Modeller och metoder för att utvärdera Transport av Drug Delivery System Across Cellular Hinder

Summary

Många terapeutiska tillämpningar kräver säker och effektiv transport av läkemedelsbärare och deras last över cellulära barriärer i kroppen. I denna artikel beskrivs en anpassning av etablerade metoder för att utvärdera hastigheten och mekanismen för transport av läkemedelsnanocarriers (NCS) över cellulära barriärer, såsom det gastrointestinala (GI) epiteliet.

Abstract

Under mikrometer bärare (nanocarriers, NCS) öka effekten av läkemedel genom att förbättra löslighet, stabilitet, cirkulationstiden, inriktning, och släpp. Dessutom korsar cellulära barriärer i kroppen är avgörande för både oral tillförsel av terapeutiska NCs i cirkulationen och transport från blodet till vävnaderna, där insatser behövs. NC transport över cellulära barriärer uppnås genom att: (i) den paracellulära vägen, via övergående störningar i de korsningar som interlock angränsande celler, eller (ii) den transcellulära vägen, där material internaliseras genom endocytos, transporteras över cellkroppen, och utsöndras vid den motsatta cellytan (transyctosis). Leverans över cellulära barriärer kan underlättas genom att koppla terapi eller deras bärare med riktade medel som binder specifikt till cellytan markörer som är involverade i transporten. Här ger vi metoder för att mäta omfattningen och mekanismen för NC-transport över en modell cellbarriär, vilket motsvarach består av ett monoskikt av gastrointestinala (GI) epitelceller odlas på ett poröst membran beläget i ett transwell insert. Bildandet av en permeabilitetsbarriär bekräftas genom att mäta transepithelial elektriskt motstånd (TEER), transepitelial transport av ett bekämpningsmedel, och immunfärgning av tight junctions. Som ett exempel är ~ 200 nm polymer NCs användas, vilket bär en terapeutisk last och är belagda med en antikropp som riktar sig mot en cellyte-determinant. Antikroppen eller terapeutiska lasten är märkt med ¹²⁵ jag för radioisotop spårning och märkta NCs läggs till den övre kammaren över encellsskiktet för olika tidsperioder. NCs associerade till cellerna och / eller transporteras till den underliggande kammaren kan upptäckas. Mätning av fri ¹²⁵ jag tillåter subtraktion av den nedbrutna fraktionen. Den paracellulära Rutten bedömas genom att eventuella förändringar orsakade av NC transport till barriär parametrar som beskrivs ovan. Transcellulär transport is bestäms genom att ta itu med effekterna av moduler endocytosis och transcytos vägar.

Introduction

Cellulära barriärer i kroppen fungerar som en brygga mellan den yttre miljön och interna fack. Detta är fallet för epitelbeklädnaden separera den externt exponerade ytan av det gastrointestinala (GI) området och blodomloppet ^1-3. Cellulära barriärer utgör också gränssnittet mellan blodet och parenkymet och cellulära komponenter i vävnader och organ. Detta är fallet för det inre endotelbeklädnaden i blodkärl, såsom blod-lung barriären, blod-hjärn-barriären, etc. ¹ Förmågan att korsa dessa cellulära barriärer i kroppen är av avgörande betydelse för effektiv leverans av terapeutiska och diagnostiska medel in i cirkulationen och vävnader / organ där ingripande behövs.

För att förbättra leveransen av terapeutiska eller diagnostiska medel, kan dessa föreningar laddas in i sub-mikrometernanocarriers (NCS). Dessa läkemedelsdepåer kan formuleras med en mängd olikakemiska och strukturer för att optimera läkemedels löslighet, skydd, farmakokinetik, release, och metabolism ^4,5. NCs kan också funktionella affinitet eller inriktning delar (t.ex. antikroppar, peptider socker, aptamerer, etc.) för att underlätta vidhäftning till områden av kroppen där det krävs den terapeutiska verkan ^2,6. Inriktning NCS till determinanter som uttrycks på ytan av cellulära barriärer kan ytterligare underlätta transport in och / eller över dessa beklädnader ^2,6.

Den roll som selektivt transporterar ämnen mellan två miljöer kräver vissa unika funktioner hos cellager. En sådan funktion är cellens polaritet, varvid det apikala membranet som vetter mot lumen av kaviteterna varierar från det basolaterala membranet orienterad mot vävnad interstitium, med avseende på membranets morfologi och sammansättning av lipider, transportörer och receptorer ^2. En annan funktion innebär inter Junctions anslutnings intilliggande celler. Reglering av de proteiner som bildar tight junctions, särskilt Junktional adhesionsmolekyler (sylt), occludins och claudins, modulera barriärfunktion för att selektivt tillåta eller inte transport av ämnen mellan celler, så kallade paracellulära transport, vilket gör att passagen av material från lumen till den basolaterala utrymmet ^3. Bindning av många naturliga och syntetiska beståndsdelar (leukocyter, molekyler, partiklar och drug delivery system) till cellulära barriärer i kroppen kan framkalla cell-korsning öppning, som kan vara övergående och relativt ofarliga eller mer utdragen och därmed osäkra med tillgång av oönskade ämnen över barriären ^2,5,7-9. Följaktligen kan bedömas denna bana genom mätning av transepitelial elektrisk resistans (TEER) och passiv paracellulär diffusion av molekyler (i fortsättningen kallad paracellulär läckage), varigenom minskad motståndskraft mot en elektrisk ström eller ökad paracellulär läckage av ett inert förening i det basolaterala utrymmet indikerar öppning av cell korsningar respektive ^5,10,11. Som komplement till dessa metoder, kan några av de snäva junction protein som anges ovan färgas för att bedöma deras integritet, där färgning ska visas koncentreras vid cell-cellkantlinjer runt cellen periferin ^5,10,12.

