Summary
Descriviamo l'uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati, che si basano sulla GFP, per monitorare lo stato redox mitocondriale e livelli di ATP a risoluzione subcellulare in vita cellule di lievito.
Abstract
I mitocondri hanno ruoli in molti processi cellulari, dal metabolismo energetico e l'omeostasi del calcio per controllare di vita cellulare e morte cellulare programmata. Questi processi influenzano e sono influenzate dallo stato redox e della produzione di ATP dai mitocondri. Qui, descriviamo l'uso di due raziometrici, biosensori geneticamente codificati che possono rilevare mitocondriale stato redox e livelli di ATP a risoluzione sub-cellulare in cellule di lievito vive. Stato redox mitocondriale è misurata utilizzando redox-sensibili proteina fluorescente verde (roGFP), che si rivolge alla matrice mitocondriale. Mito-roGFP contiene cisteine nelle posizioni 147 e 204 della GFP, che subiscono ossidazione e riduzione reversibile e ambiente-dipendente, che a sua volta altera lo spettro di eccitazione della proteina. MitGO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda in cui la subunità ε della F o F 1-ATP sintasi è inserita tra FRET donatore e accettore fluoproteine centi. Legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il donatore e accettore FRET in stretta vicinanza e per consentire il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza dal donatore al accettore.
Introduction
I mitocondri sono organelli essenziali per la produzione di ATP, la biosintesi di aminoacidi, acidi grassi, ferro eme, ammassi di zolfo e pirimidine. I mitocondri svolgono anche un ruolo fondamentale nell'omeostasi del calcio e nella regolazione dell'apoptosi. 1 crescenti prove link mitocondri di invecchiamento e malattie legate all'età come il morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica, e la malattia di Huntington. 2 Mentre gli individui vivono tutta la loro vita con mutazioni nelle proteine mitocondriali che sono associate con malattie neurodegenerative, i sintomi della malattia si verificano solo tardi nella vita. Questo indica che i cambiamenti avvengono nei mitocondri con l'età che permettono malattia patologia ad emergere. Infatti, fitness mitocondriale è correlata con la salute generale delle cellule e la durata della vita nei lieviti e cellule di mammifero. 3,4 Qui, descriviamo come utilizzare biosensori fluorescenti geneticamente codificati, raziometriche per valutare due aspetti critici della Mitochondria in cellule di lievito vive: stato redox e livelli di ATP.
Funzione mitocondriale in aerobico mobilitazione energia è ben stabilita. Stato redox mitocondriale è un prodotto di ossidanti e riducenti specie nel organello, compresi NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutatione / glutatione disolfuro (GSH / GSSG) e specie reattive dell'ossigeno (ROS). Sganciamento mitocondri o ipossia interessa l'attività respiratoria mitocondriale e altera il rapporto di NAD + in NADH in organello. ROS, che sono prodotte dal trasferimento di elettroni inefficiente tra i complessi della catena di trasporto degli elettroni nella membrana mitocondriale interna, così come dalla deaminazione di amine tramite monoamino-ossidasi nella membrana mitocondriale esterna 5, lipidi danni, proteine e acidi nucleici e hanno stato collegato a invecchiamento e le malattie neurodegenerative associate all'età 6,7,8. ROS anche svolgere un ruolo nella trasduzione del segnale in mitochondria, attraverso l'ossidazione di GSH. Ad esempio, NADH deidrogenasi contribuisce non solo alla produzione di ROS, ma anche è regolata attraverso le interazioni con il pool di glutatione 9,10. deidrogenasi α-chetoglutarato e aconitasi, componenti del ciclo TCA, mostrano un'attività ridotta in ambienti ossidanti 11,12.
Infatti, regolazione redox-dipendente di attività aconitasi è conservato dai batteri ai mammiferi 13,14. Pertanto, il monitoraggio dello stato redox e livelli di ATP di mitocondri è fondamentale per capire la loro funzione e il ruolo nella malattia di patologia.
Metodi biochimici sono stati utilizzati per valutare lo stato redox o livelli di ATP di cellule intere o mitocondri isolati. I metodi utilizzati per valutare lo stato redox delle cellule intere o mitocondri isolati si basano sulla misurazione dei livelli della coppia redox GSH / GSSG 15. Il sistema luciferina-luciferasi viene comunemente utilizzato per misurare mitocondrialeLivelli di ATP nelle cellule intere sia permeabilizzate o mitocondri isolati. 16,17,18,19,20 In questo saggio, luciferasi lega alla ATP e catalizza l'ossidazione di chemiluminescenza e dalla luciferina. 21 L'intensità della luce emessa è proporzionale alla quantità di ATP nella miscela di reazione. 22
Questi metodi hanno rivelato informazioni fondamentali riguardanti la funzione mitocondriale, tra cui la constatazione che i pazienti con malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer, hanno livelli anormalmente bassi di ATP. 23 Tuttavia, essi non possono essere usati a vivere immagine, cellule intatte. Inoltre, metodi basati su analisi a cellule forniscono una media di stato redox o livelli di ATP in tutti i compartimenti della cellula. Misure in organelli isolati sono potenzialmente problematico perché mitocondriale stato redox o livelli di ATP possono cambiare durante il frazionamento subcellulare. Infine, recenti studi del nostro laboratorio e altri indicano chemitocondri all'interno delle singole celle sono eterogenei in funzione, che a sua volta influenza la durata della vita delle cellule madre e figlia. 3 Quindi, vi è la necessità di misurare i livelli di ATP mitocondriale e lo stato redox nelle cellule viventi con risoluzione sub-cellulare.
