Summary
我々は、生きた酵母細胞における細胞内解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを監視するために、GFPをもとにしている2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用が記載されている。
Abstract
ミトコンドリアはエネルギー代謝や細胞の寿命とプログラム細胞死を制御するカルシウムの恒常性から、多くの細胞プロセスで役割を持っている。これらのプロセスには影響を与え、ミトコンドリアでの酸化還元状態とATP産生の影響を受けている。ここでは、酵母細胞を生きた細胞内での解像度でミトコンドリアの酸化還元状態およびATPレベルを検出できる2つのレシオメトリック、遺伝的にエンコードされたバイオセンサの使用を記載している。ミトコンドリアの酸化還元状態は、ミトコンドリアマトリックスを標的とレドックス感受性緑色蛍光タンパク質（roGFP）を用いて測定される。水戸roGFPは、順番に、タンパク質の励起スペクトルを変えるリバーシブルと環境依存の酸化還元を受ける位置が147とGFPの204でシステインを含んでいます。 MitGO-ATeam F O F 1-ATPシンターゼのεサブユニットとの間に挟まれたフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブはドナー及びアクセプター蛍光のFRETされているrescentタンパク質。もたらすタンパク質における立体構造変化εサブユニット結果にATPの結合は近接ドナーとアクセプターとのFRETドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする。
Introduction
ミトコンドリアは、アミノ酸、脂肪酸、ヘム鉄硫黄クラスターおよびピリミジンのATP産生合成に必須の細胞小器官である。ミトコンドリアはまた、カルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている、とアポトーシスの制御インチパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、およびハンチントン病を含む老化や加齢に伴う疾患にミトコンドリア1増やす証拠リンクしています。2個人がで彼らの全体の生活をしながら神経変性疾患に関連付けられているミトコンドリアタンパク質の変異は、病気の症状だけでその後の人生で起こる。これは、その変化が出現する疾患は病理許す年齢とともにミトコンドリアで発生することを示します。確かに、ミトコンドリアの適性が全体細胞の健康と寿命酵母および哺乳類細胞と相関している。ここ3,4、我々はmitocの2つの重要な機能を評価するために、遺伝的にコード化され、レシオメトリック蛍光バイオセンサーを使用する方法について説明します酵母細胞を生体内でhondria：レドックス状態とATPレベル。
有酸素エネルギー動員におけるミトコンドリア機能が十分に確立されている。ミトコンドリアの酸化還元状態は、NAD + / NADH、FAD / FADH 2、NADP + / NADPH、グルタチオン/グルタチオンジスルフィド（GSH / GSSG）と活性酸素種（ROS）を含む、オルガネラの種を還元し、酸化生成物である。ミトコンドリアまたは低酸素脱共役するミトコンドリア呼吸活性に影響を及ぼすとオルガネラにNADHにNAD +の比率を変更します。ミトコンドリア内膜における電子伝達鎖の複合体との間の非効率的な電子移動から、並びにミトコンドリア外膜5、破損脂質、タンパク質、および核酸におけるモノアミンオキシダーゼを介してアミンの脱アミノ化から製造し有するROS、 6,7,8老化や加齢に伴う神経変性疾患にリンクされて。 ROSはまたメートルのシグナル伝達に関与するitochondria、GSHの酸化による。例えば、NADHデヒドロゲナーゼは、ROS産生に寄与するだけでなく、グルタチオンプール9,10との相互作用を介して調節される。 α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとアコニターゼ、TCAサイクルのコンポーネントは、環境の11,12を酸化で還元活性を示す。
実際、アコニターゼ活性のレドックス依存性調節は、細菌から哺乳類13,14に保存されている。したがって、酸化還元状態とミトコンドリアのATP濃度を監視することは、疾患の病理にその機能と役割を理解する上で重要です。
生化学的方法は、酸化還元状態又は全細胞または単離されたミトコンドリアのATPレベルを評価するために使用されている。全細胞やミトコンドリア孤立の酸化還元状態を評価するため、広く用いられている方法は、酸化還元対GSH / GSSG 15のレベルを測定することに基づいています。ルシフェリン - ルシフェラーゼ系は、一般に、ミトコンドリア測定するために使用されるミトコンドリア膜透過し、全細胞又は単離されたいずれかATPレベル。16,17,18,19,20このアッセイにおいて、ルシフェラーゼ量に比例するATPに結合し、ルシフェリンの酸化の化学発光を触媒する。21の出射光の強度反応混合物中のATP。22の
これらの方法は、アルツハイマー病などの神経変性疾患を有する患者は、異常に低いATPレベルを有するという発見を含むミトコンドリア機能に関する基本的な情報を明らかにした。23しかし 、それらは画像の生活に使用されることができない、無傷の細胞。また、全細胞分析に基づく方法は、セルのすべてのコンパートメント内レドックス状態またはATPレベルの平均を提供する。ミトコンドリアの酸化還元状態やATPレベルは細胞下分画中に変更される可能性があるため孤立した小器官での測定は、潜在的に問題がある。最後に、我々の研究室等からの最近の研究では、ことを示している個々の細胞内のミトコンドリアが交互に母と娘細胞の寿命に影響を与える機能、不均質であるので、3つの細胞内解像度を有する生細胞におけるミトコンドリアATPレベルおよび酸化還元状態を測定する必要がある。