Alternativt kan läkemedelstillförselsystem som riktar sig mot specifika cellyt faktorer, såsom de som är associerade till clathrin drage gropar eller kolv-formade membran invaginations kallade caveolae, utlösa vesikulär upptag in i celler genom endocytos, vilket ger en väg för läkemedelstillförsel till intracellulära fack ^{5, 13.} Dessutom kan endocytos leda till handel med blåsor över hela cellkroppen för övergång vid basolaterala sidan, ett fenomen som kallas transyctosis eller transcellulär transport ^14. Därför kan kunskap om kinetiken och mekanismen för endocytos användas för att utnyttja intracellulära and transcellulär läkemedelsavgivning, som erbjuder ett relativt säkert och kontrollerat leveranssättet jämfört med den paracellulära vägen. Mekanismen för endocytos kan utvärderas med modulatorer av klassiska vägar (clathrin-och caveolin förmedlad endocytos, och macropinocytosis) eller icke-klassiska vägar (såsom fallet celladhesionsmolekyl (CAM)-medierad endocytos) ^5,13,15 .

Av följande skäl intracellulär människohandel ofta studeras i vanliga brunnar eller täckglas, avsaknaden av en basolaterala fack utesluter cell polarisering och förmågan att studera transport över cellskikt. För att övervinna detta hinder, transport över cellmonolager har länge studerats med hjälp av transwell infogar ^10,11,16,17, som består av en övre (apikala) kammare, ett poröst membran där celler fäster och bildar en tät monolager, och en lägre (basolaterala) kammare (Figur 1). I denna konfiguration kan transport mätas iapikal till basolateral riktning genom administrering av en behandling i den övre kammaren, efter transport genom cellmonoskiktet och det underliggande porösa membranet, och slutligen uppsamling av mediet i den nedre kammaren för kvantifiering av transporterat material. Transport i basolaterala-till-apikal riktning kan också mätas genom initial administrering till den nedre kammaren och efterföljande insamlingen från den övre kammaren ^5,10,12,16. Olika tekniker finns för att kontrollera bildandet av permeabilitetsbarriär på transwells, inklusive TEER och paracellulär transportanalyser, såsom beskrivits ovan. Dessutom kan det permeabla filter på vilket cellerna odlas avlägsnas för bildanalys (t ex genom fluorescens, konfokalt, elektronmikroskopi), som ytterligare validering av cellmonoskiktet modell liksom mekanismen för transport. Val av membran typ, som är tillgängliga i olika porstorlekar, material och yta, beror på olika factors såsom storleken av ämnen eller föremål som skall transporteras, celltyp, och avbildningsmetod ^16,18-20. Transwell skär underlättar också kontrollerad och korrekt kvantifiering av transporter jämfört med komplexa däggdjurssystem, som volymer av kamrarna och cellytan är kända konstanter. Medan många faktorer inblandade i in vivo leverans elimineras, inklusive förekomsten av tarm slem, skjuvspänning, matsmältningsenzymer, immunceller, etc., detta i liten skala in vitro-modell ger användbar preliminär information avseende transporter.

Som ett exempel för att åskådliggöra en anpassning av dessa metoder för att studera NC-transport över cellulära barriärer ^10,11,16,17, beskriver vi här ett fall där potentialen för NC-transport över GI epitel modellerades genom att bedöma passage av en modell drug delivery systemet genom ett monoskikt av human epitelial kolorektal adenocarcinom (Caco-2-celler). För detta ändamål, calnar odlades i Transwell-insatser, på en 0,8 | im por polyetylentereftalat (PET)-filter (6,4 mm diameter), som är transparent och kan användas för mikroskopi avbildning. Statusen permeabilitetsbarriären valideras genom mätning TEER, apikal till basolateral transport av ett bekämpningsmedel, albumin, och fluorescensmikroskopi visualisering av en del av de tight junctions, occludin protein. En modell av riktade polymer NC används, som består av 100 nm, nonbiodegradable polystyren nanopartiklar. NCs beläggs genom ytadsorption med en målsökande antikropp för sig eller en kombination av en målstyrd antikropp, och en terapeutisk last, där endera komponenten kan märkas med ¹²⁵ I för radioisotop spårning. I det valda exemplet, erkänner antikropp intercellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1), ett protein som uttrycks på ytan av GI epitelial (och andra) celler, som har visats för att underlätta intracellulär och transcellulär transport o f läkemedelsbärare och deras last ^21. Lasten är alfa-galaktosidas (α-Gal), en terapeutisk enzym som används för behandling av Fabrys sjukdom, en genetisk lysosomala lagring sjukdom ^22.

De belagda NCS av ca 200 nm i storlek, adderas till den apikala kammaren över cellmonoskiktet och inkuberades vid 37 ° C under varierande tidsperioder, varefter ¹²⁵ I på NCs kan detekteras är associerat till cellmonoskiktet och / eller transporteras till den basolaterala kammaren under cellerna. Ytterligare bestämning av fri ^125I tillåter subtraktion av den nedbrutna fraktionen och uppskattning av bestruket NC transport. Mekanismen för transporten vidare utvärderas genom att undersöka förändringar i permeabilitet hinder som hänför sig till den paracellulära vägen, genom de parametrar som beskrivs ovan, medan transcellulär transporter bestäms genom att undersöka förändringar i transporten när modulerande vägar av endocytos och transcytos.

ontent "> Dessa metoder ger värdefull information om cellbarriär modeller, omfattningen och hastigheten för transport av ett drug delivery-system, och mekanismen för en sådan transport, alldeles som möjliggör utvärdering av potentialen för läkemedelstillförsel över cellulära barriärer.

Protocol

1. Odla en cell monolager i Transwell Inserts

1. I ett sterilt, skyddsnivå 2 cellkultur huva, placera 0,8 mm pore PET Transwell skär in i en 24-brunnsplatta (4 brunnar per betingelse, för statistisk signifikans) med pincett. Allt material som kommer in i huven ska steriliseras med etanol.

Anm: Porstorleken hos filtret måste vara markerad i enlighet med medelstorleken för NC används, för att tillåta transport genom membranet. Även för statistiskt signifikanta resultat, kräver att varje försöksbetingelse minst fyra upprepningar (brunnar) i samma experiment, och ett minimum av tre oberoende experiment.