I biosensori per la funzione mitocondriale descritti qui sono entrambi basati su GFP. GFP redox-sensibile (roGFP) 24,25 è una variante di GFP in cui superficie esposti cisteine vengono aggiunti alla molecola. roGFP, come wild-type GFP, ha due picchi di eccitazione (a ~ 400 nm e 480 nm ~) e un picco di emissione a ~ 510 nm. Ossidazione dei residui di cisteina nei risultati roGFP in un aumento di eccitazione a 400 nm. Riduzione di quei cisteine favorisce eccitazione a ~ 480 nm. Perciò, il rapporto di 510 nm di emissione di roGFP upon eccitazione a 480 nm e 400 nm rivela la quantità relativa di ridotta e ossidata roGFP, che riflette lo stato redox dell'ambiente del fluoroforo.
Due versioni di roGFP sono ampiamente utilizzati: roGFP1 e roGFP2. Entrambi contengono gli stessi inserimenti cisteina. roGFP1 è basato sulla GFP wild-type e roGFP2 si basa su S65T GFP, che ha più efficiente eccitazione a 480 nm e meno efficiente eccitazione a 400 nm rispetto al wtGFP 24. roGFP1 pH è meno sensibile rispetto roGFP2 e la sua gamma dinamica prosegue nel range ridotto. Così, roGFP1 può essere più utile per monitorare comparti più riducenti come i mitocondri e il citosol, e scomparti con pH variabile, come endosomi. roGFP2 offre segnale luminoso e, in alcuni studi, una più ampia gamma dinamica rispetto roGFP1 24,26. Studi in Arabidopsis thaliana indicano che il tempo necessario per rispondere alle variazioni di stato redox è simile per entrambi i sensori (t ½ per l'ossidazione, 65 e 95 sec e t ½ per la riduzione, 272 e 206 sec, per roGFP1 e roGFP2, rispettivamente). 26
MitGO-ATeam2 è un mini-invasiva, affidabilesensore che misura ATP mitocondriale nella nascente lievito Saccharomyces cerevisiae. GO-Ateam è un trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sonda che consiste della subunità ε della F o F 1-ATP sintasi FRET sandwich tra donatore e accettore proteine fluorescenti (GFP e arancio proteina fluorescente (OFP), rispettivamente). 27 legame di ATP ai risultati subunità ε nei cambiamenti conformazionali nella proteina che portano il FRET donatore in prossimità del accettore e il trasferimento di energia dal donatore accettore. Ci sono due varianti di GO-Ateam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 ha una maggiore affinità per MgATP rispetto GO-ATeam1, rendendolo più adatto per misurare l'tipicamente inferiore [ATP] nei mitocondri rispetto al citosol. 27
Per sondare stato redox mitocondriale, abbiamo costruito una proteina di fusione (mito-roGFP1) costituito roGFP1 fusa alla sequenza leader di un ATP9nd espressa da un'espressione lievito centromero-based (basso numero di copie) plasmide sotto controllo del forte deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GPD) promotore (p416GPD, Addgene). Abbiamo usato roGFP1 per sondare lo stato redox dei mitocondri nel contesto di invecchiamento del modello fungo Saccharomyces cerevisiae. Troviamo che roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale che si verificano durante l'invecchiamento e in risposta alla disponibilità di nutrienti, ma non ha alcun effetto negativo sulla apparente cellule di lievito. Vediamo anche la variabilità dello stato redox dei mitocondri all'interno delle singole cellule di lievito viventi, un risultato che sottolinea l'importanza di un biosensore con subcellulare risoluzione spaziale.
MitGO-ATeam2 è una variante del GO-ATeam2, che ha la sequenza segnale mitocondriale di citocromo c ossidasi subunità VIII inserito al terminale amminico di GO-ATeam2 27. Abbiamo modificato la sonda mitGO-ATeam2 (gentilmente fornite dal laboratorio di H. Noji, Istituto of Ricerca Scientifica e Industriale, Università di Osaka, Giappone) per l'uso nel lievito da subclonaggio esso, tramite Xba1 e siti HindIII, nel vettore di espressione di lievito pAG415GPD-CCDB (Addgene, Cambridge, MA, USA), che è un low-copia plasmide contenente il promotore costitutivo forte GPD. Abbiamo espresso mitGO-ATeam2 in lievito in erba, e troviamo, dalla controcolorazione con il colorante DAPI legame al DNA, che si localizza esclusivamente ai mitocondri, dove serve come una sonda efficace per misurare i cambiamenti fisiologici nei livelli di ATP mitocondriale.
roGFP e GO-Ateam sono entrambi geneticamente codificati. Come risultato, essi possono essere introdotti e mantenuti stabilmente in cellule intatte, e forniscono informazioni su stato redox o livelli di ATP in singole, cellule viventi. Inoltre, entrambi i biosensori monitorare i cambiamenti di stato redox o livelli di ATP che si verificano in condizioni fisiologiche. 28 Entrambe le sonde sono anche ratiometrica. Come risultato, le misurazioni effettuate con queste sonde non risentono chaNGES nella concentrazione biosensore o l'illuminazione del campione o spessore. Infine, entrambi i biosensori forniscono subcellulare risoluzione spaziale. Infatti, roGFP è stato preso di mira da mitocondri, ER, endosomi e perossisomi 24, e in grado di rilevare i cambiamenti di stato redox di ciascuno di questi organelli, in gran parte indipendenti di pH.