ここで説明するミトコンドリア機能のためのバイオセンサーは、両方のGFPに基づいています。レドックス感受性GFP（roGFP）24,25は、表面露出システインが分子に付加されたGFP変異体である。 roGFPは、野生型GFPのように、2つの励起ピーク（〜400 nmおよび480 nmで〜）および〜510nmで少なくとも一つの発光ピークを有する。 〜400 nmでの励起の増加roGFP結果中のシステイン残基の酸化。それらのシステインの減少は〜480 nmで励起を好む。これにより、480 nmおよび400 nmでの励起roGFP 510nmでの発光の比率は、フルオロフォアの環境の酸化還元状態を反映低減および酸化roGFPの相対量を明らかにする。
二つVERSroGFPのイオンが広く使用されています：roGFP1とroGFP2。どちらも同じシステインの挿入が含まれています。 roGFP1は、野生型GFPに基づいており、roGFP2はwtGFP 24に比べて400 nmで480 nmでのより効率的な励起の少ない効率的な励起を持っS65T GFP、に基づいています。 roGFP1はroGFP2とそのダイナミックレンジが減少の範囲にさらに拡張するよりも敏感な小さいpHである。したがって、roGFP1は以上の還元などのミトコンドリアなどの区分や細胞質ゾル、そのようなエンドソームなどの変数のpHとコンパートメントを監視するためのより便利かもしれません。 roGFP2が明るく信号と、いくつかの研究で、roGFP1 24,26よりも大きなダイナミック·レンジを提供しています。 シロイヌナズナにおける研究では、酸化還元状態の変化に対応するために必要な時間は、両方のセンサ（T½酸化のために、65と95秒とt½それぞれroGFP1とroGFP2ための削減、272および206秒、など）についても同様であることを示している。26
MitGO-ATeam2は、信頼性、低侵襲である出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）でミトコンドリアのATPを測定するセンサ。 GO-ATeamは、ドナーとアクセプター蛍光タンパク質（GFPおよびオレンジ（OFP）蛍光タンパク質をそれぞれ）FRET F プレーヤーの間に挟まれたF 1-ATPシンターゼのεサブユニットから構成されるフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）プローブである。27アクセプターの近くにドナーをFRETドナーからアクセプターへのエネルギー伝達を可能にさせるタンパク質の立体構造変化におけるεサブユニット結果にATPの結合。 GO-ATeam、GO-ATeam1とGO-ATeam2の二つの変種があります。 GO-ATeam2は、ミトコンドリア内で細胞質ゾルに比べて一般的に低い[ATP]を測定するための、それがより適切な意思、GO-ATeam1よりMgATPに対して高い親和性を持っています27
ミトコンドリアの酸化還元状態を調べるために、我々はATP9リーダー配列に融合roGFP1からなる融合タンパク質（水戸roGFP1）を構築しndは強いグリセルアルデヒド-3 - リン酸デヒドロゲナーゼ（GPD）プロモーター（p416GPD、Addgene）の制御下でプラスミドセントロメア系（低コピー数）酵母発現から発現。我々はモデル菌サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の老化の文脈でミトコンドリアの酸化還元状態を調べるためにroGFP1を使用していました。我々はroGFP1、老化中および栄養可用性に応じて発生するが、酵母細胞には明らかな有害な影響を及ぼさないミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出できることがわかります。また、個々の生きている酵母細胞内のミトコンドリアの酸化還元状態の変動、細胞内の空間分解能でバイオセンサーの重要性を強調している知見を参照してください。
MitGO-ATeam2はGO-ATeam2のアミノ末端に挿入シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIIIAのミトコンドリアシグナル配列を持つGO-ATeam2の変種です。27私たちは、親切にHの研究室が提供するmitGO-ATeam2プローブ（修正野地研究所Oプラスミド低コピーである酵母発現ベクターpAG415GPD-CCDB（Addgene、ケンブリッジ、MA、USA）にXba1とHindIII部位を経由して、それをサブクローニングすることにより酵母で使用するためのfの科学産業研究、大阪大学、日本）、強力な構成GPDプロモーターを含む。私たちは、出芽酵母でmitGO-ATeam2を表明し、それがミトコンドリアのATPレベルの生理的変化を測定するための効果的なプローブとして機能し、それがミトコンドリアに排他的に局在し、DNA結合色素DAPI、、との対比により、見つける。
roGFPとGO-ATeamは、遺伝的にコードされている両方。結果として、それらが導入され、安定的に維持無傷の細胞において、酸化還元状態または個々の、生細胞内ATPレベルに関する情報を提供することができる。さらに、両方のバイオセンサーは、酸化還元状態や生理的条件下で発生するATPレベルの変化を監視します28両プローブもレシオメトリックである。その結果、これらのプローブを使用した測定は、茶の影響を受けませんバイオセンサー濃度またはサンプル照明や厚さNGES。最後に、両方のバイオセンサーは、細胞内の空間分解能を提供します。実際、roGFPはミトコンドリア、小胞体に標的化された、エンドソームと24ペルオキシソーム、およびpHの大部分は独立したこれらの細胞小器官のそれぞれの酸化還元状態の変化を検出することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。バイオセンサーと酵母細胞の形質転換
