Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Summary

De nombreuses applications thérapeutiques nécessitent un transport sûr et efficace des transporteurs de drogue et leurs cargaisons à travers les barrières cellulaires dans le corps. Cet article décrit une adaptation des méthodes établies pour évaluer la vitesse et le mécanisme de transport de nanovecteurs de médicaments (NCS) à travers les barrières cellulaires, telles que la gastro-intestinale (GI) épithélium.

Abstract

Transporteurs sous-micrométriques (nanocarriers; CN) améliorer l'efficacité des médicaments en améliorant la solubilité, stabilité, temps de circulation, le ciblage et la libération. En outre, traversant les barrières cellulaires dans le corps est crucial à la fois pour l'administration orale de CN thérapeutiques dans la circulation et le transport du sang vers les tissus, où l'intervention est nécessaire. Le transport NC à travers les barrières cellulaires est obtenue par: (i) la voie paracellulaire, par l'intermédiaire de la perturbation transitoire des jonctions qui s'imbriquent les cellules adjacentes, ou (ii) la voie transcellulaire, où les matériaux sont internalisées par endocytose et transportées à travers le corps de la cellule et sécrétée à la surface de la cellule opposée (transyctosis). Livraison à travers les barrières cellulaires peut être facilitée en couplant la thérapeutique ou de leurs supports avec des agents de ciblage qui se lient spécifiquement à des marqueurs de surface cellulaire impliquées dans le transport. Ici, nous fournissons des méthodes pour mesurer l'ampleur et le mécanisme du transport NC à travers une barrière cellulaire modèle, la WHIch est constitué d'une monocouche de gastro-intestinal (GI) de cellules épithéliales cultivées sur une membrane poreuse située dans un insert Transwell. Formation d'une barrière de perméabilité est confirmée par la mesure de la résistance trans-épithéliale électrique (TEER), le transport transépithélial d'une substance de contrôle, et l'immunomarquage des jonctions serrées. A titre d'exemple, ~ 200 nm CN polymères sont utilisés, qui portent une cargaison thérapeutique et sont revêtues d'un anticorps qui cible un déterminant de surface cellulaire. L'anticorps ou de la cargaison thérapeutique est marqué avec ¹²⁵ I pour radio-isotope le traçage et les coordonnateurs nationaux marqués sont ajoutés à la chambre haute sur la monocouche de cellules pour des périodes variables. CN associés aux cellules et / ou transportés à la chambre sous-jacente peut être détectée. Mesure de libre ¹²⁵ I permet la soustraction de la fraction dégradée. La voie paracellulaire est évaluée par la détermination de changements potentiels causés par le transport NC pour les paramètres de barrière décrits ci-dessus. Transcellulaire transports is déterminé en abordant l'effet de moduler endocytose et la transcytose voies.

Introduction

Barrières cellulaires dans le corps agissent comme une passerelle entre l'environnement extérieur et compartiments internes. C'est le cas pour la muqueuse épithéliale séparant la surface externe exposée de la gastro-intestinal (GI) et dans la circulation sanguine ^1-3. Des barrières cellulaires représentent également l'interface entre le sang et le parenchyme et les composants cellulaires de tissus et d'organes. C'est le cas pour le revêtement endothelial interne des vaisseaux sanguins, telles que la barrière hémato-pulmonaire, la barrière hémato-encéphalique, etc ¹ La capacité à traverser ces barrières cellulaires dans l'organisme est essentielle pour la distribution efficace des agents thérapeutiques et diagnostiques dans la circulation et les tissus / organes où une intervention est nécessaire.

Pour améliorer la prestation des agents thérapeutiques ou diagnostiques, ces composés peuvent être chargés dans nanocarriers sous-micrométriques (CN). Ces véhicules d'administration de médicaments peuvent être formulés avec une grande variété dechimiques et des structures pour optimiser la solubilité du médicament, la protection, la pharmacocinétique, la libération et le métabolisme ^{de 4,5.} CN peut également être fonctionnalisé par affinité ou des fractions de ciblage (par exemple, des anticorps, des peptides, des aptamères, des sucres, etc) pour faciliter l'adhésion à des zones du corps où l'effet thérapeutique est requis ^2,6. Ciblage des CN déterminants exprimés à la surface des barrières cellulaires peut en outre faciliter le transport dans et / ou à travers ces garnitures ^2,6.