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Protocol
1. Trasformazione di cellule di lievito con i biosensori
- Trasforma il ceppo di lievito desiderato con cuscinetto plasmide mito-roGFP o mitGO-ATeam2 con il metodo acetato di litio 27.
- Per confermare la trasformazione con il biosensore plasmide-borne e per evitare la perdita del plasmide, selezionare e mantenere trasformanti sul appropriato terreno selettivo completo sintetico (SC-Ura di mito-roGFP, o SC-Leu per mitGo-ATeam2). Se la sonda fluorescente è stato subclonato in un plasmide diversa da quelle qui descritte, utilizzare il terreno selettivo appropriato. Visualizza trasformanti mediante microscopia a fluorescenza per confermare che essi esprimono il biosensore fluorescente ed esporre normale morfologia mitocondriale.
2. Crescita delle cellule e preparazione per l'imaging
Funzione delle cellule e la risposta al trattamento farmacologico sono altamente dipendenti dalla densità cellulare e l'attività metabolica. I migliori risultati si ottengono quando le cellulestanno dividendo attivamente (fase mid-log, ~ 0,5-1 x 10 7 cellule / ml). Il modo più affidabile per generare metà log fase culture di densità costante è per inoculare da una fase stazionaria di pre-cultura.
- Preparare una fase stazionaria di pre-cultura: scegliere una singola colonia di cellule trasformate da un piatto e inoculare i terreni liquidi selettivi (5 ml in una provetta a fondo conico 50). Crescere a 30 ° C con agitazione a 225 rpm finché la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) ha raggiunto un plateau (24-48).
- Preparare una cultura fase mid-log per l'osservazione: utilizzare l'appropriato volume di pre-cultura per inoculare 5 ml di terreno selettivo in una provetta a fondo conico 50. YPD media è autofluorescente e non deve essere usato per questi studi. Usa, glucosio basato, dropout (SC-Ura) mezzi completi sintetici. Crescere le cellule a 30 ° C, agitando a 225 giri al minuto, per 4-16 ore, fino a raggiungere fase di mid-log (~ 0,5-1 x 10 7 cellule / ml). Densità cellulare può essere determinatamisurando OD 600; calibrare lo spettrofotometro per determinare il corretto OD 600 lettura. Sul nostro Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), metà fase log corrisponde ad un OD 600 di 0,1-0,3.
Mito-roGFP1 sensi fluttuazioni del organello in risposta ai cambiamenti metabolici. Per esempio, in questo saggio mitocondriali modifiche dello stato redox quando il lievito crescere su fonti di carbonio fermentabili (ad esempio glucosio, come in SC media) rispetto a fonti di carbonio non fermentescibili (ad esempio glicerolo, come in SGlyc media), e anche in diverse partite della stessa media. Pertanto, utilizzare lo stesso lotto di terreno, per tutti gli esperimenti.
- Cellule sono pronte per la concentrazione (vedi punto 2.4) e l'imaging se nessun trattamento è in corso. Se le cellule vengono trattate, incubare le cellule con il trattamento desiderato e proseguire alla fase successiva.
- Concentrare 1 ml di coltura mediante centrifugazione a 6000 xg per 15 sec erisospensione del pellet cellulare in 20 l di media. Queste condizioni massimizzare il numero di cellule distinguibili nel campo di vista.
- Applicare 2 ml delle cellule risospese ad una diapositiva. Coprire con un vetrino coprioggetto (n. 1.5, preferibilmente ad alte prestazioni 170 ± 5 micron di spessore), e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente o valap (vedi Reagenti). Per sigillare con valap, fondere una piccola quantità su una spatola metallica tenendolo su un becco Bunsen, poi diffondere una piccola quantità lungo i bordi del coprioggetto.
- Mantenere le cellule a 30 ° C durante l'imaging. Un riscaldatore obiettivo sul 100x obiettivo a immersione in olio utilizzato per l'imaging funziona bene per questa applicazione. In queste condizioni, la morfologia mitocondriale, stato redox e livelli di ATP rimangono invariati durante l'imaging per 10-15 min.
3. Setup Imaging
- Impostazione per l'imaging mito-roGFP1 su un ampio campo di microscopio a fluorescenza
I passi qui sono su misura per il AxioObserver.Z1 microscopio dotato di un LED sorgente di eccitazione Colibri, un grande campo Orca ER fotocamera e software di acquisizione AxioVision. Fotodecolorazione di entrambi i canali e le foto conversione di ossidati mito-roGFP1 è ridotto in modo significativo utilizzando l'illuminazione a LED rispetto a vapori di mercurio illuminazione lampada (vedi sotto).
Per massimizzare il segnale e la risoluzione, utilizzare la più alta apertura numerica possibile l'obiettivo, e l'ingrandimento più basso che fornisce sufficiente risoluzione spaziale. Inoltre, per i mito-roGFP di imaging, verificare che l'obiettivo trasmette bene a 365 nm. Il 100x/1.3NA CE PlanNeofluar obiettivo (Zeiss) funziona bene per questa applicazione.
Configurare il software di acquisizione per catturare le specie di mito-roGFP1 ossidato e ridotto. Usiamo le seguenti condizioni.- Configurare il canale per ossidato mito-roGFP utilizzare eccitazione a 365 nm (100% di energia LED) e un filtro di emissione adatto per GFP, come il 38 HE filtra set (Zeiss), con la excitatio inclusofiltro n rimossa dal cubo. Rimozione del filtro di eccitazione consente di eccitazione a 365 nm entrambi e 470 nm, senza la necessità di cambiare i filtri, aumentando così risoluzione temporale realizzabile.