- 酢酸リチウム法27を用いたプラスミドベアリング水戸roGFPまたはmitGO-ATeam2で希望の酵母株を変換します。
- プラスミド媒介バイオセンサーとの変換を確認するために、プラスミドの損失を防ぐために、選択し、適切な選択的な合成完全培地（水戸roGFP用SC-浦、またはmitGo-ATeam2用SC-レイ）で形質転換体を維持します。蛍光プローブは、ここで説明したものとは異なるプラスミドにサブクローニングされている場合は、適切な選択培地を使用する。彼らは蛍光バイオセンサーを表現していることを確認し、正常なミトコンドリアの形態を示すように、蛍光顕微鏡で形質転換体を可視化する。
2。イメージングのための細胞および準備の成長
細胞機能および薬物治療に対する応答は、細胞密度および代謝活性に大きく依存している。最良の結果が得られた場合細胞（ - 1×10 7細胞/ ml半ば対数期、〜0.5）活発に分裂している。一貫性のある密度の中間対数期文化を生成するための最も信頼性の高い方法は、定常期前培養から接種することです。
- 定常期前培養の準備：プレートから形質転換細胞の単一コロニーを選択し、選択的な液体培地（50ミリリットルコニカルボトムチューブ5 ml）を接種。 600nmの（OD 600）での文化の光学密度がプラトー（24〜48時間）に達するまで、225 rpmで振とうしながら30℃で成長する。
- 観察用半ば対数期の文化を準備：50 mlコニカルボトムチューブに選択培地を5mlに接種し前培養の適切なボリュームを使用しています。 YPD培地は自家蛍光であり、これらの研究のために使用すべきではありません。合成が完了すると、グルコース基づき、ドロップアウト（SC-浦）メディアを使用してください。 （ - 1×10 7細胞/ ml〜0.5）は、半ば対数期に到達するまで、4-16時間、225 rpmで振盪、30℃で細胞を成長させる。細胞密度を決定することができるOD 600を測定することにより、正確な読み取り値OD 600を決定するために分光光度計を較正する。当社ベックマンDU530（INベックマン·コールター、インディアナポリス、）では、中期対数期は0.1〜0.3のOD 600に対応しています。
水戸roGFP1代謝変化に反応して細胞小器官で感知する変動。たとえば、酵母が発酵性炭素源（ 例えば 、グルコース、SCメディアのように）と非発酵性炭素源（ 例えば 、グリセロール、SGlycメディアのように）で、さらには同じものの別のバッチで育つときミトコンドリアの酸化還元状態が変化し、このアッセイにおいてメディア。したがって、すべての実験のためのメディアの同じバッチを使用しています。
- まだ処理が実行されていない場合、細胞は、濃度の準備ができて（ステップ2.4を参照）及び結像ある。細胞が治療を受けている場合は、適切な治療で細胞をインキュベートし、次のステップに進みます。
- 15秒間6,000×gで遠心分離により培養液1mlを集中し、メディア20μlの中の細胞ペレットの再懸濁。これらの条件は、視野内の識別可能なセルの数を最大化します。
- スライドに再懸濁した細胞2μlのを適用します。カバースリップ（第1.5、好ましくは、高パフォーマンスの170±5μmの厚さ）でカバー、クリアマニキュアまたはvalap（試薬を参照）でカバースリップの端をシールします。 valapで密封する、ブンゼンバーナーの炎の上に保持することによって金属へらで少量を溶かし、その後、カバースリップの端に沿って少量を広げた。
- 撮影中に30℃で細胞を維持します。イメージングのために使用される100倍油浸レンズで客観ヒーターは、このアプリケーションに適しています。これらの条件、ミトコンドリアの形態、レドックス状態とATPレベルの下で10〜15分間の撮影中に変更されないままです。
3。イメージングセットアップ
- 広視野蛍光顕微鏡でイメージング水戸roGFP1のセットアップ
ここでの手順はAxioObseに合わせて調整されコリブリLED励起源を備えrver.Z1顕微鏡、広視野オルカERカメラやAxioVisionの取得ソフトウェア。水戸roGFP1酸化のチャンネルと光変換の両方で退色は、水銀アーク灯照明（下記参照）に比べてLED照明を使用して大幅に減少します。
信号と解像度を最大にするために、客観的に可能な限り最高の開口数、十分な空間分解能を提供する最小の倍率を使用しています。また、水戸roGFPイメージングのため、目標は365 nmでよく送信することを確認します。 100x/1.3NA EC PlanNeofluar対物レンズ（ツァイス）は、このアプリケーションに適しています。
酸化および還元水戸roGFP1種をキャプチャするために取得ソフトウェアを設定します。我々は、次の条件を使用しています。- そのような付属excitatioと38 HEフィルターセット（ツァイス）として、365 nmの（100％電源LED）の励起とGFP適しエミッションフィルタを使用するために酸化水戸roGFPのチャネルを設定するnはフィルタがキューブから削除されます。励起フィルターの除去はこのようにして達成可能な時間分解能を増加させる、フィルタを切り替える必要なしに365 nmおよび470 nmでの励起の両方を可能にする。
- 上述したように、470 nmの（100％電源LED）で励起を使用するように減少水戸roGFP用のチャネルを設定し、同じ発光フィルターキューブは、酸化水戸roGFPに使用。空間分解能を最適化するために、1x1のビニングにカメラを設定してください。
