Ratiometrisk Biosensors, der måler Mitochondrial Redox stat og ATP i Living Gærcellers

Summary

Vi beskriver anvendelsen af ​​to ratiometrisk, genetisk indkodede biosensorer, som er baseret på GFP, til at overvåge mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer subcellulære opløsning i levende gærceller.

Abstract

Mitokondrier har roller i mange cellulære processer, fra energi metabolisme og calcium homeostase at styre af cellulær levetid og programmeret celledød. Disse processer påvirker og påvirkes af redox status og ATP produktion af mitokondrier. Her beskriver vi brugen af ​​to ratiometrisk, genetisk indkodede biosensorer, der kan opdage mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer subcellulære opløsning i levende gærceller. Mitokondrie redoxtrin måles ved hjælp af redox-følsomme grønt fluorescerende protein (roGFP), der er målrettet til det mitokondrielle matrix. Mito-roGFP indeholder cysteiner i positionerne 147 og 204 af GFP, der undergår reversibel og miljø-afhængig oxidation og reduktion, hvilket igen ændrer ekscitationsspektret af proteinet. MitGO-ATeam er en Förster resonans energi overførsel (FRET) sonde, hvor ε underenheden af F _o F _1-ATP syntase mellemlæg FRET donor og acceptor fluorescent proteiner. Binding af ATP til ε subunit resulterer i kropsbygning ændringer i proteinet, der bringer FRET donor og acceptor i tæt nærhed og muliggøre fluorescensresonansenergioverførsel fra donor til acceptor.

Introduction

Mitokondrier er væsentlige organeller til ATP-produktion, biosyntese af aminosyrer, fedtsyrer, heme, jern svovl klynger og pyrimidiner. Mitokondrier også spille afgørende roller i calciumhomeostase, og regulering af apoptose. ¹ stigende tegn links mitokondrier til aldring og aldersrelaterede sygdomme, herunder Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og Huntingtons sygdom. ^2. Mens personer lever hele deres liv med mutationer i mitokondrielle proteiner, der er forbundet med neurodegenerative sygdomme, sygdomssymptomerne kun forekommer senere i livet. Dette indikerer, at der sker ændringer i mitokondrier med alderen, der tillader sygdom patologi at dukke op. Faktisk er mitokondrie fitness korreleret med generelle celle sundhed og levetid i gær-og pattedyrceller. ^3,4 Her beskriver vi, hvordan du bruger genetisk kodede Ratiometrisk fluorescerende biosensorer til at vurdere to kritiske funktioner i mitochondria i levende gærceller: redoxtrin og ATP niveauer.

Mitokondriefunktionen i aerob energi mobilisering er veletableret. Mitokondrie redoxtrin er et produkt af reducerende og oxiderende arter i organel, herunder NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutathion / glutathiondisulfid (GSH / GSSG) og reaktive oxygenarter (ROS). Afkobling mitokondrier eller hypoxi påvirker mitokondrie respiratoriske aktivitet og ændrer forholdet mellem NAD ⁺ til NADH i organel. ROS, som er fremstillet af ineffektive elektronoverførsel mellem komplekser af elektron transportkæden i den indre mitokondrielle membran, samt fra deaminering af aminer via monoaminoxidase i den ydre mitokondriemembran ^5, skader lipider, proteiner og nukleinsyrer og har været knyttet til aldring og alder-associerede neurodegenerative sygdomme ^6,7,8. ROS også spille en rolle i signaltransduktion i mitochondria gennem oxidation af GSH. For eksempel, ikke kun NADH dehydrogenase bidrager til ROS produktion, men også er reguleret gennem interaktioner med glutathion pool ^9,10. α-ketoglutarat dehydrogenase og aconitase, komponenter af TCA cyklus udviser nedsat aktivitet i oxiderende miljøer ^11,12.

Faktisk er redox-afhængig regulering af aconitase aktivitet bevaret fra bakterier til pattedyr ^13,14. Således overvågning redoxtilstanden og ATP niveauer af mitokondrier er afgørende for at forstå deres funktion og rolle i sygdom patologi.

Biokemiske metoder er blevet anvendt til at vurdere redoxtrin eller ATP niveauer af hele celler eller isolerede mitokondrier. Udbredte metoder til at vurdere redox tilstand af hele celler eller isolerede mitokondrier, er baseret på måle niveauet af redox parret GSH / GSSG ^15.. Luciferin-luciferase-systemet er almindeligt anvendt til at måle mitokondrieATP i enten permeabiliserede hele celler eller isolerede mitokondrier. ^{16,17,18,19,20} i dette assay, luciferase binder til ATP og katalyserer oxidationen af og kemiluminiscens fra luciferin. ^21. Intensiteten af det udsendte lys er proportional med mængden af ATP i reaktionsblandingen. ^22.

Disse metoder har afsløret grundlæggende oplysninger om mitokondrie funktion, herunder den konstatering, at patienter med neurodegenerative sygdomme, såsom Alzheimers sygdom, har unormalt lave ATP-niveauer. ^23. De kan dog ikke bruges til at afbilde levende, intakte celler. Desuden metoder baseret på helcelle-analyse giver et gennemsnit af redoxtrin eller ATP i alle rum i cellen. Målinger i isolerede organeller er potentielt problematiske, fordi mitokondrie redoxtrin eller ATP niveauer kan ændre sig i løbet subcellulær fraktionering. Endelig seneste undersøgelser fra vores laboratorium, og andre viser, atmitokondrier i de enkelte celler er heterogene i funktion, hvilket igen påvirker levetiden for mor og datter celler. ^3. Der er således et behov for at måle mitochondrielle ATP niveauer og redoxtilstanden i levende celler med subcellulær opløsning.