2. Förbered cellodlingsmedium innehållande DMEM-medium kompletterat med 4,5 g / L glukos, 15% fetalt bovint serum och 1% Pen Strep, och värm till 37 ° C i ett vattenbad.
3. Späd mänskliga epitelceller kolorektal adenocarcinom (Caco-2) celler i cellmediet och plats200-400 pl av cell lösningen i den övre (apikala) kammaren av transwell insert, med en täthet av 1,5 x 10 ⁵ celler / cm ^2. Fyll lägre (basolaterala) kammare med 700 till 900 l av cellmediet.
4. Kultur cellerna vid 37 ° C, 5% _CO2 och 95% fuktighet under 16-21 dagar, ersätter mediet i den övre och nedre kammaren var 3-4 dagar, med hjälp av de volymer som anges i steg 1.3. Byt medium, i följande ordning för att bibehålla trycket ovanför (snarare än nedan) cellmonoskiktet: Aspirera medium från den undre kammaren, aspirera mediet från den övre kammaren, fylla den övre kammaren med färskt medium, och fylla den undre kammaren med färskt medium.

2. Validering av GI Epithelial permeabilitetsbarriären Använda transepitelial Elektriska motstånd (TEER) och immunfärgning av tight junctions

1. För kortvarig förvaring (mindre än två veckor), dränka STX100 elektroder i en elektrolyt lösningning (0,1 till 0,15 M KCl eller NaCl). Anslut elektrodkabeln till elektroden porten på EVOM volt-ohmmeter så att systemet är internt kortsluten och elektrod symmetri bibehålls. För långtidsförvaring, skölj med dH ₂ O och lagra i ett torrt, mörkt tillstånd.
2. För att sterilisera elektroderna, sänk ned i etanol i 15 min och låt lufttorka i 15 sek. Alternativt kan elektroderna lagras i en UV-huva. Skölj elektroderna i en steril elektrolytlösning (fosfatbuffert saltlösning, PBS) eller 0,1-0,15 M KCl eller NaCl-lösning, före varje motståndsmätning.
3. Med volt ohmmeter inställd på motståndet inställningen vertikalt placera elektroderna i en brunn som innehåller det transwell insert, med den korta elektroden i den övre kammaren och den långa elektroden i den nedre kammaren att röra vid botten av brunnen. När EVOM läsning stabiliserar, registrera motståndsvärde (anges i ohm, Ω) för varje brunn.
4. Beräkna resistivitet (resistance normaliserad till området, Ω × cm ²⁾ av prover genom att subtrahera bakgrundsmotstånd (TEER av Transwell skär utan celler) och multiplicera med membranytan. Resistivitetsvärden oftast rapporterats i litteraturen. (Se diskussion)
5. Upprepa mätningarna var 1-2 dagar tills TEER värden upphov till ett maximum och platå, vilket indikerar bildandet av en permeabilitet barriär, som normalt tar 2-3 veckor från det att cellPlatTing. Plateau TEER-värden och tid som är nödvändig för att uppnå barriärintegritet kan variera beroende på cellpassage nummer.
6. För att kontrollera förekomsten av tight junctions i cellmonoskikt med hög TEER (lika med eller över tröskelvärdet för barriärbildning), fixera cellerna genom inkubation med kall 2% paraformaldehyd i 15 min. Sedan, tvätta cellerna med PBS och inkubera dem i 30 min vid rumstemperatur med 1 | ig / ml anti-occludin. Tvätta cellerna en gång med PBS och inkubera dem i 30 min vid rumstemperatur med 7,5 pg / ml fluorescently-märkta sekundära antikroppar. Använd brunnar med låg TEER som en negativ kontroll för barriärbildning.

OBS: Som ett substitut för anti occludin, kan antikroppar mot alternativa tight junction proteiner användas.

7. Försiktigt skära filtermembranet där den fasta monolager är ansluten, och montera på objektglas för avbildning med epifluorescence eller konfokalmikroskopi.

3. Utvärdera transepitelial Transport av riktade Bärare

1. Märk målstyrd antikropp (mus monoklonal antikropp mot ICAM-1, anti-ICAM, i detta exempel) med ¹²⁵ I, såsom tidigare beskrivits ^7. Använd Bradford-analys för att uppskatta proteinkoncentrationen och en gammaräknare för att bestämma ¹²⁵ jag innehåll på antikroppen, därefter beräkna den specifika aktiviteten i räkningar per minut (CPM) / mg av märkt antikropp.

OBS: För att kontrollera om specificitet, retorv förfarandet genom märkning mus-IgG, som kommer att användas för att framställa icke-riktade belagda NCs. För att studera transporten av en terapeutisk last, upprepa proceduren märkning av last, t ex alfa-galaktosidas (α-Gal) i detta exempel. Alternativ kan användas för det målsökande medlet, icke-specifik kontroll eller terapeutisk last. Alternativa metoder kan också användas för att märka föreningar och uppskatta koncentrationen av de märkta motsvarigheter.

2. Par den märkta målstyrd antikropp (anti-ICAM i vårt exempel) vid ytan för NCS. I detta exempel, inkubera polystyren nanobeads (100-nm diameter) under 1 timme vid rumstemperatur med ¹²⁵ I-anti-ICAM att tillåta ytadsorption, såsom beskrivits ^7.

Anm: För den icke-specifika kontroll använder ¹²⁵ I-IgG. För att spåra transport av en last, använd en kombination av inriktning antikropp och ¹²⁵ I-märkt last (α-Gal i vårt exempel).

3. Centrifugera vid 13000 xg under 3 min och avlägsna de icke-belagda motsvarigheter i supernatanten genom aspiration. Resuspendera pelleten innehållande belagda NCs användning av 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS genom pipettering, och sonikera vid låg effekt för att störa eventuella partikelaggregat (20 till 30 korta pulser).
4. För NC karakterisering, mäta storlek, polydispertion och ζ-potential belagda partiklar med hjälp av dynamisk ljusspridning (efter instruktioner leverantör), och kvantifiera antalet ¹²⁵ I-märkt inriktning antikroppsmolekyler (t ex anti-ICAM) på partikelytan med hjälp av en gammaräknare.

Anmärkning: Dessa förfaranden kan upprepas för icke-specifika och terapeutiska motsvarigheter. Storleken av belagda partiklar varierar runt 200 nm.