- 各z位置におけるチャネルの両方を収集し、0.5μmの間隔で11スライスから成るAZスタックを取得するために、ソフトウェアを設定します。買収のこのモードでは、順番に各Zスタックを取得するよりも遅いですが、それは酸化および還元チャネルの獲得の間にミトコンドリアの動きから生じるアーチファクトを防ぐことができます。
- 画像いくつかのセルが強くなく、飽和信号を生成し、適正な露光時間を決定する。すべての実験に酸化され、ミト-roGFP1低減するための露光時間の比率を維持することが重要であるS。水戸roGFP1酸化および還元のための露光時間は、それぞれ300および100ミリ秒、ある場合たとえば、その後水戸roGFP1酸化のための露光時間はためには、すべての実験のために水戸roGFPを減少させることを3倍にする必要があります。
- スペクトル共焦点顕微鏡でイメージングmitGO-ATeam2のセットアップ
mitGO-ATeam2、GFP（エミッション最大510 nm）をからの蛍光を用いたATPレベルを定量化するためにOFP（発光極大560 nm）をからその区別しなければならない。これらの蛍光プローブが発する蛍光を解決蛍光フィルターセットがあります。しかし、我々は、共焦点顕微鏡をスキャンし、多くのレーザーで利用できるスペクトル検出器は、このアプリケーションに最適に動作することを見つける。スペクトル検出器は、波長に応じて多くのコンポーネント（通常は32以上）に蛍光発光を分離。いくつかの隣接する波長帯域は、一つの画像チャネルに結合することができる。組み合わされる波長は、経験的にそうGからの信号を最大にするように選択されるFPとOFP FRET測定を混乱なる信号の交差は避けながら。利用可能な最高の開口数レンズを使用してください。我々は100x/1.49または60x/1.49のApo-TIRFレンズを使用しています。私たちは、NISの要素ソフトウェアを実行しているニコンA1R共焦点顕微鏡を使用しています。 ATP結合型とATP-結合していないmitGO-ATeam2種をキャプチャするために取得ソフトウェアを設定します。我々は、次の条件を使用しています。- 我々のシステム上で0.42程度のAZ解像度に対応して1.0エアリー単位（AU）にピンホールを設定します。
- 画像内の空間情報を最大化するナイキストサンプリング限界に近づくためにスキャンのズームを設定します。我々のシステムではピクセルサイズは0.12μmである。
- ミトコンドリアは、撮像中に移動することができるので、512×256ピクセルにフィールドをトリミングすることにより、撮像速度を高めるために役立つことができる。我々のシステムの画像1フレームに必要な合計時間は2倍のスキャンの平均を含む、1.0秒です。所望の空間分解能に応じて、フィールドがさらにincreasにトリミングすることができます電子時間分解能を。
- 488 nmで励起すると、500からの発光を収集 - GFPのために520 nmであり、かつ550〜 - OFPのために580 nmである。実際の最適値は、撮像システムの特性によって変化し得る。
- 我々のシステムに対する最適なレーザパワーが6.0と6.4％の間である。最適なレーザパワーは、各顕微鏡システムごとに異なりますが、それでも解釈画像を生成しながら、理想的にはできるだけ低くなる。任意の光学系では、時間の経過とともに通常は発生レーザパワーの変化を監視するために、内部または外部のパワーメータを使用してください。
- できるだけ多くの細胞などのために、信号を画素値の検出範囲を最大にするしかし飽和を避けるために、検出器利得と照明光の強度を調整する。 1％以上の飽和画素を含む任意の細胞を分析しないでください。イメージには、すべて同じ目的、レーザーパワー、スキャンズームを使用してサンプル、ピクセルサイズ、ゲイン、オフセット。
4。画像収集
- フォーカルPLAを見つけ蛍光プローブを漂白最小限にするために透過光を使用して目的の細胞のね。
- 興味のある1つまたは複数のセルを配置した後、0.5μmのステップサイズを用いた典型的なセル（約7ミクロン）の全体の深さを通してZシリーズを収集します。
- 画像他のスライド上の目的の細胞が、イメージより長い15分間単一のスライドしない。スライド上で15分後、細胞は生存率を失う。
5。分析
ミトコンドリアATPレベルは510 nmでそれに560 nmでmitGO-ATeam2発光の比率を測定することによって決定される27オルガネラの酸化還元状態はミト-roGFPの（R / O）、酸化比率に減少として測定される; すなわち 365 nmで励起510 nmでの発光で割った470 nmで励起510 nmでの発光。比を計算する前に、我々は、バックグラウンドを差し引き、蛍光ミトコンドリアに属する画素のしきい値を決定する。
10トン">公共ドメイン（ 例えば ImageJの30）または市販の（ 例えば Volocity、パーキンエルマー）ソフトウェアが水戸roGFP1またはmitGO-ATeam2の分析に使用することができます。画像取得のために、分析のために使用するソフトウェアによっては、画像第解析ソフトウェアでそれらを開く前に、例えばTIFFなど、別の形式に変換する必要があるかもしれない。画像が変換される場合は、画素値を変換中に変更されていないことを検証することが不可欠である。ミト-roGFP1データの解析を用いて両方のプログラムは以下のとおりです。各メニュー内で選択するには、プログラムのメニューとオプションは太字イタリック体で強調表示されています。5.1 ImageJの分析
- 画像を開くと32ビットにタイプを変更： 画像→タイプ→32ビット。
- まだ細胞が存在しない領域における関心領域（ROI）を描く。このROIの平均強度を計算します→測定を分析します。
- プロセス→数学→減算 ：スタックから計算された平均バックグラウンドを減算。
- 減算zスタックを使用して、ミトコンドリアの中央スライスとしきい値を見つける： 画像は→→しきい値を調整し、しきい値ウィンドウで[Apply]をクリックします。スタック内のすべてのスライスに適用されます。 NaNに背景ピクセルを設定し確認してください。