- Configurare il canale per ridotta mito-roGFP utilizzare eccitazione a 470 nm (100% di potenza del LED) e, come già detto, lo stesso cubo filtro per le emissioni utilizzato per la ossidato mito-roGFP. Impostare la fotocamera in binning 1x1 per ottimizzare la risoluzione spaziale.
- Impostare il software per l'acquisizione pila az composta da 11 fette con spaziatura 0,5 micron, la raccolta di entrambi i canali in ogni posizione z. Questa modalità di acquisizione è più lenta di acquisire ogni pila z a turno, ma impedisce artefatti derivanti dal movimento mitocondriale tra acquisizione dei canali ossidato e ridotto.
- Immagini diverse celle per determinare un tempo di esposizione appropriato, producendo un segnale forte ma non saturante. È importante mantenere il rapporto di tempi di esposizione per ossidata e ridotta mito-roGFP1 per tutti esperimentos. Per esempio, se i tempi di esposizione per ossidati e ridotti mito-roGFP1 sono 300 e 100 msec, allora il tempo di esposizione per ossidato mito-roGFP1 dovrebbe essere di 3 volte che per ridurre mito-roGFP per tutti gli esperimenti.
- Impostazione per l'imaging mitGO-ATeam2 su un microscopio confocale spettrale
Per quantificare i livelli di ATP utilizzando mitGO-ATeam2, la fluorescenza di GFP (emissione di massimo 510 nm) deve essere distinto da quello di OFP (emissione massima 560 nm). Ci sono fluorescenza set di filtri che risolvono la fluorescenza emessa da questi fluorofori. Tuttavia, troviamo che un rivelatore spettrale, disponibile su microscopi a scansione confocale molti laser, funziona meglio per questa applicazione. Un rivelatore spettrale separa l'emissione di fluorescenza in molti componenti (tipicamente 32 o più) secondo la lunghezza d'onda. Diverse bande di lunghezza d'onda adiacenti possono essere combinati in un canale dell'immagine. Le lunghezze d'onda per essere combinati sono selezionati empiricamente in modo da massimizzare il segnale da GFP e OFP, evitando di crossover di segnale che potrebbero confondere la misura FRET. Usare la massima apertura numerica della lente disponibile. Usiamo un 100x/1.49 o 60x/1.49 obiettivo Apo-TIRF. Usiamo la Nikon A1R microscopio confocale in esecuzione il software NIS Elements. Configurare il software di acquisizione per catturare le specie mitGO-ATeam2 ATP-bound e ATP-non legato. Usiamo le seguenti condizioni.- Impostare pinhole a 1.0 unità di Airy (AU), che sul nostro sistema corrisponde alla risoluzione az di circa 0,42 micron.
- Impostare scansione zoom per avvicinarsi al limite di campionamento di Nyquist, che consentirà di massimizzare l'informazione territoriale nella immagine. Sul nostro sistema la dimensione dei pixel è 0,12 micron.
- Poiché i mitocondri possono muoversi durante l'imaging, può essere utile per aumentare la velocità di imaging da ritaglio il campo a 512 x 256 pixel. Il tempo totale richiesto per immagine di un frame nel nostro sistema è di 1,0 sec, compresa una media di scansione 2 volte. A seconda della risoluzione spaziale desiderata, il campo può essere ulteriormente tagliata per aumene risoluzione temporale.
- Excite a 488 nm, e raccogliere emissione 500-520 nm per GFP, e 550-580 nm per OFP. Valori ottimali effettivi possono variare le caratteristiche del sistema di imaging.
- La potenza del laser ottimale per il nostro sistema è compresa tra 6,0 e 6,4%. La potenza del laser ottimale varia per ogni sistema di microscopio, ma sarà idealmente essere la più bassa possibile, pur producendo un'immagine interpretabile. Utilizzare un misuratore di potenza interno o esterno per monitorare l'andamento del potere del laser, che si verificano normalmente nel corso del tempo in un sistema ottico.
- Regolare il guadagno del rivelatore e l'intensità della luce di illuminazione per massimizzare l'intervallo di valori di pixel rilevato ma evitare di saturare il segnale, per altrettanti possibile di cellule. Non analizzare eventuali cellule contenenti più del 1% pixel saturi. Immagine tutti i campioni con lo stesso obiettivo, potenza del laser, scansione zoom, dimensione dei pixel, guadagno e offset.
4. Acquisizione di immagini
- Individuare il pla focale ne di cellule di interesse con luce trasmessa per minimizzare la sbianca sonda fluorescente.
- Dopo aver individuato una o più celle di interesse, raccogliere una serie z attraverso tutta la profondità di una tipica cellula (circa 7 micron) utilizzando una dimensione di passo di 0,5 micron.
- Immagine altre cellule di interesse sulla diapositiva, ma non una immagine singola diapositiva per più di 15 min. Dopo 15 min sulla diapositiva, le cellule perdono la vitalità.