De biosensorer til mitokondriefunktionen beskrevet her, er begge baseret på GFP. Redox-følsomme GFP (roGFP) ^24,25 er en GFP variant, hvor overfladeeksponerede cysteiner tilsættes til molekylet. roGFP, ligesom vildtype-GFP, har to excitation toppe (ved ~ 400 nm og ~ 480 nm) og en emission topper ved ~ 510 nm. Oxidation af cysteinresterne i roGFP resulterer i en stigning i excitation ved ~ 400 nm. Reduktion af disse cysteiner favoriserer excitation ved ~ 480 nm. Således er forholdet mellem 510 nm emission ved excitation af roGFP ved 480 nm og 400 nm afslører den relative mængde af reduceret og oxideret roGFP, hvilket afspejler redoxtilstanden af ​​fluoroforen miljø.

To versioner af roGFP er meget udbredt: roGFP1 og roGFP2. Begge indeholder de samme cystein indrykninger. roGFP1 er baseret på vildtype-GFP og roGFP2 er baseret på S65T-GFP, som har en mere effektiv excitation ved 480 nm og mindre effektiv excitation ved 400 nm i forhold til wtGFP ^24.. roGFP1 er mindre pH følsom end roGFP2 og dens dynamikområde rækker længere ud i reducerede rækkevidde. Således kan roGFP1 være mere nyttigt for at overvåge mere reducerende rum såsom mitokondrier eller cytosolen, og segmenter med en variabel pH, såsom endosomer. roGFP2 tilbyder lysere signal og, i nogle undersøgelser, en større dynamikområde end roGFP1 ^24,26. Studier i Arabidopsis thaliana indikerer, at den tid, der kræves for reaktion på ændringer i redoxtilstand er ens for begge sensorer (t ½ til oxidation, 65 og 95 sek og t ½ for reduktion, 272 og 206 sek, for roGFP1 og roGFP2, henholdsvis). ^26.

MitGO-ATeam2 er en minimalt invasiv, pålideligsensor, der måler mitokondrie ATP i den spirende gæren Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam er en Förster resonans energi overførsel (FRET) sonde, der består af ε-underenheden af F _o F _1-ATP syntase klemt mellem FRET donor og acceptor fluorescerende proteiner (GFP og orange fluorescerende protein (OFP), henholdsvis). ^27. binding af ATP til ε subunit resulterer i konformationelle ændringer i proteinet, der bringer FRET donor i tæt nærhed til acceptoren og tillade energioverførsel fra donor til acceptor. Der er to varianter af GO-ATeam, GO-ATeam1 og GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en højere affinitet for MgATP end GO-ATeam1, hvilket gør det mere egnet til at måle den typisk lavere [ATP] i mitokondrierne i forhold til cytosolen. ^27.

Til at sondere mitokondrie redoxtrin konstruerede vi et fusionsprotein (Mito-roGFP1) bestående af roGFP1 fusioneret til ATP9 ledersekvensen ennd udtrykt fra en centromer-baseret (lavt kopiantal) gærekspressionsplasmid under styring af den stærke glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Vi brugte roGFP1 til at undersøge redox status mitokondrier i forbindelse med aldring af modellen svampen Saccharomyces cerevisiae. Vi finder, at roGFP1 kan påvise ændringer i mitokondrie redoxtrin der opstår under ældning og som reaktion på tilgængeligheden af ​​næringsstoffer, men har ingen tilsyneladende skadelig virkning på gærceller. Vi ser også variabilitet i redox tilstand af mitokondrier i individuelle levende gærceller, en konstatering, der understreger vigtigheden af ​​en biosensor med subcellulær rumlig opløsning.

MitGO-ATeam2 er en variant af GO-ATeam2, som har mitokondrie signalsekvensen af cytochrom c-oxidase-underenhed VIII indsat ved aminoterminalen af GO-ATeam2. ^27. Vi modificerede mitGO-ATeam2 sonde (venligst tilvejebragt af laboratoriet H. Noji, Institut of videnskabelig og industriel forskning, Osaka University, Japan) til brug i gær ved subkloning det via Xba1 og HindIII-steder, ind i gærekspressionsvektoren pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), hvilket er en lav-kopi plasmid indeholdende den stærke konstitutive GPD-promotor. Vi udtrykte mitGO-ATeam2 i spirende gær, og finde, ved modfarvning DNA-bindende farvestof DAPI, at det lokaliserer udelukkende for mitokondrier, hvor det fungerer som en effektiv probe til måling af fysiologiske ændringer i mitokondrie ATP niveauer.

roGFP og GO-ATeam begge genetisk kodet. Som et resultat, kan de blive introduceret og stabilt opretholdt i intakte celler, og giver oplysninger om redox stat eller ATP i individuelle, levende celler. Desuden har begge biosensorer overvåge ændringer i redox stat eller ATP niveauer, der opstår under fysiologiske betingelser. ^28. Begge sonder er også ratiometriske. Som et resultat, er målinger foretaget med disse prober ikke påvirket af changes i biosensor koncentration eller prøve belysning eller tykkelse. Endelig er begge biosensorer giver subcellulært rumlig opløsning. Faktisk har roGFP været målrettet til mitokondrier, ER, endosomer og peroxisomer ^24, og kan påvise ændringer i redoxtilstand af hver af disse organeller, stort set uafhængig af pH.