- 比率を作成し、Zスタック： プロセス→画像電卓水戸roGFP1解析用酸化Zスタックによって減少スタックを分割します。 mitGO-ATeam2解析用の510 nmの（ATPの結合していない）画像によって560 nmの（ATP結合型）画像を分割します。
- 関心のある領域の周りにROIを描画します。 →ツール→ROIマネージャーを分析し選択し、ROIを記録するために[追加 ]をクリックします 。複数の領域にマネージャーに格納することができる。 ROIマネージャで、すべてのROIを選択して、[M]を選択します鉱石→すべてのスタックのスライスを測定するマルチ測定。分析のためのスプレッドシートにデータをエクスポートします。
5.2 Volocity分析
- Volocityライブラリに画像をインポートして、2チャンネルの画像シーケンスを作成します。
- まだ細胞が存在しない領域における関心領域（ROI）を描く。選択してください：[ツール]→[比率。
- ROIから取得 ：バックグラウンドを計算するためにVolocityを使用します。
- ミトコンドリアの構造を含むようにしきい値を調整します。
- 比チャネルに虹のLUTを適用するオプションをチェックします。強度変調チャネルプレゼンテーション-るためのノイズの少ない画像を生成することがありますが、それは平均的な比率の定量のために使用すべきではありません。
- 測定タブを選択し、比率のチャンネルを選択して、関心のある領域の周りにROIを描画します。ゼロ値を除いた比率チャネルを測定します。複数の領域を選択して測定することができる同時に。分析のためのスプレッドシートにデータをエクスポートします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
水戸roGFPとミトコンドリアの酸化還元状態を測定
ここでは、ミト-roGFP1は、酵母細胞増殖またはミトコンドリアの形態に影響を与えることなく、生きた酵母細胞を低減するために完全に酸化からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出するためにダイナミックレンジを有することを示す。まず、ミトコンドリアを標的とGFPとroGFP1を発現する細胞は、通常料金（ 図1A）で成長を見つける。最大成長速度は、対数増殖期と最大成長速度に達するまでの時間の間に成長曲線の最大傾斜によって測定される、ミト-GFPおよびミト-roGFP1を発現する細胞で類似している。さらに、水戸roGFP1展示野生型形態（ 図1B）を発現する酵母におけるミトコンドリア。具体的には、管状のですが、母の芽軸に沿って整列し、そして母と娘細胞の先端に蓄積されます。ミトコンドリアの機能不全は、しばしば断片化を誘発するので、通常の形態では、水戸roGFP1が行うという考えをサポートしていますしない摂動ミトコンドリア機能。
ミト-roGFP1のダイナミックレンジを評価するために、我々はそれぞれ、過酸化水素（H 2 O 2）およびジチオスレイトール（DTT）で中期対数期野生型酵母細胞を処理し、ミトコンドリア評価するために、平均ミトコンドリアR / O比を測定しレドックス状態（ 図2）。 0.6（酸化条件下で）から1.23（還元条件下）で測定された範囲の平均セルラーR / O比の用量依存的変化が0〜10 mMの結果から、H 2 O 2またはDTTによる滴定。したがって、水戸roGFP1は生きている細胞でミトコンドリアの酸化還元状態を分析するための効果的なバイオセンサーである。
水戸roGFP1また、ミトコンドリアの酸化還元状態の細胞内の分解能を提供しています。この細胞内の解像度は、個々の酵母細胞内のミトコンドリアが相対酸化還元状態が異なることが明らかになった。単一の酵母細胞内のミトコンドリアの機能的に異なるであれば、それは可能であるyは受動的または能動的に分離されます （ 図3）である。このような分離は、母娘の年齢非対称と娘細胞の若返りに貢献できる。この知見は、ミトコンドリアの酸化還元状態の細胞内解像度を持つバイオセンサーの必要性を強調している。
これは、光がGFP発色団の変化を誘導することができる31を長く知られている。高強度の400nmの光に曝されると、roGFP1は異なる発光スペクトル26種に光変換を受ける。光変換が発生すると、水戸roGFP1酸化から緑色発光の減少とR / O水戸roGFP1（ 図4B）の比率を変える減少水戸roGFP1の励起緑色発光の増加があります。低強度の励起（コリブリ光源のLEDは400nmを使用して40％で、 例えば照明）を使用して、（ 図4C）分析期間中に有意な光変換はありません。 P光変換を減らすために呼ば方法は（説明を参照してください）365 nmでroGFPの酸化型を励起することである。
mitGO-ATeam2とミトコンドリアのATPを測定する
哺乳動物細胞で発現された場合MitGO-ATeam2はミトコンドリアに局在する。27我々はmitGO-ATeam2は酵母におけるDAPI染色ミトコンドリアDNAと共局在し、ミトコンドリア野生型酵母（ 図5A）の典型的な管状構造で発見されていることを見つける。したがって、我々は、哺乳類のシトクロムcオキシダーゼサブユニットVIIIAからミトコンドリアターゲッティング配列がミトコンドリアの形態を中断することなく、酵母におけるミトコンドリアにプローブを局在することを確認した。さらに、我々はmitGO-ATeam2を発現する細胞の増殖速度は、グルコースとグリセロール培地（ 図5B）の両方でミトコンドリアを標的とGFPを発現する細胞と同様であることが判明。したがって、mitGO-ATeam2の発現は、細胞やミトコンドリアに有害では表示されません。