5. Addera ¹²⁵ I-antikropp i NCS, (t.ex. ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS, 56 nCi / ml) till den övre kammaren ovanför konfluenta Caco-2-monoskikt med TEER &# 8805, 350 Ω × cm ² (se Diskussion) över bakgrunden (16-21 dagar efter sådd). Inkubera vid 37 ° C under en eller flera önskade tidsintervall. Mät TEER (avsnitt 2.3) före och efter inkubation för att utvärdera effekterna av NCs på permeabilitet barriären.

OBS: Denna procedur kan upprepas för ospecifika och terapeutiska motsvarigheter.

6. Samla medium från de övre och nedre kammare och tvätta dem en gång med 0,5 ml DMEM vid 37 ° C (övre kammaren) eller 1 ml dH ₂ O (nedre kammaren). Samla tvättar för mätning av den totala radioisotoper innehåll med hjälp av en gammaräknare.
7. För mätning av cellfraktionen utklippning av det genomsläppliga filter, t.ex. genom att använda ett rakblad för att skära runt kanterna, och inkubera i en gammaräknare rör med 1% Triton X-100 under 10 min (för att frigöra cellinnehållet), före mätning av cell associerade total radioaktivitet.
8. För att mäta ¹²⁵ Jag återleasas från NCs under transport eller på grund av potentiell försämring, första mix 300 pl prov (från de övre, undre eller cellfraktioner) med 700 l av 3% BSA i PBS och 200 ^ triklorättiksyra (TCA). Inkubera vid rumstemperatur i 15 min. Under tiden denna tid, mätning av den totala radioaktiviteten av detta prov i en gammaräknare.
9. Centrifugera TCA prover vid 3000 x g under 5 min för att separera intakta proteinet (pellet) av den nedbrutna proteinet eller ¹²⁵ jag fraktion (supernatant). Kvantifiera radioaktiviteten av den fria ¹²⁵ jag fraktion och subtrahera detta värde från total radioaktivitet mättes före centrifugering. Detta kommer att ge mängden märkt protein som inte bryts ned.

4. Mekanism för transepitelial Transport av riktade nanocarriers

1. Etikett albumin med ¹²⁵ I enligt beskrivningen i avsnitt 3.1 och tidigare redovisade ^7.

Obs: Albumin är en 66,5kDa-protein, och därmed en relativt stor substans. Även om en giltig kontroll för passiv transport av större föremål (t.ex. 200 nm NCs används här), bör det vara substituerade med mindre inerta spårmolekyler vid studier av transport av mindre läkemedelsbärare (se Diskussion).

2. För att bedöma paracellulär transporter med hjälp av albumin paracellulär läckage, kultur Caco-2-monoskikt på Transwell insatser som beskrivits ovan.
3. Till den övre kammaren mediet ovanför encellsskiktet, lägga antingen ¹²⁵ I-albumin enbart (negativ kontroll visar den basala nivån av läckage), eller ¹²⁵ I-albumin och icke-radioaktivt märkta antikroppar riktade NCs (som beskrivs i avsnitt 3.5). Inkubera vid 37 ° C för den valda tidsintervallet (s), som ska matcha de som undersökts vid test av NC-transporter. Mät TEER (avsnitt 2.3) före, under, och efter inkubation, samla alla fraktioner för totalt ¹²⁵ I och gratis ¹²⁵ I mätningar som anges. avsnitt 3 OBS: Samtidig tillsats av ¹²⁵ I-albumin och icke-radioaktivt märkt kontroll IgG NCs kan användas som en kontroll.
4. Som en positiv kontroll för öppnande av intercellulära förbindelser, tillsätt cellmedium innehållande 5 mM H ₂ O ₂ att de övre och undre kamrarna i den transwell insert, och inkubera vid 37 ° C under 30 min. Sedan mäter TEER (avsnitt 2.3) och tillsätt ¹²⁵ I-albumin till den övre kammaren för valda tidsintervall. Mät TEER vid olika tidpunkter under hela inkubationen att identifiera TEER värde förfall som orsakas av H ₂ O _2-inducerad öppning av cellföreningspunkter.
5. I parallella experiment utvärdera transcellulär transport, även kallad transcytos, av ¹²⁵ I-riktade NCs genom inkubering konfluenta Caco-2-monoskikt med antingen 50 pM monodansylcadaverine (MDC; inhibitor av clathrin medierad endocytos), 1 | ig / ml filipin (hämmare av caveolar medierad endocytos), 0,5 uM Wortmanni (hämmare av fosfatidylinositol 3-kinas [PI3K], som deltar i macropinocytosis) eller 20 | iM [5 - (N-etyl-N-isopropyl) amilorid] (EIPA, hämmare av macropinocytosis och CAM-medierad endocytos ^15).

OBS: ¹²⁵ I-IgG NCs och ¹²⁵ I-albumin kan användas som negativa kontroller för effekten av dessa hämmare, och andra metoder (t.ex. siRNA tekniker) kan ge mer selektiv hämning.

6. Mät TEER (avsnitt 2.3) före, under, och efter inkubation av celler med hämmare och radiomärkta material, som en ytterligare kontroll för effekten av hämmare på monolager permeabilitet.

Representative Results

Som validering av vår cellmodell för att studera transepitelial transport av riktade NCS Figur 2 visar att Caco-2 cellmonoskikt pläteras vid en densitet av 1,5 x 10 ⁵ celler / cm ² nådde konfluens ~ Dag 12 och bibehölls monoskikt integritet till och med dag 18, indikeras av TEER (Figur 2A). Detta validerades genom närvaron av occludin-positiva tight junctions (Figur 2B) i monolager med hög TEER (390 Ω × cm ^2, Dag 14), jämfört med dålig tight junction märkning vid låga TEER (17 Ω × cm ^2, Dag 5 ).