Le rôle de transporter sélectivement les substances entre deux environnements nécessite certaines caractéristiques uniques entre les couches de cellules. Une de ces caractéristiques est la polarité cellulaire, grâce à quoi la membrane apicale en regard de la lumière de cavités varie de la membrane baso-latérale orientée vers l'interstitium des tissus, par rapport à la morphologie de la membrane et de la composition des lipides, des transporteurs, et ^deux récepteurs. Une autre caractéristique implique junctio intercellulairens de raccordement des cellules adjacentes. La régulation des protéines qui forment des jonctions serrées, des molécules d'adhérence en particulier de jonction (confitures), occludins et claudines, moduler la fonction de la barrière pour permettre de manière sélective ou non le transport de substances entre les cellules, appelées le transport paracellulaire, permettant le passage des matériaux à partir du lumen de l'espace basolatéral ^3. Reliure de nombreux éléments naturels et synthétiques (leucocytes, des molécules, des particules et des systèmes de délivrance de médicaments) à des barrières cellulaires dans le corps peut provoquer ouverture cellule jonction, qui peut être transitoire et relativement inoffensifs ou plus prolongée et, par conséquent, dangereux avec un accès de substances indésirables à travers la barrière ^2,5,7-9. Par conséquent, cette voie peut être évaluée en mesurant la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) et passive paracellulaire diffusion des molécules (ci-après appelé de fuite paracellulaire), grâce à quoi une diminution de la résistance d'un courant électrique ou une fuite paracellulaire accrue d'une inecomposé rt dans l'espace basolatéral indiquer ouverture des jonctions cellulaires, respectivement ^5,10,11. En complément de ces méthodes, l'une des protéines des jonctions serrées énumérés ci-dessus peuvent être colorées pour évaluer leur intégrité, où la coloration doit apparaître concentrée aux frontières cellule-cellule tout autour de la périphérie de la cellule ^5,10,12.

Alternativement, les systèmes d'administration de médicaments qui ciblent les déterminants de surface cellulaire spécifiques, tels que ceux associés à des fosses recouvertes de clathrine ou invaginations de la membrane en forme de flacon-disant cavéoles, peuvent déclencher l'absorption vésiculaire dans les cellules par endocytose, fournir une avenue pour l'administration de médicaments à des compartiments intracellulaires ^{5, 13.} En outre, l'endocytose peut conduire à la traite des vésicules à travers le corps de la cellule de mise sur le côté basolatéral, un phénomène connu sous le nom transyctosis, ou le transport transcellulaire ^14. Par conséquent, la connaissance de la cinétique et le mécanisme d'endocytose peut être utilisé pour exploiter une intracellulairend délivrance transcellulaire des médicaments, qui offre un mode de livraison relativement sûre et contrôlée par rapport à la voie paracellulaire. (Endocytose comme dans le cas de la molécule d'adhésion cellulaire (CAM) médiée) Le mécanisme d'endocytose peut être évaluée avec des modulateurs de voies classiques (clathrine et endocytose de la cavéoline-médiation, et macropinocytose) ou des voies non classiques ^5,13,15 .

Attendu que le trafic intracellulaire est souvent étudiée dans des puits ou des lamelles couvre-objet classiques, l'absence d'un compartiment basolatéral s'oppose à la polarisation de la cellule et la capacité d'étudier le transport à travers les couches de cellules. Pour surmonter cet obstacle, le transport à travers des monocouches de cellules a été longuement étudié en utilisant des inserts Transwell ^10,11,16,17, qui sont constitués d'une chambre supérieure (apicale), une membrane poreuse perméable, où les cellules se fixent et forment une monocouche étanche, et une plus faible (basolatérale) chambre (Figure 1). Dans cette configuration, le transport peut être mesurée dans l'apical-basolatéral à-direction par l'administration d'un traitement dans la chambre supérieure, à la suite du transport à travers la monocouche cellulaire et la membrane poreuse sous-jacente, et finalement la collecte du milieu dans la chambre inférieure, pour la quantification de matière transportée. Transport dans la direction basolatérale à apicale peut également être mesurée par administration initiale à la chambre inférieure et la collecte subséquente de la chambre supérieure ^5,10,12,16. Il existe diverses techniques pour vérifier la formation de la barrière de perméabilité sur transwells, y compris des dosages TEER et de transport paracellulaire, comme décrit ci-dessus. En outre, le filtre perméable à laquelle les cellules sont mises en culture peut être enlevé pour l'analyse d'imagerie (par exemple par fluorescence, confocal, microscope électronique), que en outre la validation du modèle de monocouche de cellules ainsi que le mécanisme de transport. Le choix du type de membrane, qui est disponible en différentes tailles de pores, les matériaux, et les zones de surface, dépend de divers factors tels que la taille des substances ou objets à transporter, le type de cellule, et la méthode d'imagerie ^16,18-20. Transwell inserts facilitent également la quantification précise et contrôlée du transport par rapport aux systèmes de mammifères complexes, comme les volumes des chambres et la zone de surface de la cellule sont des constantes connues. Bien que de nombreux facteurs impliqués dans la délivrance in vivo sont éliminés, y compris la présence de mucus intestinal, contrainte de cisaillement, les enzymes digestives, les cellules immunitaires, etc, cette petite échelle modèle in vitro fournit des informations préliminaires utiles concernant le transport.