Protocol

1.. Transformation af gær celler med biosensorer

1. Omdan den ønskede gærstamme med plasmid bærende Mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 bruge lithiumacetatfremgangsmåden ^27.
2. For at bekræfte transformation med den plasmidbåret biosensor og for at forhindre tab af plasmidet, vælge og vedligeholde transformanter på passende selektivt syntetisk komplet medium (SC-Ura Mito-roGFP eller SC-Leu til mitGo-ATeam2). Hvis den fluorescerende probe er blevet subklonet i en anden plasmid end de her beskrevne, bruge passende selektivt medium. Visualiser transformanter ved fluorescens mikroskopi at bekræfte, at de udtrykker det fluorescerende biosensor og udviser normal mitokondrie morfologi.

2.. Vækst af celler og forberedelse til Imaging

Celle funktion og respons på lægemiddelbehandling er stærkt afhængige af celledensitet og metabolisk aktivitet. De bedste resultater opnås, når celleraktivt dividere (mid-log-fase, -0,5 - 1 x 10 ⁷ celler / ml). Den mest pålidelige måde at generere midt-logaritmisk fase kulturer af konsekvent densitet podning fra en stationær-fase præ-kultur.

1. Forbered en stationær-fase præ-kultur: vælge en enkelt koloni af transformerede celler fra en plade og inokulere selektive flydende medier (5 ml i en 50 ml konisk bund rør). Vokse ved 30 ° C med rystning ved 225 rpm, indtil den optiske tæthed af kulturen ved 600 nm _(OD600) har nået et plateau (24-48 timer).
2. Forbered en mid-log fase kultur for observation: Anvend den relevante mængde af præ-kulturen til podning af 5 ml selektive medier i en 50 ml konisk bund rør. YPD medier er autofluorescerende og bør ikke anvendes til disse undersøgelser. Brug syntetisk komplet, glucose baseret, frafald (SC-Ura) medier. Grow celler ved 30 ° C, rystning ved 225 rpm i 4-16 timer, indtil de når midt log-fase (-0,5 - 1 x 10 ⁷ celler / ml). Celledensitet kan bestemmesved at måle OD _{600 og} kalibrere Spektrofotometret at bestemme den korrekte _OD600 læsning. På vores Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), svarer midt-log-fase til en _OD600 på 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 sanser udsving i organel som reaktion på ændringer i stofskiftet. For eksempel, i dette assay mitokondrie redox tilstandsændringer når gær vokse på fermenterbare carbonkilder (f.eks glucose, som i SC medier) versus ikke-fermenterbare carbonkilder (fx glycerol, som i SGlyc medier), og selv i forskellige partier af samme medier. Brug derfor samme parti medierne for alle eksperimenter.

3. Celler er klar til fusion (se trin 2.4) og billedbehandling hvis ingen behandling udføres. Hvis cellerne bliver behandlet, inkuberes celler med den rette behandling og fortsætte til næste trin.
4. Koncentrat 1 ml kultur ved centrifugering ved 6.000 x g i 15 sek ogresuspension af cellepelleten i 20 ul medier. Disse betingelser maksimere antallet af skelnelige celler i synsfeltet.
5. Påfør 2 pi af de resuspenderede celler til et dias. Dæk med et dækglas (nr. 1.5, fortrinsvis højtydende 170 ± 5 um tykkelse), og forsegle kanterne af dækglasset med klar neglelak eller valap (se Reagenser). Til at tætne med valap, smelte en lille mængde på en metalspatel ved at holde det over en bunsenbrænder flamme, derefter sprede en lille mængde langs kanterne af dækglasset.
6. Opretholde cellerne ved 30 ° C under billedbehandling. En objektiv varmelegeme på 100x olieimmersion linse bruges til billedbehandling fungerer godt for denne ansøgning. Under disse betingelser, forbliver mitokondrie morfologi, redox tilstand og ATP niveauer uændret under billeddannelse til 10-15 min.