5. Analisi
ATP mitocondriale livello è determinato misurando il rapporto dell'emissione mitGO-ATeam2 a 560 nm a 510 nm che a 27 Lo stato redox della organello viene misurato come ridotto a ossidato (R / O) rapporto di mito-roGFP;. Ie emissione a 510 nm su di eccitazione a 470 nm divisa per emissione a 510 nm su di eccitazione a 365 nm. Prima di calcolare il rapporto, sottraiamo fondo e determinare un valore soglia per pixel appartenenti al fluorescente mitocondri.
tenda "> dominio pubblico (ad es ImageJ 30) o disponibile in commercio (ad es Volocity, Perkin-Elmer) software può essere utilizzato per l'analisi di mito-roGFP1 o mitGO-ATeam2. seconda del software utilizzato per l'acquisizione delle immagini e di analisi, le immagini può prima devono essere convertiti in un altro formato, come TIFF, prima di aprire nel software di analisi. Se le immagini vengono convertite, è essenziale verificare che i valori dei pixel non vengono modificati durante la conversione. Analisi di Mito-roGFP1 dati, utilizzando entrambi i programmi è descritto di seguito. menu del programma e le opzioni da selezionare all'interno di ciascun menu sono evidenziate in corsivo grassetto.5.1 analisi ImageJ
- Aprire le immagini e il cambiamento di tipo a 32 bit: Immagine → Tipo → 32 bit.
- Disegnare una regione di interesse (ROI) in una zona dove non ci sono le cellule. Calcolare l'intensità media in questo ROI: Analizzare → Misura.
- Sottrarre il fondo medio calcolato dalla pila: Processo → Matematica → Sottrai.
- Utilizzando la sottratto z-stack, trovare la fetta centrale e la soglia di mitocondri: Immagine → Regola → Soglia e fare clic su Applica nella finestra di Threshold. Applica a tutte le sezioni della pila. Selezionare Imposta pixel di sfondo a NaN.
- Creare il rapporto z pila: Processo → Calcolatrice Immagine dividere la pila ridotta dallo stack z ossidato per l'analisi di mito-roGFP1. Dividere l'immagine 560 nm (ATP bound) dai 510 nm di immagine (ATP legato) per l'analisi mitGO-ATeam2.
- Disegnare un ROI intorno alla zona di interesse. Scegliere Analizza → Strumenti → ROI Manager e fare clic su Aggiungi per registrare il ROI. Regioni multiple possono essere memorizzati nel gestore. In ROI Manager, selezionare tutte le ROI, quindi scegliere Mminerale → Multi-Misura per misurare tutte le fette di stack. Esportare i dati in un foglio di calcolo per l'analisi.
5.2 analisi Volocity
- Importare le immagini in una libreria Volocity e creare una sequenza di immagini a 2 canali.
- Disegnare una regione di interesse (ROI) in una zona dove non ci sono le cellule. Scegli: Strumenti → Rapporto.
- Utilizzare Volocity per calcolare il fondo: ottenere da ROI.
- Regolare la soglia per includere strutture mitocondriali.
- Verificare la possibilità di applicare una LUT arcobaleno al canale rapporto. Il canale intensità modulata può produrre un'immagine meno rumorosa per presenta-zione, ma non dovrebbe essere utilizzato per la quantificazione del rapporto medio.
- Selezionare la scheda di misura, selezionare il canale di rapporto e disegnare un ROI intorno alla zona di interesse. Misurare il canale di rapporto, escludendo i valori zero. Regioni multipli possono essere selezionati e valutatiallo stesso tempo. Esportare i dati in un foglio di calcolo per l'analisi.
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Representative Results
Misurare stato redox mitocondriale con mito-roGFP
Qui, dimostriamo che mito-roGFP1 ha la gamma dinamica per rilevare cambiamenti di stato redox mitocondriale da completamente ossidato a ridotto in cellule di lievito vive, senza influenzare la crescita delle cellule di lievito o la morfologia mitocondriale. In primo luogo, troviamo cellule che esprimono GFP mitocondri mirati e roGFP1 crescono a ritmi normali (Figura 1A). Il tasso di crescita massimo, misurato dalla massima pendenza della curva di crescita durante la fase di crescita logaritmica e il tempo per raggiungere il tasso di crescita massimo, è simile in cellule che esprimono mito-GFP e mito-roGFP1. Inoltre, i mitocondri nel lievito che esprime mito-roGFP1 mostra morfologia wild-type (Figura 1B). In particolare, essi sono tubolari, allineati lungo l'asse madre con auricolari, e si accumulano sulla punta delle cellule madre e figlia. Dal momento che la disfunzione mitocondriale spesso induce la frammentazione, la morfologia normale sostiene l'idea che il mito-roGFP1 fanon turbare la funzione mitocondriale.
Per valutare la gamma dinamica del mito-roGFP1, abbiamo trattato metà di log di fase le cellule di lievito wild-type con il perossido di idrogeno (H 2 O 2) e ditiotreitolo (DTT), rispettivamente, e misurato il rapporto medio mitocondriale R / O per valutare mitocondriale stato redox (Figura 2). Titolazione con H 2 O 2 o DTT 0-10 mM risultati in una variazione dipendente dalla dose in rapporto medio di cellulare R / O con una gamma misurata da 0,6 (in condizioni ossidanti) a 1,23 (condizioni riducenti). Così, mito-roGFP1 è un biosensore efficace per l'analisi di stato redox mitocondriale nelle cellule viventi.
Mito-roGFP1 offre anche subcellulare risoluzione di stato redox mitocondriale. Questa risoluzione subcellulare rivela che i mitocondri all'interno delle cellule di lievito individuali differiscono in relativo stato redox. Se mitocondri all'interno di una singola cellula di lievito sono funzionalmente distinte, è possibile che lay sono passivamente o attivamente segregata (Figura 3). Tale segregazione potrebbe contribuire ad invecchiare madre-figlia asimmetria e il ringiovanimento delle cellule figlie. Questi risultati sottolineano la necessità di un biosensore con subcellulare risoluzione di stato redox mitocondriale.