_contentは ">次に、我々は、ミトコンドリアのATPレベルの変化に応答するmitGO-ATeam2はFRETかどうかを試験した。そのために、我々はアンチマイシンA、シトクロムc還元酵素に結合する薬剤、で細胞を処理する電子輸送チェーンにユビキノールの酸化を抑制する、プロトン勾配を破壊し、ミトコンドリアATP産生を阻害する。20は、中央値は、アンチマイシン（ 図6C）で処理した細胞の割合が低下するFRET。mitGO-ATeam2、ミトコンドリアATPに有効なバイオセンサーであるという証拠を考えると、我々は、発酵または非発酵性炭素源（ 図6Aおよび6B）を用いて増殖させた酵母におけるミトコンドリアATPレベルを監視するために、このプローブを使用した。グルコース培養した細胞の総蛍光面積の減少は、ミトコンドリアの豊富の減少グルコース抑制の結果ことが確認された。我々はmitGO-ATeam2のレベルのセル間のばらつきに注意してください。興味深いことに、我々の予備的なデータを示しているそこにMA yは同じセル内の異なるミトコンドリアにおけるATPレベルの違い（ 図6D）こと。
図1。水戸roGFP1は、細胞成長速度またはミトコンドリアの形態に影響を与えることなく、ミトコンドリアの酸化還元状態を検出する。明白なミトコンドリアを標的とGFPまたはRO-GFP1は、成長の時間の関数としての600nmでの光学密度の変化として測定した酵母の（A）の成長30 SC-浦液体培地℃（B）アッパーパネル：RAW画像でノーマルミトコンドリアの形態とローカリゼーションチャンネル。下のパネル：レシオ画像は、酸化チャネル（右の色参照）で割った値が減少チャネルを示しています。画像は、結果にしきい値の選択の効果を示す。最適なしきい値は、ミトコンドリアの構造と除外の背景が含まれています。jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図2。水戸roGFP1は、過酸化水素またはジチオスレイトールを用いた治療に反応してミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出します。水戸roGFP1を表現する（AB）ミッドログ相酵母細胞は無治療（0）または指定された濃度のSC-浦培地中でインキュベートした30℃で20分（）R / Oミト-roGFP1比画像の最大輝度突起は、細胞の輪郭を示す透過光画像に重畳されるためのH 2 O 2またはDTTである。水戸roGFP1のカラーリファレンスは右上に表示されます。バー：5μM（B）。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図3。水戸roGFP1は、ミトコンドリアの酸化還元状態の細胞内の分解能を提供しています。R / O水戸roGFP1比チャネルの最大値投影は、透過光画像に重畳されています。水戸roGFP1のカラーリファレンスは右上に表示されます。バー：5μM。この特定のセルは、0.88の平均R / Oミト-roGFP1比を有する。しかし、この細胞内の個々のミトコンドリアは、さまざまな酸化還元状態を示す。示す数字は異なるミトコンドリアの再計算のためのR / O水戸roGFP1比ですgions。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図4。高強度の励起は光変換と変更されたR / O水戸roGFP1比率につながる。水戸roGFP1を表現ミッドログ相酵母を40％（）または100％に400 nmの光で照らされたLED光源から（B）パワー、そして水戸roGFP1減少と酸化から蛍光が毎4秒捕獲された。示されている画像は色が水戸roGFP1のR / O比（右下にカラースケールを参照）を表している最大の見通しである。バー：5μM（C）は水戸roGFP1のR / O比が40％の電源LEDで照明時にイメージング期間にわたって一定のままであった。しかし、100％のLED電源で照明時に、我々フルオロフォアのphotoswitchingを反映水戸roGFP1、のR / O比の経時変化を観察します。黒い四角は、40％の電力をLED;。グレーダイヤモンド、100％の電源LEDはより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図5。 MitGO-ATeam2は、酵母のミトコンドリアに局在し、酵母細胞の成長率に影響を与えません。前述のように（A）mitGO-ATeam2を発現する酵母細胞は、DNA結合色素をDAPIでホルムアルデヒドとステンドグラスを使用して固定し、中期対数期まで増殖させた図19画像は、デコンボリューションZシリーズの最大強度の予測である。簡単にするために、mitGO-ATeam2画像は、彼らがATPにのみ結合していない個体群を示し、従来のGFPフィルターを用いて得た。細胞外線は白色で示されている。 N：核DNA。のmtDNA：ミトコンドリアDNA。バー：1ミクロン（B）野生型酵母細胞の成長曲線は30でミトコンドリアを標的とGFPまたはmitGO-ATeam2グルコースベースで（SC）とグリセロールベース（SGlyc）液体培地℃までを表現。このデータは、各時点における各菌株のための4重の平均値であり、2つの独立した実験の代表である。 より大きい数字を表示するにはここをクリック。