3.. Imaging Setup

1. Opsætning til billeddannelse mito-roGFP1 på et widescreen-field fluorescens mikroskop
   Trinene her er skræddersyet til den AxioObserver.Z1 mikroskop udstyret med en Colibri LED excitationskilde, en bred felt Orca ER kamera og AxioVision erhvervelse software. Fotoblegning af begge kanaler og fotoomdannelse af oxideret Mito-roGFP1 reduceres betydeligt ved at anvende LED-belysning i forhold til kviksølv buelampe belysning (se nedenfor).
   For at maksimere signal og opløsning, anvende den højeste numeriske åbning muligt i objektiv og den laveste forstørrelse, der giver tilstrækkelig rumlig opløsning. Derudover, for Mito-roGFP billeddannelse kontrollere, at målet transmitterer godt ved 365 nm. Den 100x/1.3NA EF PlanNeofluar målsætning (Zeiss) fungerer godt for denne ansøgning.
   Konfigurer købet software til at fange de oxiderede og reducerede Mito-roGFP1 arter. Vi bruger følgende betingelser.
   1. Konfigurer kanal for oxideret Mito-roGFP at bruge excitation ved 365 nm (100% lysdiode), og en emission filter egnet til GFP, såsom 38 HE filtrere sæt (Zeiss), med den medfølgende excitation filter fjernet fra kuben. Fjernelse af ekscitationsfilter tillader excitation ved både 365 nm og 470 nm uden behov for at skifte filtre, hvilket øger opnåelige tidsopløsning.
   2. Konfigurere kanal for reduceret mito-roGFP at bruge excitation ved 470 nm (100% lysdiode), og som nævnt ovenfor, det samme emissionsniveau filter terning anvendes til oxiderede Mito-roGFP. Indstil kameraet til 1x1 binning at optimere rumlig opløsning.
   3. Indstil software til at erhverve az stak bestående af 11 skiver med 0,5 um afstand, indsamling begge kanaler i hver z position. Denne tilstand overtagelsestidspunktet er langsommere end at erhverve hver z stak på skift, men det forhindrer artefakter skyldes mitokondrie bevægelse mellem erhvervelsen af ​​de oxiderede og reducerede kanaler.
   4. Billede flere celler at fastlægge en passende eksponeringstid, der producerer en stærk, men ikke mætte signal. Det er vigtigt at opretholde forholdet mellem eksponeringstider for oxideret og reduceret Mito-roGFP1 for alle eksperiments. For eksempel bør hvis eksponeringen tider for oxideret og reduceret Mito-roGFP1 er 300 og 100 millisekunder, så eksponeringstiden for oxideret Mito-roGFP1 være 3 gange, at for reduceret Mito-roGFP for alle forsøg.
2. Opsætning til billeddannelse mitGO-ATeam2 på en spektral konfokal mikroskop
   For at kvantificere ATP niveauer ved hjælp mitGO-ATeam2, fluorescens fra GFP (emission maksimum 510 nm) skal sondres mellem, at der fra OFP (emission maks. 560 nm). Der er fluorescens filter sæt, løse fluorescens afgives fra disse fluorophorer. Men vi finder, at en spektral detektor, som findes på mange laser scanning konfokal mikroskoper, der fungerer bedst for denne ansøgning. En spektral detektor adskiller fluorescensemission i mange komponenter (typisk 32 eller flere) i henhold til bølgelængde. Flere tilstødende bølgelængdebånd kan kombineres til ét billede kanal. De bølgelængder, der skal kombineres vælges empirisk, således at maksimere signalet fra GFP og OFP samtidig undgå crossover signal, der ville forvirre FRET måling. Brug den højeste numeriske blændeåbning rådighed. Vi bruger en 100x/1.49 eller 60x/1.49 Apo-TIRF linse. Vi bruger Nikon A1R konfokal mikroskop kører NIS Elements software. Konfigurer købet software til at fange de ATP-bundne og ATP-ubundet mitGO-ATeam2 arter. Vi bruger følgende betingelser.
   1. Indstil pinhole til 1,0 Airy enheder (AU), som i vores system svarer til az opløsning på omkring 0,42 um.
   2. Indstil scan zoom til at nærme sig Nyquist sampling grænse, som vil maksimere geografisk information i billedet. På vores system pixelstørrelse er 0,12 um.
   3. Fordi mitokondrier kan bevæge sig under billedbehandling, kan det være nyttigt at øge billeddannelseshastighed ved at beskære området til 512 x 256 pixels. Den samlede tid, der kræves til ét billede i vores system er 1,0 sek, herunder en 2-fold scanning gennemsnit. Afhængig af ønsket rumlig opløsning, kan feltet blive yderligere beskåret til stigendee tidsopløsning.
   4. Excite ved 488 nm, og indsamle emission 500-520 nm for GFP og 550-580 nm for OFP. Faktiske optimale værdier kan variere med karakteristika imaging system.
   5. Den optimale laser strøm til vores system er mellem 6,0 og 6,4%. Den optimale lasereffekt vil variere for hver mikroskop system, men vil ideelt set være så lav som muligt, mens stadig producerer et fortolkelige billede. Brug en intern eller ekstern power meter til at overvåge ændringer i laser magt, der opstår normalt over tid hos nogen optisk system.
   6. Juster detektor forstærkning og belysning lysintensitet at maksimere detekteret interval af pixelværdier, men undgå mætte signalet, for så mange celler som muligt. Analyserer ikke nogen celler, der indeholder mere end 1% mættede pixels. Billede alle prøver med samme formål, laser magt, scan zoom, pixelstørrelse, gain, og offset.

4.. Image Acquisition

1. Find den centrale pla ne af celler af interesse ved hjælp af transmitteret lys for at minimere blegning af fluorescerende probe.
2. Efter at have lokaliseret en eller flere celler af interesse, indsamle en z-serie gennem hele dybden af ​​en typisk celle (ca. 7 um) under anvendelse af en trinstørrelse på 0,5 um.
3. Billede andre celler af interesse på diaset, men ikke billedet et enkelt dias i længere tid end 15 min. Efter 15 min på diaset, mister cellerne levedygtighed.