E 'noto da tempo che la luce 31 può indurre variazioni del cromoforo GFP. Dopo l'esposizione alla luce ad alta intensità di 400 nm, roGFP1 subisce fotoconversione di una specie con un diverso spettro di emissione 26. Quando si verifica fotoconversione, vi è una diminuzione della emissione verde da ossidato mito-roGFP1 e un aumento di emissione verde momento di eccitazione ridotta mito-roGFP1, che altera il rapporto R / O mito-roGFP1 (Figura 4B). Utilizzando eccitazione (es illuminazione a 40% utilizzando i 400 nm LED nella sorgente di luce Colibri) bassa intensità, non vi è alcuna fotoconversione significativa durante il periodo analizzato (Figura 4C). Il p modo indicato per ridurre fotoconversione è di eccitare la forma ossidata di roGFP a 365 nm (vedi discussione).
Misurazione ATP mitocondriale con mitGO-ATeam2
MitGO-ATeam2 localizza ai mitocondri, quando espresso in cellule di mammifero. 27 Troviamo che mitGO-ATeam2 colocalizza con DAPI macchiato di DNA mitocondriale in lievito, e si trova in strutture tubolari tipiche di wild-type mitocondri di lievito (Figura 5A). Così, abbiamo verificato che la sequenza di targeting mitocondriale dal mammiferi citocromo c ossidasi subunità VIIIA localizza la sonda di mitocondri nel lievito senza interrompere la morfologia mitocondriale. Inoltre, troviamo che il tasso di crescita di cellule che esprimono mitGO-ATeam2 è simile a quella delle cellule che esprimono GFP mitocondri mirati in sia il glucosio e dei media glicerolo (Figura 5B). Pertanto, l'espressione di mitGO-ATeam2 non sembra deleterio per la cella o mitocondri.
_content "> Avanti, abbiamo testato se il mitGO-ATeam2 FRET risponde ai cambiamenti dei livelli di ATP mitocondriale. Per fare ciò, abbiamo trattato le cellule con antimicina A, un agente che si lega al citocromo c reduttasi, inibisce l'ossidazione del ubichinolo nella catena di trasporto degli elettroni , sconvolge il gradiente protonico, e inibisce la produzione di ATP mitocondriale. 20 La mediana FRET diminuzioni rapporto in cellule trattate con Antimicina A (Figura 6C).Dato prova che mitGO-ATeam2 è un biosensore efficace per ATP mitocondriale, abbiamo usato questa sonda per monitorare i livelli di ATP mitocondriale in lievito che sono state propagate utilizzando una fonte di carbonio fermentabili e non fermentabili (Figura 6A e 6B). La riduzione della superficie fluorescente glucosio in cellule coltivate confermato che il glucosio risultati repressione in una diminuzione in abbondanza mitocondriale. Notiamo variazione cellula-cellula nel livello di mitGO-ATeam2. È interessante notare che i nostri dati preliminari indicano che c'è ma y essere differenze nei livelli di ATP nei mitocondri differenti all'interno della stessa cellula (Fig. 6D).
Figura 1. Mito-roGFP1 rileva stato redox mitocondriale senza influenzare i tassi di crescita delle cellule o morfologia mitocondriale. (A) Crescita di lievito che esprimono mitocondri mirati GFP o ro-GFP1 è stata misurata come variazione di densità ottica a 600 nm in funzione del tempo di crescita SC-Ura mezzo liquido a 30 ° C. (B), pannelli superiori: Normale morfologia mitocondriale e canale di localizzazione in immagini raw. Pannelli inferiori: immagini Rapporto mostrano il canale ridotta diviso per il canale ossidato (riferimento colore a destra). Le immagini mostrano l'effetto di soglia scelta sui risultati. La soglia ottimale comprende strutture mitocondriali ed esclude sfondo.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Mito-roGFP1 rileva i cambiamenti di stato redox mitocondriale in risposta al trattamento con il perossido di idrogeno o DTT. (AB) Mid-log fase cellule di lievito che esprimono mito-roGFP1 sono state incubate in SC-Ura multimediale con nessun trattamento (0) o con le concentrazioni indicate di H 2 O 2 o DTT per 20 minuti a 30 ° C. (a) le proiezioni di massima intensità delle immagini mito-roGFP1 rapporto R / O si sovrappongono immagini di luce trasmessi, che mostrano contorni cellulari. Il colore di riferimento per il mito-roGFP1 è mostrato in alto a destra. Bar:. 5 micron (B) Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Mito-roGFP1 offre subcellulare risoluzione di stato redox mitocondriale. Una proiezione di massima intensità del mito-roGFP1 canale rapporto R / O si sovrappone un'immagine a luce trasmessa. Il colore di riferimento per il mito-roGFP1 è mostrato in alto a destra. Bar: 5 micron. Questo particolare cellulare ha un rapporto medio di 0,88 R / O mito-roGFP1. Tuttavia, i singoli mitocondri all'interno di questa cella mostra diversi stati redox. I numeri indicati sono calcolati al R / O Mito-roGFP1 rapporto per diversi ri mitocondrialegioni. Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 4. Eccitazione ad alta intensità porta ad fotoconversione e mito-roGFP1 rapporto alterato R / O. Mid-log fase lievito che esprime mito-roGFP1 sono stati illuminati con luce a 400 nm a 40% (A) o 100% (B) di potenza da una sorgente di luce a LED , e la fluorescenza dalla ridotto e ossidato mito-roGFP1 stato catturato ogni 4 secondi. Le immagini mostrate sono proiezioni massime, in cui colori rappresentano il rapporto R / O del mito-roGFP1 (vedi scala di colori in basso a destra). Bar:. 