Spårning av den radioaktiva märkningen på NC-element avgör den totala mängden av dessa komponenter (NC inriktning antikropp eller last) till en början till den apikala kammaren, deras cell tillhörande fraktionen, och deras andel transporteras till basolaterala sidan. Dessa värden kan användas för att beräkna olika parametrar som beskriver NC transporter i enmer relevant sätt, särskilt efter subtraktion av fri ^125I innehållet i varje fraktion, som representerar nedbrutna motsvarigheter. Till exempel antalet antikroppsmolekyler, last molekyler eller tillhörande NCs som är tvärs encellsskiktet kan beräknas för att uppskatta absolut transporter. Också, den procentuella andelen av nämnda molekyler och NCS som transporteras till den basolaterala sidan med avseende på det totala antalet molekyler och NCS som är associerade till cellmonoskiktet, uppskattar effektiviteten hos nämnda transportmedel. Slutligen, den skenbara permeabilitetskoefficienten (P _app), en standardparameter för transporthastigheten, kan uppskattas. Dessa parametrar beräknas som följer:

Molekyler som transporteras eller NCs transporterade = CPM _basolateral × (molekyler _till eller NC _lagt / CPM _lagt)
% molekyler eller NCs transporterade = 100 x [CPM _basolaterala / (CPM _basolateral + CPMcellfraktionen)]
P _app (cm / s) = (CPM _basolaterala × vol.) / (A x t × CPM _tillsatt)

där CPM är ¹²⁵ jag räkningar per minut sattes till den övre kammaren _(CPM) i _sin cellmonoskiktet fraktionen (CPMcell fraktion) eller den nedre kammaren (CPM _{basolaterala)} och NC _sättas eller Molekyler _sättas är antalet för NCS eller molekyler som ursprungligen lades till den övre kammaren, A är ytarean hos filtermembranet (cm ^2), vol. är volymen av mediet i den övre kammaren (ml), och t är tid för inkubation (er).

I vårt exempel, när den radioaktiva isotopen är märkning av målstyrd antikropp, avslöjar denna analys graden och effektiviteten för transport i form av antikroppar och NCS som transporteras per cell och procent av cellmonoskiktet associerade antikroppar och NCS som transporterades (Figur 3A och 3B ), som vill som transporthastigheten i termer av P _app (Figur 3D). Dessa parametrar, beräknade i vårt exempel för ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS också jämfört med dem i kontroll ¹²⁵ I-IgG NCs att visa transporteffektivitet jämfört med en icke-riktad motsvarighet (figur 3C och 3D).

När den radioaktiva märkningen inkorporeras på NC last, de beskrivna parametrarna återspeglar transport av gods, som i vårt exempel var α-Gal enzym, som används för behandling av en genetisk lysosomala lagring sjukdom som kallas Fabrys sjukdom (Tabell 1). Förutom att beräkna NC transport genom att spåra nämnda last, transepitelial leverans av denna terapeutiska enzym kan uppskattas, t.ex. genom att uttrycka det som molekyler eller massa av α-Gal transporteras per cell.

Slutligen tillskriver denna metod transportvägen till den paracellulära vägen ellertranscellulär rutt. Till exempel, i vårt exempel, EIPA reducerad transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs tvärs Caco-2 cellmonoskikt (figur 4A), medan MDC, filipin och wortmannin inte minskade transportnivåerna med avseende på kontrollgrupp (ingen inhibitor ). Detta tyder på att anti-ICAM NCs använder CAM-medierad endocytos för transcellulär transporter, men inte clathrin-, caveolar-eller macropinocytosis relaterad transcytos. Vidare kons paracellulär transport uteslutas med hjälp av mätningar av TEER (figur 4B) och en albumin passiv transport (Figur 4C), varigenom en minskning av TEER och en ökning av albumin paracellulär läckage in i den nedre kammaren under transport av anti-ICAM NCs skulle ha indikerade avbrott i intercellulära förbindelser. Däremot har inkubation med anti-ICAM NCs inte förändra TEER eller ¹²⁵ I-albumin paracellulär läckage över en period av 48 h, liknande kontroll-IgG NCs som inte transporteras. Somen positiv kontroll för öppning av cell korsningar och paracellulär transport, H ₂ O ₂ minskade TEER till basala nivåer och markant förbättrad ^{125I-albuminläckage} till basolaterala kammaren.

Figur 1. Schematisk av transepitelial transport av riktade nanocarriers över en mag epitel modell. (A) som en plattform för att studera transepitelial transporter, Caco-2 cellmonolager odlas på Transwell skär tills en tät monolager bildas (16-21 dagar efter sådd, TEER ≥ 350 Ω × cm ² över bakgrunden). Ett exempel på en läkemedelstillförsel vehikel, såsom ¹²⁵ I-anti-ICAM NCS sättes till den övre (apikala) kammaren ovanför cellmonoskiktet för att studera transport över cellerna och genom det underliggande porösa membranet.Mediet i den nedre (basolaterala) kammare uppsamlas därefter för kvantifiering av transporterat material. (B) Transport genom encellsskiktet sker via antingen en paracellulära eller transcellulär / transcytos rutt. Reproducerad från Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klicka här för att visa en större bild

Figur 2. Caco-2-monoskikt som en modell för transepitelial transporter. Caco-2-celler odlades på Transwell skär på 1,5 x 10 ⁵ celler / cm ^2. (A) transepiteliala elektriskt motstånd (TEER) mättes för att utvärdera monolager integritet. Data visas som medelvärden ± SEM, n = 3. (B) Fluorescensmikroskopi av tight junctions immunolabeled med anti occludin och Texas Red-märkt sekundär antikropp, på dag 5 eller 14 (låg kontra hög Teer värden, respektive). Reproducerad från Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klicka här för att visa en större bild

Figur 3. Transport av anti-ICAM nanocarriers tvärs Caco-2 cellmonoskikt. Konfluenta Caco-2-monoskikt som odlas på Transwell-insatser inkuberades med ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs eller ¹²⁵ I-IgG NCs sattes till den apikala kammaren. (AC) ¹²⁵ Jag innehållet i basolateral kammaren mättes vid de angivna tidpunkterna, för att beräkna mängden NCs transported per cell (se Representativa resultat). (B) Procent av transporterade NCs beräknades som förhållandet av bärare som finns i den basolaterala fraktionen till att i de kombinerade basolaterala och cellfraktioner. (D) Skenbar permeabilitetskoefficienter (P _app) beräknades enligt beskrivning i Representativa resultat, vilket återspeglar andelen transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs eller ^125I-IgG NCs. Data visas som medelvärden ± SEM, n = 4. Reproducerad från Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klicka här för att visa en större bild