5.. Analyse

Mitokondrie ATP bestemmes ved at måle forholdet mellem mitGO-ATeam2 emission ved 560 nm til at ved 510 nm ²⁷ redoxtilstanden af organel måles som reduceret til oxideret (R / O)-forhold af Mito-roGFP; dvs. emission ved 510 nm ved excitation ved 470 nm divideret med emission ved 510 nm ved excitation ved 365 nm. Før beregne forholdet, trække vi baggrund og bestemme en tærskelværdi for pixels tilhører den fluorescerende mitokondrier.

telt "> Det offentlige område (f.eks ImageJ ^30), eller kommercielt tilgængelige (fx Volocity, Perkin-Elmer) software kan bruges til analyse af Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam2. Afhængigt af den software, der bruges til billedbehandling erhvervelse og til analyse, billederne måske først skal konverteres til et andet format, f.eks TIFF, før du åbner dem i analyse software. Hvis billederne er konverteret, er det vigtigt at kontrollere, at pixel værdier ikke ændres under konverteringen. Analyse af mito-roGFP1 data, ved hjælp af begge programmer er beskrevet nedenfor. Program menuer og muligheder for at vælge inden for hver menu er fremhævet med fede typer og kursiv.

5.1 ImageJ analyse

1. Åbne billeder og ændre typen til 32 bit: Image → Type → 32 bit.
2. Tegn en region af interesse (ROI) i et område, hvor der ikke er celler. Beregn den gennemsnitlige intensitet i denne ROI: Analyser → Measure.
3. Fratræk den beregnede middelværdi baggrund fra stakken: Proces → Math → Subtract.
4. Brug af trækkes z-stack, find den midterste skive og tærskel på mitokondrier: Image → Juster → Threshold og klikke på Anvend på Threshold vinduet. Anvend på alle skiver i stakken. Check Indstil baggrund pixel til NaN.
5. Opret forholdet z stakken: Proces → Billede Calculator Divider reducerede stakken ved den oxiderede z stakken for Mito-roGFP1 analyse. Fordel 560 nm (ATP bundet) image ved 510 nm (ATP ubundet) image for mitGO-ATeam2 analyse.
6. Tegn en ROI omkring området af interesse. Vælg Analyze → Værktøjer → ROI Manager, og klik på Tilføj for at optage ROI. Flere regioner kan opbevares i manager. I ROI Manager al ROIs vælge og derefter vælge Mmalm → Multi-Measure at måle alle stack skiver. Eksportere data til et regneark til analyse.

5.2 Volocity analyse

1. Importere billeder ind i en Volocity bibliotek og skabe et billede sekvens med 2 kanaler.
2. Tegn en region af interesse (ROI) i et område, hvor der ikke er celler. Vælg: Tools → Ratio.
3. Brug Volocity at beregne baggrunden: Get From ROI.
4. Justér tærsklen til at omfatte mitokondrie strukturer.
5. Kontrollér muligheden for at anvende en regnbue LUT til forholdet kanal. Intensiteten-moduleret kanal kan give en mindre støjende billede til præsentation, men det bør ikke bruges til kvantificering af gennemsnitlige forhold.
6. Vælg Measurement fanen, vælg forholdet kanal og tegne en ROI omkring det område af interesse. Måle forholdet kanal, eksklusive nulværdier. Flere områder kan udvælges og målespå samme tid. Eksportere data til et regneark til analyse.

Representative Results

Måling mitokondrie redox tilstand med Mito-roGFP

Her viser vi, at Mito-roGFP1 har det dynamiske område at konstatere ændringer i mitokondrie redoxtilstanden fra fuldstændigt oxideret til reduceret i levende gærceller, uden at det påvirker gærcellevækst eller mitokondrie morfologi. Først finder vi celler, der udtrykker mitokondrier målrettet GFP og roGFP1 vokse med normale satser (figur 1A). Den maksimale vækstrate, som målt ved maksimal hældning på vækstkurven under log-fase vækst og tiden til at nå maksimal væksthastighed, er ens i celler, der udtrykker Mito-GFP og Mito-roGFP1. Endvidere mitokondrier i gær udtrykker Mito-roGFP1 udviser vildtype-morfologi (fig. 1B). Konkret er de rørformede, justere langs mor opløbet akse og ophobes ved spidserne af mor og datter celler. Da mitokondriedysfunktion ofte inducerer fragmentering denne normale morfologi støtter tanken om, at Mito-roGFP1 gørikke forstyrrer mitokondriefunktionen.

At vurdere dynamikområde Mito-roGFP1 behandlede vi mid-log fase vildtype gærceller med hydrogenperoxid (H ₂ O ₂₎ og dithiothreitol (DTT), henholdsvis, og målte den gennemsnitlige mitokondrie R / O-forhold for at vurdere mitokondrie redoxtrin (figur 2). Titrering med H ₂ O ₂ eller DTT 0-10 mM resulterer i en dosisafhængig ændring i det gennemsnitlige cellulære R / O-forhold med en afmålt interval fra 0,6 (under oxiderende betingelser) til 1,23 (under reducerende betingelser). Således Mito-roGFP1 er en effektiv biosensor til analyse af mitokondrie redox stat i levende celler.