図6。 MitGO-ATeam2対策が細胞内とsuborganellar解像度で酵母ミトコンドリアにおけるATPレベルの変化。（AB）GFP（510 nm）のとOFP（560 nm）をからmitGO-ATeam2の排出、及び酵母の510分の560 nmの蛍光強度比の定量グルコで一晩培養した細胞SEベース（SC）（）またはグリセロールベース（SGlyc）（B）メディア。 510分の560比チャネルのための色基準は、右下に示されている。バー：1ミクロン（C）セル用510分の560比の定量は、30℃で1時間アンチマイシンA（2μgの/ ml）の有無にかかわらずSGlycメディアで伝播℃まで。アンチマイシン時のATPレベルの低下治療は統計的に有意である（クラスカル·ウォリスの有意差検定）。（D）中期対数期野生型細胞のmitGO-ATeam2の560 nm/510 nmの比は、SCメディアに伝播されます。 510分の560比チャネルのための色基準は、右下に示されている。細胞の輪郭は白で示されている。セル全体の平均510分の560 nmの比率は0.43である。示す数字はミトコンドリア内の特定の領域の510分の560 nmの比である。バー：1μmである。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、酵母細胞を生体内でミトコンドリアの酸化還元状態とATPのレベルを評価するためのバイオセンサーとして水戸roGFP1とmitGO-ATeam2を使用する方法について説明します。私たちは、定量的なミトコンドリアの形態や分布や細胞の成長率に明らかな影響を与えることなく、ミトコンドリアを標的にプラスミド媒介水戸roGFP1またはmitGO-ATeam結果の発現を見つける。3水戸roGFP1は高度からミトコンドリアの酸化還元状態の変化を検出することができます高度に低下した状態に酸化する。同様に、mitGO-ATeamは、呼吸阻害剤で処理呼吸ドリブン成長および酵母を受ける酵母で発生するミトコンドリアATPレベルの変化を測定することができる。両方のバイオセンサーは、細胞内の分解能を提供しますので、また、彼らは、酸化還元状態や個々の細胞内のミトコンドリアのATPレベルの不均一性を検出することができます。両方のバイオセンサーは、レシオメトリックプローブであるので、最後に、それらは試料の厚さや病気中の濃度や変動性の変化によって影響を受けることはありませんumination。これらのプローブは、生きている細胞では細胞内の解像度でミトコンドリア機能を勉強する低侵襲なアプローチを提供します。
正常にこの方法を適用することは、画像が可能な最大の信号対雑音比を用いて取得されるべきである。重要な最初のステップは、顕微鏡下で10-20形質転換体コロニーからの細胞を調べ、堅牢な蛍光と通常ミトコンドリアの形態と成長速度を有するものを選択することである。次に、撮像条件は、蛍光タンパク質又は細胞に光損傷を引き起こすことなく、高い飽和なく、強度を生成するように最適化されるべきである。集団（<1％）の少数の細胞がプラスミドのコピー数の変動による異常に高いまたは低い全体的な蛍光を有することができ、これらは、細胞の大部分の解釈画像を取り込むのに有利に無視することができる。
水戸roGFPの利点は明らかですが、それは潜在的な落とし穴に注意することも重要です。我々は検出細胞代謝における炭素源誘発性の違いがなく、同じ媒体の異なるバッチにおける酵母の増殖の際だけでなく、ミトコンドリアの酸化還元電位の違い。ミトコンドリアの酸化還元測定のための細胞増殖培地を選択する際にこのように、注意を払わなければならない。水戸roGFPはミトコンドリアの酸化還元状態の前例のない空間分解能を提供していますが、また、roGFPの時間分解能は、ROSシグナル伝達31に関連付けられているROSのバーストを検出するのに十分ではありません。 roGFPの酸化型の励起波長と強度を選択する際に最後に、注意が必要です。 400 nmでの照明を最適roGFPの酸化種を励起する。しかし、それはまた、365nmの励起に比べて大きい程度に低減roGFPを励起する。これは、ミトコンドリアの酸化還元状態を測定することで感度低下につながる。さらに、400 nmで高強度の照明に水戸roGFP1の露出はスペックにタンパク質の光変換につながる変更されたスペクトル特性を持つIES。私たちは、365 nmの高輝度照明により光変換を見ていない。したがって、我々は、可能であれば365nmのを使用して励起することをお勧めします。
MitGO-ATeam2も制限があります。 mitGO-ATeam2自体がタンパク質であるので、例えば、バイオセンサー、その活性を損なうおそれが活性酸素種を含む、細胞の傷害によって損傷することができる。さらに、GFPとOFPの発光波長（510及び560nmの）は、従来の蛍光顕微鏡では難しいかもしれな分析を、FRETのために解決しなければなりません。
in vitroでの酵素アッセイとは異なり、これらの生細胞アッセイは、ミトコンドリアのATPまたは酸化還元状態の相対的変化を報告し、ATPまたは減圧システインの絶対濃度を測定しないでください。標準曲線は理論的には溶液中のセンサータンパク質の応答を測定することによって生成することができるが、これはミトコンドリア内の異なる分子環境には適用されない場合があります。熱使いになる前に、これらのアッセイは、異なる条件下で細胞を比較する手段を提供する。また、撮影条件が異なる、1つの撮像セットアップに取得し正確な比の値が別の上に複製されない場合がありますので。
比イメージングのためのこれらの技術は、他のroGFP又はGO-ATeamアイソフォームと他の機能のプローブを含む他のレシオメトリック指標に適合させることができる。広視野や共焦点顕微鏡の選択は、プローブと必要な空間分解能に依存します。それは365 nmで励起することができますので、広い視野法はセンサの感度と安定性が向上し、水戸roGFPのためにここに使用された。としてmitGO-Ateamためここで使用されたスペクトル検出器を備えた共焦点法は、スペクトル検出ウィンドウを調整することにより、排出のクロスオーバーを排除するための便利な方法を提供します。ただし、カスタム·フィルタを用いて、計算またはクロスオーバーをなくすことによって、広い視野顕微鏡で同様の実験を行うことが可能である。