5 micron (C) Il rapporto R / O del mito-roGFP1 rimasta costante nel periodo di imaging su di illuminazione a LED di potenza del 40%. Tuttavia, dopo l'illuminazione al 100% di potenza a LED, abbiamoosservare una variazione dipendente dal tempo in rapporto R / O del mito-roGFP1, che riflette photoswitching del fluoroforo. Quadratini neri, il 40% del LED di potenza;. Diamanti grigi, il potere LED di 100% Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 5. MitGO-ATeam2 localizza ai mitocondri nel lievito e non influenza i tassi di crescita di cellule di lievito. (A) Le cellule di lievito che esprimono mitGO-ATeam2 sono state coltivate a metà fase log, fissato con paraformaldeide e colorati con il colorante DNA-binding DAPI, come descritto in precedenza 19 Immagini. indicati sono proiezioni di massima intensità di deconvolved serie Z. Per semplicità, le immagini mitGO-ATeam2 stati ottenuti utilizzando un filtro convenzionale GFP, così essi rappresentano solo la popolazione non legata ad ATP. Cella fuorilinee sono mostrati in bianco. N: DNA nucleare. mtDNA: DNA mitocondriale. Bar: 1 micron (B) Curve di crescita di cellule di lievito wild-type che esprimono GFP mitocondri mirati o mitGO-ATeam2 in glucosio-based (SC) e glicerolo-based (SGlyc) mezzi liquidi a 30 ° C.. Questi dati sono la media di quadruplicati per ogni ceppo ad ogni tempo, ed è rappresentativo di due esperimenti indipendenti. Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 6. Misure MitGO-ATeam2 cambiamenti nei livelli di ATP in mitocondri di lievito con risoluzione sub-cellulare e suborganellar. (AB) Emissione di mitGO-ATeam2 da GFP (510 nm) e OFP (560 nm), e la quantificazione del rapporto di emissione 560/510 nm di lievito cellule coltivate durante la notte in glucoSE-based (SC) (A) o glicerolo-based (B) i media (SGlyc). Il colore di riferimento per il canale 560/510 rapporto è mostrato in basso a destra. Bar:. 1 micron (C) Quantificazione del rapporto 560/510 per celle propagate in mezzi SGlyc con o senza antimicina A (2 ug / ml) per 1 ora a 30 ° C. La diminuzione dei livelli di ATP upon antimicina un trattamento è statisticamente significativa (test di significatività di Kruskal-Wallis). (D) 560 nm/510 rapporto nm di mitGO-ATeam2 di una fase di cellula di tipo selvaggio metà log propagato su SC media. Il colore di riferimento per il canale 560/510 rapporto è mostrato in basso a destra. Il profilo cellulare è mostrato in bianco. Il rapporto medio di 560/510 nm per l'intera cella è 0.43. I numeri indicati sono i 560/510 nm rapporti di regioni specifiche all'interno di mitocondri. Bar: 1 micron. Clicca qui per ingrandire la figura.
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Discussion
Qui, descriviamo i metodi da utilizzare mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 come biosensori per valutare mitocondriale stato redox e livelli di ATP in cellule di lievito vive. Troviamo che l'espressione del plasmide-borne mito-roGFP1 o mitGO-Ateam risultati in quantitativa mira a mitocondri, senza alcun effetto evidente sulla morfologia o la distribuzione mitocondriale o sui tassi di crescita cellulari. 3 Mito-roGFP1 in grado di rilevare variazioni di stato redox mitocondriale da molto ossidato a stati fortemente ridotti. Allo stesso modo, mitGO-Ateam in grado di misurare i cambiamenti nei livelli di ATP mitocondriale che si verificano nel lievito in fase di crescita respirazione-driven e lievito trattati con un inibitore della respirazione. Inoltre, poiché entrambi i biosensori offrono una risoluzione subcellulare, possono rilevare eterogeneità nello stato redox o livelli di ATP di mitocondri all'interno delle singole celle. Infine, dal momento che entrambi i biosensori sono sonde raziometriche, non sono influenzati dalle variazioni di concentrazione o di variabilità nello spessore del campione e nel maleumination. Queste sonde forniscono un approccio minimamente invasivo per studiare la funzione mitocondriale con risoluzione sub-cellulare nelle cellule viventi.
Per applicare con successo questo metodo, le immagini dovrebbero essere acquisite con il rapporto segnale-rumore massimo possibile. Un primo passo importante è quello di esaminare le cellule 10-20 colonie trasformanti al microscopio e selezionare quelli con fluorescenza robusto e normale morfologia mitocondriale e tassi di crescita. Successiva, condizioni di imaging devono essere ottimizzate per produrre alta, ma non saturare, intensità senza causare photodamage alla proteina fluorescente o le celle. Poche cellule in una popolazione (<1%) possono avere insolitamente alta o bassa fluorescenza globale a causa di variazioni nel numero di copie del plasmide; questi possono essere trascurati in favore di catturare immagini interpretabili della maggior parte delle cellule.