Mito-roGFP1 tilbyder også subcellulær opløsning på mitokondrie redoxtrin. Denne subcellulære resolution afslører, at mitokondrier inden for de enkelte gærceller forskellige i relativ redox tilstand. Hvis mitokondrier i en enkelt gærcelle er funktionelt forskellige, er det muligt, aty er passivt eller aktivt adskilt (figur 3). En sådan adskillelse kunne bidrage til mor-datter alder asymmetri og foryngelse af datterceller. Dette fund understreger behovet for en biosensor med subcellulær opløsning på mitokondrie redoxtrin.

Det har længe været kendt, ³¹ at lys kan medføre ændringer i GFP kromoforen. Ved udsættelse for høj intensitet 400 nm lys, undergår roGFP1 fotoomdannelse til en art med en anden emissionsspektrum ^26. Når fotoomdannelse opstår, er der et fald i grøn emission fra oxideret Mito-roGFP1 og en stigning i grøn emission ved excitation af reduceret Mito-roGFP1, som ændrer forholdet R / O mito-roGFP1 (figur 4B). Hjælp af lav-intensitet excitation (f.eks belysning på 40% ved hjælp af 400 nm LED i Colibri lyskilde), er der ingen signifikant fotoomdannelse i den analyserede periode (figur 4C). P henvist måde at reducere fotoomdannelse er at vække den oxiderede form af roGFP ved 365 nm (se diskussion).

Måling mitokondrie ATP med mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 lokaliseres mitokondrier når det udtrykkes i pattedyrceller. ^27. Vi finder, at mitGO-ATeam2 colocalizes med DAPI-farvede mitokondrie-DNA i gær, og er fundet i rørformede strukturer er typiske for vildtype gær mitokondrier (fig. 5A). Således har vi bekræftet, at den mitokondrie målsekvens fra pattedyr cytochrom c-oxidase-underenhed VIIIA lokaliserer sonden for mitokondrier i gær uden at forstyrre mitokondrie morfologi. Derudover finder vi, at væksten i celler, der udtrykker mitGO-ATeam2 svarer til, at af celler, der udtrykker mitokondrier målrettet GFP i både glucose og glycerol medier (figur 5B). Således er ekspressionen af ​​mitGO-ATeam2 ikke forekommer skadelig for cellen eller mitokondrier.

_content "> Næste, vi testede, om mitGO-ATeam2 FRET reagerer på ændringer i mitokondrie ATP niveauer. at gøre det, vi behandlede celler med antimycin, et middel, der binder sig til cytochrom c reduktase hæmmer oxidation af ubiquinol i elektron transportkæden , forstyrrer protongradienten, og hæmmer mitokondrie ATP-produktion. ^20. Medianen FRET forholdet fald i celler behandlet med antimycin A (figur 6C).

Da beviser for, at mitGO-ATeam2 er en effektiv biosensor for mitokondrie ATP, brugte vi denne sonde til at overvåge mitokondrie ATP i gær, der blev opformeret ved hjælp af en fermenterbar eller ikke-fermenterbar kulstofkilde (figur 6A og 6B). Reduktionen i det samlede fluorescerende område glukose-dyrkede celler bekræftede at glukose undertrykkelse resulterer i et fald i mitokondrie overflod. Vi noterer celle-til-celle variation i niveauet af mitGO-ATeam2. Interessant, vores foreløbige data indikerer, at der ma y være forskelle i ATP i forskellige mitokondrier inden for samme celle (figur 6D).

Figur 1. Mito-roGFP1 registrerer mitokondrie redox tilstand uden at påvirke celle vækstrater eller mitokondrie morfologi. (A) Vækst af gær, der udtrykker mitokondrier målrettet GFP eller ro-GFP1 blev målt som ændringen i optisk densitet ved 600 nm som en funktion af tid med vækst i SC-Ura flydende medium ved 30 ° C. (B) Øvre paneler: Normal mitokondrie morfologi og lokalisering kanal i rå billeder. Lavere paneler: Ratio billeder viser den reducerede kanal divideret med den oxiderede kanal (farvereference til højre). Billederne viser virkningen af ​​tærskelværdien valg på resultater. Den optimale tærskel omfatter mitokondrie strukturer og udelukker baggrund.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

Figur 2. Mito-roGFP1 registrerer ændringer i mitokondrie redoxtilstanden i respons på behandling med hydrogenperoxid eller dithiothreitol. (AB) Mid-log fase gærceller udtrykker Mito-roGFP1 inkuberedes i SC-Ura medier med ingen behandling (0) eller med de angivne koncentrationer H ₂ O ₂ eller DTT i 20 minutter ved 30 ° C. (A) maksimal intensitet fremskrivninger af R / O mito-roGFP1 forholdet billeder er overlejret på gennemlysstativer billeder, der viser celle skitserer. Farven reference for Mito-roGFP1 vises øverst til højre. Bar:. 5 m (B) Klik her for at se større figur.