Figur 4. Mekanism för transport av ettnti-ICAM nanocarriers tvärs Caco-2-monoskikt. (A) transcellulär transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs tvärs konfluenta Caco-2-monoskikt utvärderades vid 24 h i frånvaro eller närvaro av 20 | iM EIPA, 1 | ig / ml filipin, 50 ^ M MDC, eller 0,5 ^ M wortmannin. (B) TEER mättes under transport av ¹²⁵ I-anti-ICAM NCs tvärs Caco-2-monoskikt, för att bedöma paracellulär transport. TEER-värden i frånvaro av NCs visas som kontroller (den streckade intervall markerar SEM av medelvärdet). Inkubering med 5 mM ^ H ₂ O ₂ är en positiv kontroll för öppning av intercellulära förbindelser. (C) paracellulära proteinläckage, mätt som den skenbara permeabilitetskoefficienten (Papp) av ¹²⁵ I-albumin korsar cellmonoskiktet i frånvaro eller närvaro av 5 mM H ₂ O _2-, IgG-NCS eller anti-ICAM NCS mättes och beräknad som i figur 3. Uppgifter finns shown som medelvärden ± SEM, n ≥ 4. Reproducerad från Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Klicka här för att visa en större bild

	Totalt NCs associerad / cell	Intracellulär NCs / cell	Transporteras NCs / cell	% Transporteras	Transporteras α-Gal molekyler / cell × 10 5	pg transporteras / cell × 10 -3	Papp (× 10 -8 cm / sek)
3 tim	663,4 ± 116,0	434,0 ± 76,8	243.6 ± 15,4	44,4 ± 6,7	1,8 ± 0,2	9,7 ± 1,2	8,1 ± 1,1
24 hr	2024,8 ± 409,3	1218,9 ± 255,6	806,9 ± 164,1	40,6 ± 2,0	3,9 ± 0,5	21,3 ± 2,5	1,9 ± 0,4
NCS = nanocarriers, α-Gal = α-galaktosidas, Total NCs förknippas / cell = Intracellulärt NCs / cell + NCs transporterade / cell,% Transporterad = (NC: transporterade / Total NCs associerade) × 100, P app = skenbar permeabilitetskoefficient (cm / s). Se Metoder för ytterligare beskrivning av dessa parametrar. Data visas som medelvärden ± SEM (n = 8 brunnar), (-TNF-α Caco-2-celler).

Tabell 1. Transepitelial transport av α-Gal genom anti-ICAM nanocarriers. Transcellulär transport av anti-ICAM / ¹²⁵ I-α-Gal NCs tvärs conflytande Caco-2-monoskikt utvärderades vid 3 tim och 24 tim. Radioisotop innehåll apikala, basolaterala och cellfraktioner omvandlades till olika värden som är relevanta för transport, så som beskrivs i Representativa resultat. Återgiven från Ghaffarian et al. J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).

Discussion

Med hjälp av de metoder som diskuterats ovan, kan en cellmodell för att studera transport av riktade NCs över cellulära barriärer inrättas, som i exemplet anges Caco-2 epitelceller, vilket är relevant för att bedöma transporten från GI lumen till blodet i fallet av orala läkemedel leveranssystem. Odling av GI epitelceller monolager i Transwell skär aktiverat mätning av TEER och fluorescens immunfärgning av tight junctions att bekräfta bildningen av en cell permeabilitet barriär. Därefter radiomärkning av inriktning och terapeutiska medel med ¹²⁵ jag förutsatt snabb och känslig kvantifiering av riktade NCs i och över GI cellmonoskikt. Slutligen har mekanistiska studier appliceras med endocytiska hämmare, TEER och en albuminanalys paracellulär läckage att bedöma om transporten sker via en vesikulär väg mot en paracellulär rutt.

En viktig parameter i upprättandet av liknande modeller is val av en celltyp, som skall återspegla den fysiologiska naturen hos den cellulära barriär som studeras. Olika epitelceller och endotelceller från människa eller djur är kommersiellt tillgängliga ^16,18-20. Dessa kan odlas ensam som enda kultur som beskrivs här, eller som co-kulturer av dessa celler med andra celltyper (t.ex. slemutsöndrande celler, immunceller pericyter etc.) ^16,18-20. I en sådan co-kultur formen kan Transwell skärförhållanden anpassas för att justera motsvarande förändringar och krav för differentieringsfaktorer i de cellmedie ^16,18-20. Till exempel kan en blod-hjärnbarriären modell involverar samodling av hjärnan mikrovaskulära endotelceller och astrocyter eller pericyter på den motsatta ytan av det porösa filtret, och respektive medier för varje celltyp som skall placeras i varje kammare ^19. Dessutom, beroende på cellinjen, extracellulära matriskomponenter kan required för effektiv cellvidhäftning till det porösa membranet ^{18 till 20.} Det är viktigt att tänka på att varje modell kommer att göra olika basala nivåer med avseende på permeabilitet barriär parametrar och transportpriser och-mekanism, därav styra värden måste erhållas och dessa metoder optimeras för varje situation.

Transwell skär såsom de som beskrivs här, har ofta använts för att studera transport av material över cellmonolager, från den apikala till en basolaterala fack eller vice versa ^{5,10-12,16,17.} Detta kan inte uppnås genom odling av celler på klassiska brunnar eller täck eftersom sådana system utesluter denna form av transporter som de inte erbjuder två oberoende fack och därför inte kan ge en realistisk bild av cellsortering. Till exempel kan material naturligtvis avsedda att släppas från den basolaterala membranet shuntas till andra cellfack i en täck modell, vilket gör det svårt att Resölve mekanismen för transcellulär transporter. Dessutom i motsats till täckglasen ger transwell konfiguration upphov till fysiologiskt relevanta faktorer som är förknippade med celldifferentiering och membran polaritet ^10,11,16-19. Till exempel Caco-2-celler odlade på transwells uppvisar egenskaperna hos mogna enterocyter, inklusive närvaron av mikrovilli och tight junctions, kupolbildning, och produktion av borstbräm enzymer ^10,11,17. Andra parametrar kan inducera en mer fysiologiskt relevant fenotyp, t.ex. skjuvspänning vid gastrointestinala epitelceller (t.ex. slem flöde och kontraktila rörelser) och vaskulära endotelceller (t.ex. blodflöde), som kan appliceras i transwells användning av agitation eller pumpar ^{10 , 16,} och co-kulturer för att producera den nödvändiga tillväxt-och differentieringsfaktorer för vissa celltyper ^16,18-20. Ändå måste man anse att cellinjer skiljer sig ofta från celler i kroppens vävnader, e. G.. De kan uttrycka vissa bestämningsfaktorer på olika nivåer och därmed presentera olika funktioner och regler. Till exempel behöver Caco-2 celler innehåller inte alla transportproteiner och enzymer som krävs för aktivering och transport av orala terapier in vivo, såsom CYP3A4, en drog-metaboliserande enzymet ^10,17,23. I dessa fall kan cellinjen underkloner, transfektion, eller tillsats av transkriptionella medel användas modulera cellinje för att bättre återspegla fysiologiska förhållanden ^17,23,24.