Mentre i benefici di mito-roGFP sono chiari, ma è anche importante essere consapevoli dei potenziali insidie. Rileviamodifferenze di potenziale redox mitocondriale non solo con carbonio differenze sorgente indotte nel metabolismo cellulare, ma anche dalla propagazione di lievito in lotti differenti dello stesso mezzo. Pertanto, è necessario prestare attenzione nella scelta di mezzi di crescita delle cellule per misure redox mitocondriali. Inoltre, sebbene mito-roGFP offre senza precedenti risoluzione spaziale di stato redox mitocondriale, risoluzione temporale di roGFP non è sufficiente per rilevare raffiche di ROS che sono associati con ROS segnale di trasduzione 31. Infine, occorre fare attenzione quando si sceglie la lunghezza d'onda di eccitazione e di intensità per la forma ossidata di roGFP. Illuminazione a 400 nm eccita in modo ottimale le specie ossidate di roGFP. Tuttavia, si eccita anche roGFP ridotta in misura maggiore rispetto a eccitazione a 365 nm. Questo porta ad una ridotta sensibilità nella misurazione stato redox mitocondriale. Inoltre, l'esposizione del mito-roGFP1 di illuminazione ad alta intensità a 400 nm conduce fotoconversione della proteina ad una specificaIES con proprietà spettrali alterati. Non abbiamo visto fotoconversione su di illuminazione ad alta intensità a 365 nm. Pertanto, si consiglia di eccitazione 365 nm utilizzando, se possibile.
MitGO-ATeam2 ha anche dei limiti. Per esempio, dal mitGO-ATeam2 è di per sé una proteina può essere danneggiato da insulti cellulari tra cui le specie reattive dell'ossigeno, che possono compromettere la sua attività biosensore. Ulteriormente, GFP e lunghezze d'onda di emissione OFP (510 e 560 nm) devono essere risolti per analisi FRET, che può essere difficile in microscopi a fluorescenza convenzionale.
A differenza di saggi enzimatici in vitro, questi test dal vivo di cellule segnalano variazioni relative ATP mitocondriale o stato redox, e non misurano la concentrazione assoluta di ATP o di cisteina ridotta. Anche se una curva standard potrebbe teoricamente essere generato misurando la risposta di proteine sensore in soluzione, questo potrebbe non applica all'ambiente molecolare differente all'interno dei mitocondri. Ther rima, questi test forniscono un confronto fra le cellule in condizioni diverse. Inoltre, le condizioni di imaging variano, quindi i valori di rapporto esatto acquisiti su una configurazione di imaging non possono essere replicati su un altro.
Queste tecniche per il rapporto di imaging possono essere adattati per altri indicatori raziometrici, tra altri roGFP o GO-Ateam isoforme e di altre sonde funzionali. La scelta di microscopia a campo largo o confocale dipenderà dalla sonda e la risoluzione spaziale richiesta. Il metodo a grande campo è stato utilizzato qui per mito-roGFP perché permette di eccitazione a 365 nm, che migliora la stabilità e la sensibilità del sensore. Il metodo confocale con rivelatore spettrale, come usato qui per mitGO-Ateam, fornisce un modo conveniente per eliminare le emissioni di crossover regolando le finestre di rilevamento spettrali. Tuttavia, è possibile eseguire esperimenti simili in microscopia ad ampio campo utilizzando filtri personalizzati o eliminando attraversamento computazionalmente.
S copi "> La difficoltà più comune in questo tipo di esperimento di imaging segnale è insufficiente. hardware Imaging (soprattutto la lente obiettivo e del rivelatore) è critico per la raccolta abbastanza segnale per interpretare i dati.I passi della soglia hanno grande influenza sui risultati, come l'inserimento di pixel di sfondo può smorzare eventuali tendenze nei rapporti ottenuti. Metodi automatici sono preferibili, ma a causa del segnale limitata, della soglia manuale è spesso il miglior metodo disponibile. Se si utilizzano le soglie manuali, i criteri utilizzati devono essere articolate meglio possibile, e analisi possono essere obbligatoria ciechi o da diversi sperimentatori per dimostrare la riproducibilità. Esperimenti di controllo con antimicina A (per mitGO-Ateam2) e H 2 O 2 o DTT (per il mito-roGFP) possono essere usati per confermare le modifiche previste in rapporti di fluorescenza.
Mito-roGFP e mitGO-ATeam2 sono non invasive, sonde raziometriche per il monitoraggio mitoidoneità mitocondriale in cellule di lievito vive. I sensori raziometrici usati qui sono stati presi di mira per i mitocondri da fusione di sequenze segnale mitocondri-specifici. Altri compartimenti cellulari potevano essere studiati con l'aggiunta di opportune sequenze di targeting ai sensori originali. In aggiunta, è possibile combinare uno di questi sensori con marcatori fluorescenti complementari (ad esempio per organuli o fattori di segnalazione) o sensori (ad esempio per il calcio) per misurare simultaneamente più processi nelle cellule viventi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da premi da HHMI 56006760 a JDV, il National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) a DMAW, e dal Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) e del NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) a LP. GM45735S1 è stato emesso dal NIH nell'ambito del Recovery and Reinvestment Act del 2009. I microscopi utilizzati per questi studi sono stati finanziati in parte attraverso un NIH / NCI concessione (5 P30 CA13696).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution. |
| SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
| Valap | Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin |
||
| Equipment and Software | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm |
| High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm) |
| A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective | Nikon (Melville, NY) | ||
| AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
| Volocity 3D Image Analysis software | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
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