Figur 3. Mito-roGFP1 byder subcellulær opløsning på mitokondrie redoxtrin. En maksimal intensitet projektion af R / O mito-roGFP1 forholdet kanal er overlejret på en overført lys billede. Farven reference for Mito-roGFP1 vises øverst til højre. Bar: 5 uM. Denne særlige celle har en gennemsnitlig R / O mito-roGFP1 forholdet 0,88. Men individuel mitokondrier i denne celle viser forskellige redoxtilstande. De viste tal er den beregnede R / O mito-roGFP1 ratio for forskellige mitokondrie reregionerne. Klik her for at se større figur.

Figur 4.. Høj intensitet excitation fører til fotoomdannelse og ændret R / O mito-roGFP1 forhold. Mid-log fase gær udtrykker Mito-roGFP1 blev belyst med 400 nm lys ved 40% (A) eller 100% (B) strøm fra en LED lyskilde , og fluorescensen fra reduceret og oxideret Mito-roGFP1 blev fanget hver 4 sek. Viste billeder er maksimale projektioner, hvor farverne repræsenterer R / O forholdet Mito-roGFP1 (se farveskala i nederste højre). Bar:. 5 uM (C) R / O forholdet Mito-roGFP1 været konstant i imaging periode på belysning ved 40% LED strøm. Men ved belysning med 100% LED magt, viobservere en tidsafhængig ændring i F / O-forhold Mito-roGFP1, hvilket afspejler photoswitching af fluoroforen. Sorte firkanter, 40% LED magt,. Grå diamanter, 100% LED power Klik her for at se større figur.

Figur 5. MitGO-ATeam2 lokaliseres til mitokondrierne i gær og påvirker ikke gærcelle vækstrater. (A) Gær celler, der udtrykker mitGO-ATeam2 blev dyrket til midt-log-fase, fikseret med paraformaldehyd og farvet med DNA-bindende farvestof DAPI, som beskrevet tidligere . ^19. viste billeder er maksimal intensitet fremskrivninger af udfoldede z-serien. For overskuelighedens skyld blev mitGO-ATeam2 billeder opnået under anvendelse af en konventionel GFP filter, så de kun repræsenterer befolkningen ubundet til ATP. Cell udlinier er vist i hvidt. N: nuklear DNA. mtDNA: mitokondrie-DNA. Bar: 1 m (B) vækstkurver vildtype gærceller udtrykker mitokondrier målrettet GFP eller mitGO-ATeam2 i glucose-baseret (SC) og glycerol-baseret (SGlyc) flydende medier ved 30 ° C.. Disse data er gennemsnittet af quadruplicates for hver stamme på hvert tidspunkt, og er repræsentativt for to uafhængige forsøg. Klik her for at se større figur.

Figur 6.. MitGO-ATeam2 udtrykker udviklingen i ATP i gær mitokondrier ved subcellulær og suborganellar opløsning. (AB) Emission af mitGO-ATeam2 fra GFP (510 nm) og OFP (560 nm), og kvantificering af de 560/510 nm emission forholdet gær celler dyrket natten over i glucose-baserede (SC) (A) eller glycerol-baserede (SGlyc) (B) medier. Farven reference for 560/510 forholdet kanal vises nederst til højre. Bar:. 1 um (C) Kvantificering af 560/510 forholdet for celler opformeres i SGlyc medier med eller uden antimycin (2 ug / ml) i 1 time ved 30 ° C. Faldet i ATP niveauer upon antimycin behandling er statistisk signifikant (Kruskal-Wallis signifikans test). (D) 560 nm/510 nm forholdet mitGO-ATeam2 en mid-log fase vildtypecelle opformeret på SC medier. Farven reference for 560/510 forholdet kanal vises nederst til højre. Cellen omrids er vist i hvidt. Den gennemsnitlige 560/510 nm ratio for hele cellen er 0,43. De viste tal er de 560/510 nm nøgletal for bestemte regioner i mitokondrier. Bar: 1 um. Klik her for at se større figur.

Discussion

Her beskriver vi metoder til at bruge Mito-roGFP1 og mitGO-ATeam2 som biosensorer til at vurdere mitokondrie redoxtrin og ATP niveauer i levende gærceller. Vi finder, at ekspressionen af plasmidbårne Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterer i kvantitative mål for mitokondrier, uden nogen indlysende effekt på mitokondrie morfologi eller distributionen eller på cellulære vækstrater. ³ Mito-roGFP1 kan registrere ændringer i mitokondrie redoxtilstanden fra højt oxideret til stærkt reducerede tilstande. Tilsvarende kan mitGO-ATeam måle ændringer i mitokondrie ATP niveauer, der forekommer i gær under respiration-vækst og gær behandlet med en respiration inhibitor. Da begge biosensorer tilbyder subcellulær opløsning, kan de opdage heterogenitet i redox stat eller ATP niveauer af mitokondrier i de enkelte celler. Endelig da begge biosensorer er ratiometrisk sonder, er de ikke påvirkes af ændringer i koncentration eller variabilitet prøvetykkelse eller sygeumination. Disse sonder giver en minimalt invasiv tilgang til at studere mitokondriefunktionen med subcellulær opløsning i levende celler.