Vid val av en optimal transwell modell, måste de olika funktionerna i den genomsläppliga filter beaktas. Permeabla filter finns i olika porstorlek, som sträcker sig från 0,4 till 8 pm, och ska rymma storleken på transporterad last. Till exempel är mindre porstorlekar (0,4-3 mikrometer) som typiskt används för studier av transport av små kemiska föreningar, medan porerna 3 ^ m eller större används för cellinvasion, chemotaxis och motilitet studier där mikrobiella, är immun, och migrerar cellerna transporteras. Porstorlek och täthet även påverkar celldensitet och differentiering, eftersom vissa celler kan migrera genom porerna vid sådd, utgör hinder för monoskiktbildning. Dessutom är materialet i det genomsläppliga stöd influenser avbildning klarhet, för bedömning av cellviabilitet och monoskiktsbildning och cellvidhäftning. Polyetentereftalat (PET) filter är transparenta, vilket gör sikt under faskontrastmikroskopi, i motsats till genomskinligt polykarbonatfilter. För förbättrad infästning cell, genomsläppliga stöd i förväg belagda med kollagen eller fibronektin är kommersiellt tillgängliga. Dessutom kan filterdiameter, som justeras för olika brunnar, påverka permeabilitet, varvid större diametrar (t.ex. i 6-brunnar) tenderar att öka paracellulär leakiness av encellsskiktet.

När en transwell modell upprättas, inklusive anslagte val av celltyp, mediekomposition och permeabelt filter, kan utvärderas statusen av cellmonoskiktet under odlingen och experimentella stadier använder TEER. Men Teer värden varierar med 1) medfödda biologiska faktorer som är förknippade med celltyp, källa, och passagenummer, 2) odlingsbetingelser, till exempel de tidigare nämnda egenskaperna Transwell, sådd densitet, dagar i kultur, media sammansättning och pH, ​​3) fysiska faktorer , till exempel temperatur, mediavolymen, provtagning schema, och graden av agitation / tvätt, samt 4) patologiska och / eller kemiska faktorer som modulerar cell korsningen integritet (t.ex. cytokiner, immunceller, oxidativ stress, farmakologiska tillsatser etc.) ^{10, 16,17.} På grund av de olika biologiska och miljömässiga faktorer som påverkar TEER, ett minsta utgångsvärde indikerar barriärbildning måste upprättas för varje system genom att regelbundet övervaka TEER under odlingsperioden och efter experimentella manipulationer. VaLues som bedöms lämpliga för barriärbildning, som kan variera mellan 150-1,600 Ω × cm ^{2 16,} också att bero på storleken av det ämne som skall transporteras så att passiv paracellulär diffusion av ämnet är begränsad, medan TEER ≥ 350 Ω × cm ² tycks utesluta passiv diffusion av relativt stora NCs såsom de som visas här (200 nm), kan detta inte vara fallet för mindre drogleveranssystem, där snävare monolager (t.ex. ≥ 700 Ω × cm ²⁾ krävs. Denna utgångsvärdet kan också utföras med kontrollerna för att störa permeabilitetsbarriären, däribland H ₂ O _2, penetrerande peptider, kalcium kelatbildare (t.ex. EDTA), protein kinaser och fosfataser, och diverse andra reglerande molekyler ^25-27.

Som komplement till TEER, finns många permeabilitet analyser för att kontrollera monolager integritet och bedöma paracellulär Transport. Som albumin, andra membran ogenomtränglig spårmolekyler av olika storlekar, såsom mannitol, lucifer gult, inulin och dextraner, som kan kopplas med en UV-, fluorescerande eller radioaktiv markör för att mäta och jämföra permeabilitets satser (P _app) till kända Värdena för dessa lösta ämnen. Vid utvärdering paracellulär transporter, är det viktigt att använda en spårmolekyl som är mindre än den transporterade testade föreningen. Till exempel skulle paracellulära transporten av 200 nm partiklar öppna intercellulära förbindelser tillräckligt för att orsaka paracellulär läckage av mindre, men ändå relativt stora molekyler, såsom albumin som används i vårt exempel. Däremot bör utvärderas paracellulär transport av mindre läkemedelsbärare såsom dendrimererna (~ 5 nm) med hjälp av molekyler <5 nm, såsom mannitol. Paracellulär studier läckage indikerar därmed storleken på cell korsningen öppning, men på grund av långa inkubationstider de inte kan identifiera övergående störningar i cell junctioner.

Ett annat sätt att utvärdera barriärintegritet är att bilden de täta förbindelserna som förbinder angränsande celler. I denna studie immunostained vi occludin för fluorescensmikroskopi, men olika andra proteiner närvarande i den snäva korsningen kan användas för denna analys, inklusive transmembranproteiner av korsningen adhesionsmolekyl (JAM), claudin och occludin familjer. Här, färgade vi den extracellulära domänen för att kringgå en permeabilization steg, men ändå intracellulära domäner kan även färgas. Vid sidan av detta är att använda kontrollerna för icke-specifik färgning, med hjälp av fluorescerande sekundära antikroppar enbart frånvaro av tight junctions (här använde vi celler med en monolager visar lågt TEER), eller störningar av tight junctions med hjälp av kopplings-modulerande medel som räknas ovan.