ntent ">撮像実験のこのタイプの最も一般的な難しさが不十分信号である。イメージングハードウェア（特に対物レンズと検出器）データを解釈するのに十分な信号を収集するために重要である。背景ピクセルの包含が得比率の傾向を弱めることができるようにしきい値処理の手順は、結果に大きな影響を持っている。自動の方法が望ましいですが、制限された信号のため、手動でしきい値は、多くの場合、利用可能な最善の方法である。手動のしきい値が使用される場合、使用される基準は、同様に可能な限り関節運動されるべきであり、分析は、再現性を実証するために、異なる実験により、またはブラインド実行する必要があるかもしれない。アンチマイシン（mitGO-Ateam2）とH 2 O 2またはDTT（ミト-roGFP用）対照実験は、蛍光比率の予測変化を確認するために使用することができる。
水戸roGFPとmitGO-ATeam2監視水戸のための非侵襲的な、レシオメトリックプローブである酵母細胞を生体内でchondrialフィットネス。ここで使用されるレシオメトリックセンサは、ミトコンドリア特異的シグナル配列の融合によりミトコンドリアを標的とした。他の細胞コンパートメントはオリジナルのセンサーへの適切な標的配列の付加に師事することができます。また、同時に、細胞を生体内で複数のプロセスを測定するために相補的な蛍光マーカー（細胞小器官またはシグナリング要因など ）又はセンサ（ 例えば、カルシウム）、これらのセンサのいずれかを組み合わせることが可能である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
この作品はHHMI 56006760から（GM45735、JDV、DMAWに国立衛生研究所（NIH）（2 TL1 RR 24158から6）、およびエリソン医療財団（AG-SS-2465）およびNIHからの賞によってサポートされていましたLPへGM45735S1とGM096445）。 GM45735S1は、2009年のアメリカの回復と再投資法の下でNIHから発行されました。これらの研究に用いられる顕微鏡はNIH / NCIの助成金（5 P30 CA13696）を通して部分的にサポートされていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution. |
| SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| Valap | Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin |
||
| Equipment and Software | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm |
| High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm) |
| A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective | Nikon (Melville, NY) | ||
| AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
| Volocity 3D Image Analysis software | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
- Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
- Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).
- Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Schon, E. A., Przedborski, S.
- Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
- Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
- Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
- Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
- Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
- Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
- Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
- Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
- Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
- Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
- Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
- Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
- DeLuca, M.
- Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
- Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
- Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
- Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
- Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).