For at kunne anvende denne metode, bør billeder erhverves med det maksimalt mulige signal-støj-forhold. Et vigtigt første skridt er at undersøge cellerne 10-20 transformantkolonier under lup, og vælg dem med robust fluorescens og normal mitokondrie morfologi og vækstrater. Dernæst bør imaging betingelser optimeret til at frembringe høj, men ikke mætte, intensiteter uden at forårsage lysbeskadigelse til den fluorescerende protein eller cellerne. Et par celler i en population (<1%) kan have en særlig høj eller lav samlet fluorescens som følge af variation i antallet af plasmidkopier og disse kan ses bort til fordel for indfange fortolkelige billeder af de fleste celler.

Mens fordelene ved Mito-roGFP er klare, er det også vigtigt at være opmærksom på mulige faldgruber. Vi registrererforskelle i mitokondrie redox potentiale, ikke kun med kulstof kilde-inducerede forskelle i cellens stofskifte, men også efter opformering af gær i forskellige partier af samme medium. Derfor skal der udvises forsigtighed ved valg cellevækstmedier for mitokondrie redox målinger. Selv Mito-roGFP giver helt rumlig opløsning af mitokondrie redoxtrin, tidsmæssige opløsning af roGFP er ikke tilstrækkeligt til at påvise udbrud af ROS der er forbundet med ROS signaltransduktion ^31. Endelig skal der udvises forsigtighed, når de vælger excitationsbølgelængden og intensitet for den oxiderede form af roGFP. Belysning ved 400 nm optimalt ophidser de oxiderede arter af roGFP. Imidlertid også ophidser reduceret roGFP i højere grad sammenlignet med excitation ved 365 nm. Dette fører til nedsat følsomhed i måling mitokondrie redoxtrin. Endvidere eksponering af Mito-roGFP1 til høj intensitet belysning ved 400 nm fører til fotoomdannelse af proteinet til en specerne med ændrede spektrale egenskaber. Vi har ikke set fotoomdannelse på høj intensitet belysning ved 365 nm. Derfor anbefaler vi excitation hjælp 365 nm, hvis muligt.

MitGO-ATeam2 har også begrænsninger. For eksempel er det da mitGO-ATeam2 er i sig selv et protein kan blive beskadiget af cellulære fornærmelser, herunder reaktive ilt arter, som kan svække dets biosensor aktivitet. Derudover skal GFP og OFP emissionsbølgelængder (510 og 560 nm) løses for FRET analyse, hvilket kan være vanskeligt på konventionelle fluorescens mikroskoper.

I modsætning til in vitro enzymassays, indberette disse levende celle assays relative ændringer i mitokondrie ATP eller redox tilstand og måler ikke den absolutte koncentration af ATP eller reduceret cystein. Selv om en standardkurve teoretisk kunne genereres ved at måle udslaget af sensor proteiner i opløsning, kan dette ikke gælde for de forskellige molekylære miljø i mitokondrier. Ther nden, disse assays giver et middel til at sammenligne celler under forskellige betingelser. Derudover varierer imaging betingelser, så de nøjagtige forholdsværdier erhvervet på én imaging setup må ikke blive gentaget på en anden.

Disse teknikker til forholdet billeddannelse kan tilpasses til andre ratiometrisk indikatorer, herunder andre roGFP eller GO-ATeam isoformer og andre funktionelle prober. Valget af bredt felt eller konfokal mikroskopi vil afhænge af sonden og den rumlige ønskede opløsning. Den bredt synsfelt metode blev anvendt her til Mito-roGFP fordi det giver mulighed for excitation ved 365 nm, hvilket forbedrer følsomhed og stabilitet af sensoren. Den konfokal metoden med en spektral detektor, som bruges her til mitGO-Ateam, giver en bekvem måde at fjerne emission crossover ved at justere de spektrale detektionsvinduer. Men det er muligt at udføre lignende forsøg i wide-field mikroskopi ved hjælp af brugerdefinerede filtre eller fjerne crossover beregningsmæssigt.

ntent "> Den mest almindelige vanskeligheder i denne type billeddannelse eksperiment er utilstrækkelig signal. Imaging hardware (især objektiv og detektor) er afgørende for at indsamle nok signal til at fortolke dataene.

De tærsklingsprocesparametre skridt har stor indflydelse på resultaterne, da inddragelse af baggrunden pixels kan dæmpe eventuelle tendenser i de opnåede nøgletal. Automatiske metoder er at foretrække, men på grund af begrænset signal, manuel tærskelværdiansættelse er ofte den bedste tilgængelige metode. Hvis manuelle tærskler anvendes, bør de anvendte kriterier artikuleres så godt som muligt, og analyse skal muligvis udføres blinde eller af forskellige eksperimentatorer at demonstrere reproducerbarhed. Kontrolforsøg med antimycin (for mitGO-Ateam2) og H ₂ O ₂ eller DTT (Mito-roGFP) kan anvendes til at bekræfte de forventede ændringer i fluorescens forhold.

Mito-roGFP og mitGO-ATeam2 er non-invasive, ratiometrisk sonder til overvågning mitochondrial fitness i levende gærceller. De ratiometrisk sensorer, som bruges her, var rettet til mitokondrier ved fusion af mitokondrier-specifikke signal-sekvenser. Andre cellulære rum kunne undersøges med tilsætning af egnede målsekvenser til de oprindelige sensorer. Desuden er det muligt at kombinere begge disse sensorer med komplementære fluorescerende markører (fx til organeller eller signalering faktorer) eller følere (f.eks calcium) til samtidig flere processer i levende celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/