morphologie ou la distribution mitochondrial ou sur les taux de croissance cellulaire. ³ Mito-roGFP1 peut détecter des changements dans l'état redox mitochondrial de très oxydé aux Etats fortement réduits. De même, mitGO-ATeam peut mesurer les changements dans les niveaux d'ATP mitochondrial qui se produisent dans la levure en cours de croissance axée sur la respiration et la levure traitées avec un inhibiteur de la respiration. En outre, puisque les deux biocapteurs offrent une résolution subcellulaire, ils peuvent détecter l'hétérogénéité dans l'état redox ou les niveaux d'ATP des mitochondries dans les cellules individuelles. Enfin, depuis deux biocapteurs sont des sondes ratiométriques, ils ne sont pas affectés par les changements de concentration ou de la variabilité de l'épaisseur de l'échantillon ou de mauvaisumination. Ces sondes permettent une approche minimalement invasive pour étudier la fonction mitochondriale avec une résolution subcellulaire dans les cellules vivantes.

Pour appliquer cette méthode avec succès, les images doivent être acquises avec le possible le ratio maximum signal-sur-bruit. Une première étape importante consiste à examiner les cellules de 10 à 20 colonies transformées sous le microscope et choisir celles avec fluorescence robuste et la morphologie mitochondriale normale et les taux de croissance. Ensuite, les conditions d'imagerie doivent être optimisés pour produire élevé, mais pas saturer, les intensités sans causer de photovieillissement de la protéine fluorescente ou les cellules. Quelques cellules dans une population (<1%) peuvent avoir fluorescence globale inhabituellement élevé ou faible en raison de la variation du nombre de copies du plasmide, ceux-ci peuvent être ignorées en faveur de capturer des images interprétables de la majorité des cellules.

Bien que les avantages de mito-roGFP sont clairs, il est également important d'être conscient des pièges potentiels. Nous détectonsdifférences de potentiel redox mitochondrial non seulement avec des différences sources induites carbone dans le métabolisme cellulaire, mais aussi lors de la propagation de la levure dans différents lots du même milieu. Ainsi, il faut prendre soin lors de la sélection des milieux de culture de cellules pour des mesures redox mitochondrial. En outre, bien mito-roGFP offre une résolution spatiale sans précédent de l'état redox mitochondrial, résolution temporelle de roGFP n'est pas suffisante pour détecter des éclats de ROS qui sont associés à ROS transduction du signal ^31. Enfin, il faut prendre soin lors du choix de la longueur d'onde et de l'intensité d'excitation pour la forme oxydée de roGFP. Illumination à 400 nm excite de façon optimale les espèces oxydées de roGFP. Cependant, il excite aussi roGFP réduit dans une large mesure par rapport à une excitation à 365 nm. Cela conduit à une sensibilité réduite à mesurer l'état redox mitochondrial. De plus, l'exposition des mito-roGFP1 à l'illumination de haute intensité à 400 nm conduit à photoconversion de la protéine à une spécifications avec des propriétés spectrales altérées. Nous n'avons pas vu photoconversion lors de l'éclairage de haute intensité à 365 nm. Par conséquent, nous vous recommandons d'excitation 365 nm en utilisant si possible.

MitGO-ATeam2 a aussi ses limites. Par exemple, depuis mitGO-ATeam2 est elle-même une protéine peut être endommagé par des insultes cellulaires, y compris les espèces réactives de l'oxygène, ce qui peut nuire à son activité biocapteur. En outre, la GFP et des longueurs d'onde d'émission OFP (510 et 560 nm) doivent être résolus pour FRET analyse, ce qui peut s'avérer difficile sur des microscopes à fluorescence conventionnels.

Contrairement aux dosages enzymatiques in vitro, ces tests cellules vivantes signalent les changements relatifs dans mitochondriale d'ATP ou de l'état d'oxydo-réduction, et ne mesurent pas la concentration absolue de l'ATP ou de la cystéine réduit. Même si une courbe standard pourrait théoriquement être généré en mesurant la réponse des protéines de capteur dans la solution, cela pourrait ne pas s'appliquer à l'environnement moléculaire différente dans les mitochondries. Ther vant, ces essais fournissent un moyen de comparer les cellules dans des conditions différentes. En outre, les conditions d'imagerie varient, donc les valeurs des rapports exacts acquises sur une configuration d'imagerie peuvent ne pas être répliquées sur un autre.

Ces techniques d'imagerie du rapport peuvent être adaptées à d'autres indicateurs ratiométriques, y compris les autres roGFP ou isoformes GO-ATEAM et autres sondes fonctionnelles. Le choix de la microscopie à champ large ou confocal dépendra de la sonde et la résolution spatiale nécessaire. Procédé grand champ a été utilisé ici pour mito-roGFP car elle permet une excitation à 365 nm, ce qui améliore la sensibilité et la stabilité du capteur. La méthode confocal avec un détecteur spectral, tel qu'il est utilisé ici pour mitGO-Ateam, offre un moyen pratique pour éliminer croisement des émissions en ajustant les fenêtres de détection spectrales. Cependant, il est possible de réaliser des expériences similaires en microscopie à champ large à l'aide de filtres personnalisés ou éliminer croisement de calcul.

ntent "> La difficulté la plus fréquente dans ce type d'expérience d'imagerie est un signal insuffisant. matériel d'imagerie (en particulier l'objectif et le détecteur) est essentielle pour recueillir un signal suffisant pour interpréter les données.

Les étapes de seuillage ont une grande influence sur les résultats, comme l'inclusion des pixels de fond peut freiner les tendances dans les rapports obtenus. Des méthodes automatiques sont préférables, mais en raison de signal limité, seuillage manuel est souvent la meilleure méthode disponible. Si les seuils manuelles sont utilisées, les critères utilisés doivent être articulées aussi bien que possible, et l'analyse peuvent avoir besoin d'être effectuée aveugle ou par différents expérimentateurs de démontrer la reproductibilité. Des expériences de contrôle avec antimycine A (pour mitGO-Ateam2) et H ₂ O ₂ ou TNT (pour mito-roGFP) peuvent être utilisés pour confirmer les changements prévus dans les rapports de fluorescence.

Mito-roGFP et mitGO-ATeam2 sont non-invasives, des sondes pour la surveillance ratiométriques mitoremise en forme chondrial dans les cellules de levure vivante. Les capteurs ratiométriques utilisées ici ont été ciblés vers les mitochondries par la fusion des séquences de signaux aux mitochondries spécifiques. D'autres compartiments cellulaires pourraient être étudiés avec l'ajout de séquences de ciblage appropriées aux capteurs originaux. En outre, il est possible de combiner deux de ces capteurs avec des marqueurs fluorescents complémentaires (par exemple pour les organelles ou des facteurs de signalisation) ou des capteurs (par exemple pour le calcium) pour mesurer simultanément plusieurs processus dans des cellules vivantes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/