A titre d'exemple pour illustrer l'adaptation de ces méthodes pour étudier le transport à travers les barrières cellulaires NC ^10,11,16,17, nous décrivons ici un cas où le potentiel de transport NC à travers l'épithélium gastro-intestinal a été modélisé en évaluant passage d'une livraison de drogue de modèle système à travers une monocouche de l'adénocarcinome colorectal humain epithelial (Caco-2) des cellules. A cette fin, caunes ont été cultivées dans des inserts Transwell, sur un pore de 0,8 um en polyéthylène téréphtalate (PET) filtre (diamètre 6,4 mm), qui est transparent et peut être utilisé pour l'imagerie par microscopie. L'état de la barrière de perméabilité est validé par la mesure de la TEER, le transport apical-basolatéral à-d'une substance de contrôle, l'albumine, la microscopie à fluorescence et la visualisation d'un élément des jonctions serrées, la protéine occludine. Un modèle de polymère ciblé NC est utilisé, composé de 100 nm, les nanoparticules de polystyrène non biodégradables. CN sont recouvertes par une adsorption de surface avec un anticorps ciblant seul ou une combinaison d'un anticorps de ciblage et un cargo thérapeutique, où l'une ou l'autre composant peut être marqué avec un radio-isotope ^125I pour le traçage. Dans l'exemple choisi, l'anticorps reconnaît la molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1), une protéine exprimée à la surface de l'épithélium gastro-intestinal (et d'autres), les cellules, ce qui a été montré pour faciliter le transport intracellulaire et transcellulaire o transporteurs de drogue de f et de leurs cargaisons ^21. La cargaison est l'alpha-galactosidase (α-Gal), une enzyme thérapeutique utilisé pour le traitement de la maladie de Fabry, une maladie de surcharge lysosomale génétique ^22.

Les CN enrobés, de l'ordre de 200 nm de diamètre, sont ajoutés à la chambre apicale sur la monocouche cellulaire et incubées à 37 ° C pendant différentes périodes de temps, après quoi, ¹²⁵ I, le CN peuvent être détectés associés à la monocouche cellulaire et / ou transportée vers la chambre basolatérale-dessous les cellules. Détermination supplémentaire de droits ¹²⁵ I permet la soustraction de la fraction dégradée et l'estimation des revêtu transports NC. Le mécanisme de transport est en outre évalué en examinant les variations de la barrière de perméabilité relative à la voie paracellulaire, par l'intermédiaire des paramètres décrits ci-dessus, alors que le transport transcellulaire est déterminée en examinant les changements dans le transport lors de la modulation des voies de l'endocytose et la transcytose.

ontenu "> Ces méthodes fournissent des renseignements précieux sur les modèles de barrière cellulaire, l'ampleur et la vitesse de transport d'un système de délivrance de médicaments, et le mécanisme de ce type de transport, permettant tout à fait l'évaluation du potentiel pour l'administration de médicaments à travers les barrières cellulaires.

Protocol

Une. La culture d'une monocouche de cellules dans TRANSWELL Inserts

1. Dans un niveau de biosécurité 2 cellule culture hotte stérile, placer 0,8 mm pores PET TRANSWELL inserts dans une plaque de 24 puits (4 puits par condition, la signification statistique) avec une pince. Tous les matériaux entrant dans la hotte doivent être stérilisés avec de l'éthanol.

Remarque: La taille des pores du filtre doit être sélectionnée en accord à la taille moyenne de la NC utilisées, pour permettre le transport à travers la membrane. En outre, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, chaque condition expérimentale a besoin d'un minimum de quatre répétitions (puits) à l'intérieur de la même expérience, et un minimum de trois expériences indépendantes.