I vårt exempel på transepitelial transporter använder vi ICAM-1-riktade NCS men transwell systemet rymmer även transport av andra läkemedelsformulering fordons, terapeutiska och diagnostiska föreningar, medfödda föreningar som finns i kroppen, eller en kombination av ovanstående, med värdefulla implikationer för kliniska studier och förståelse för grundläggande vägar. De metoder som vi beskriver att kvantifiera transport över cellmonolager involverar radioisotopmärkning av det målsökande medlet eller terapeutisk last i NC pälsen, men denna strategi kan också användas för att spåra NCS med olika kemiska sammansättningar och strukturer, inklusive linjära eller grenade polymerer, dendrimerer, partiklar , miceller, liposomer, etc. ^4,5,28,29. Olika isotoper (t.ex. ¹²⁵ I, ³ H, ³² P, etc) är tillgängliga för att kvantifiera transport av ett brett utbud av små och stora molekyler: inte bara läkemedelsbärare utan även kemiska och biologiska läkemedel, utan att påverka en funktionell eller strukturell integritet föreningen, till skillnad från skrymmande fluorescerande etiketter. Radiomärkning ger större kvantitativ känslighet och snabbhet i jämförelsetill andra strategier som mäter transport, såsom gelelektrofores, PCR, masspektrometri, HPLC, och fluorescens spektrometri. Denna etikett kan också användas för att bestämma graden av nedbrytning (t.ex. proteinmålsökande medlet och gods i vårt exempel) genom att bedöma fria jodhalten, som är snabb och noggrann jämfört med alternativa proteinaktivitetsanalyser, inklusive UV-spektrofotometri och Western blöt. Eftersom fri jod inte helt återspegla förändringar i proteinkonformation eller aktivitet som kan förekomma i avsaknad av nedbrytning, de ovanstående alternativa metoder kan användas för att ytterligare utvärdera integriteten hos transporterat material. Dessutom, vid administrering av föreningar med fria radioisotoper i den apikala kammaren, är det oklart om märkningen finns i cellmonolager och transporterade fraktioner resultat av verklig proteinnedbrytning eller diffusion av fri jod från apikala rymden. För att kringgå denna begränsning, den apikala NC koncentrationen kanappliceras under en kort tidsintervall för att tillåta anslutning till cellmonoskiktet, följt av avlägsnande av det apikala mediet i utbyte mot nytt medium, och en chase period för utvärdering av transport. Även en mängd fria radioisotoper från den ursprungliga poolen initialt kan läcka in i de andra fraktionerna, kan detta värde bestämmas från prover utan chase perioden och subtraheras från förhållanden där en chase period.

När det gäller bedömningen av mekanismen för transport, samma metoder som beskrivs för att validera cellslager integritet (TEER, läckage analyser, och tight junction färgning) kan användas för att utvärdera den paracellulära vägen. För transcellulär transporter, farmakologiska hämmare av bestämningsfaktorer som är involverade i intracellulär människohandel (t.ex. transferrin associerade till clathrin vägar, koleratoxin B associerade till caveolar vägar, etc.) kan användas, varvid effektiva koncentrationer för att specifikt hämmar dessa bestämningsfaktorer behöver to belysas för varje system. Alternativ till de inhibitorer som används i vår studie inkluderar klorpromazin och kaliumbrist, som är specifik för clathrin beroende endocytos, och genistein och metyl-β-cyklodextrin (MβCD), specifik för caveolae medierat upptag ^30. Andra strategier som kan undvika potentiella icke-specifika effekter av farmakologiska hämmare involverar co-lokalisering av transporterat gods med dessa bestämningsfaktorer som använder fluorescens-eller radioisotopmärkning, användning av specifika ligander som kontroller (t.ex. transferrin eller koleratoxin B, enligt ovan), och siRNA att VÄLDIGANDE uttrycket av regulatoriska element i dessa banor.

I denna studie visar vi ekvationer för konvertering av radioaktivitet uppgifter till olika parametrar som ger viktig preliminär information om transepitelial transporter. Exempelvis är graden av transepitelial transport representeras av NCs eller molekyler som transporteras per cell, effektiviteten för transport av innehåll som binder eller träder celler representeras av procentuell andel av cellassocierade NCs eller molekyler som transporteras, och transporthastigheten, vilket möjliggör jämförelse mellan permeabilitet mellan olika lösta ämnen, betecknas med P _app. För att förstå potentialen av riktade NCs för storskalig leverans av läkemedel (t.ex. den dos som behövs för administration in vivo), kan dessa ekvationer modifieras för att uppskatta transportvärden i makroskopisk skala. Exempelvis kan mängden av en terapeutisk last transporteras per ytenhet av tarmvävnad (mg / cm ²⁾ och den potentiella leverans över hela mag-tarmkanalen hos en patient beräknas med följande formler,
Mass gods transporteras / cm ² vävnad = (CPM _basolaterala / specifik aktivitet) / A
Mass gods transporteras över tunntarmen = [(CPM _basolaterala / specifik aktivitet) × TA] / A

ve_content "> där specifik aktivitet representerar den uppmätta CPM / massenhet av last (se protokollet, steg 3,1), och TA representerar den totala absorberande ytan av tunntarmen (2.000.000 cm ^2). därför de uppgifter som följer av våra metoder ger upphov till ett stort antal möjliga kvantitativa analyser som beskriver transport i relevanta termer.

Avancera från Transwell skär, modeller som bättre speglar den fysiologiska komplicerade transporter inkluderar "Ussing" kammare och mikroflödessystem enheter, som ger dynamiska vätskeflöde och en innesluten kammare som minimerar kontakt med luft, som i blodkärlen. Dessa modeller kan även vävnadsexplantat som odlas för ex vivo-studier, före validering in vivo ^17,18.

Sammanfattningsvis har de metoder som användes i denna studie gav värdefulla preliminär information om transport av en modell läkemedelstillförselsystem, i termer av efficieNCY, över cellmonolager. Med hjälp av denna cellodlingsmodell vi visat potentialen i ICAM-1-riktade nanocarrier plattform i samband med oral tillförsel av läkemedel, vilket banade väg för efterföljande in vivo-studier, men kan modifieras för andra system som kräver transport över cellulära barriärer som finns i kropp.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90