2. Préparer un milieu de culture cellulaire contenant du milieu DMEM supplémenté avec 4,5 g / L de glucose, sérum bovin fœtal à 15%, et 1% de Pen Strep, et chauffer à 37 ° C dans un bain d'eau.
3. Diluer adénocarcinome colorectal épithéliales humaines (Caco-2) cellules dans un milieu cellulaire et le lieu200 à 400 pi de la solution de cellules dans le (apicale) chambre supérieure de l'insert Transwell, à une densité de 1,5 x 10 ⁵ cellules / cm ^2. Remplir le (basolatéral) avec la chambre inférieure 700 à 900 ul de milieu cellulaire.
4. des cellules de culture à 37 ° C, 5% CO ₂ et 95% d'humidité pendant 16 à 21 jours, en remplaçant le milieu dans la chambre supérieure et inférieure tous les 3-4 jours, en utilisant les volumes indiqués à l'étape 1.3. Remplacer le milieu dans l'ordre suivant pour maintenir la pression au-dessus (plutôt que ci-dessous) de la monocouche cellulaire: aspirer le fluide de la chambre inférieure, aspirer le milieu de la chambre supérieure, remplir la chambre supérieure avec du milieu frais, et de remplir la chambre inférieure avec milieu frais.

2. Validation de l'IG épithéliale barrière de perméabilité Utilisation transepitheliale résistance électrique (TEER) et Immunocoloration des jonctions serrées

1. Pour le stockage à court terme (moins de 2 semaines), plonger les électrodes dans une solution STX100 d'électrolytetion (0,1-0,15 M KCl ou NaCl). Connecter le câble d'électrode à l'orifice d'électrode sur l'appareil EVOM volts ohms de telle sorte que le système est en court-circuit interne et l'électrode symétrie est conservée. Pour le stockage à long terme, rincer avec dH ₂ O et stocker dans un état ​​sec et sombre.
2. Pour stériliser les électrodes, immerger dans de l'éthanol pendant 15 minutes et laisser sécher à l'air pendant 15 sec. En variante, les électrodes peuvent être mémorisés dans une hotte à UV. Rincer les électrodes dans une solution stérile d'électrolyte (solution saline tamponnée de phosphate, PBS) ou de 0,1 à 0,15 M de KCl ou de NaCl solution, avant chaque mesure d'une résistance.
3. Avec l'appareil de mesure de tension ohm réglé sur la valeur de la résistance, de placer à la verticale des électrodes dans un puits contenant l'insert Transwell, avec le court-électrode dans la chambre supérieure et la longue chaîne de mesure dans la chambre inférieure touche le fond du puits. Une fois la lecture de EVOM stabilise, enregistrer la valeur de résistance (donné en ohms; Ω) de chaque bien.
4. Calculer la résistivité (résistanCE étalonnée par rapport à la zone; Ω × ² cm) des échantillons par soustraction de la résistance à l'arrière-plan (TEER des inserts Transwell sans cellules) et en multipliant par la membrane de surface. les valeurs de résistivité sont le plus souvent décrits dans la littérature. (Voir la discussion)
5. Répétez mesures tous les 1-2 jours jusqu'à ce que les valeurs TEER lieu à un maximum et plateau, indiquant la formation d'une barrière de perméabilité, ce qui prend généralement 2-3 semaines à partir du moment de platting cellulaire. Les valeurs et le temps nécessaire pour atteindre l'intégrité de la barrière Plateau TEER peuvent varier en fonction du nombre de passage de cellules.
6. Pour vérifier la présence de jonctions serrées dans des monocouches de cellules avec une grande TEER (supérieure ou égale à la valeur de seuil pour la formation de la barrière), fixer les cellules par incubation avec du paraformaldehyde froid à 2% pendant 15 min. Ensuite, laver les cellules avec du PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante avec 1 pg / ml anti-occludine. Laver les cellules avec du PBS à nouveau et les incuber pendant 30 min à température ambiante avec 7,5 pg / ml de fAnticorps secondaires luorescently marqués. Utilisation des puits ayant un faible TEER en tant que témoin négatif pour la formation de la barrière.

Remarque: En tant que substitut pour l'anti-occludine, des anticorps dirigés contre les protéines des jonctions serrées alternatives peuvent être utilisées.

7. Exciser soigneusement la membrane de filtre sur lequel la monocouche fixe est fixé, et monter sur des lames pour l'imagerie utilisant épifluorescence ou la microscopie confocale.

3. Évaluer transepitheliale transport des transporteurs ciblées

1. Marquer l'anticorps (anticorps monoclonal de souris contre ICAM-1 et anti-ICAM, dans cet exemple) avec ¹²⁵ I de ciblage, comme décrit précédemment ^7. Utilisation dosage de Bradford pour estimer la concentration en protéines et un compteur gamma pour déterminer ^125I contenu sur l'anticorps, puis calculer l'activité spécifique en coups par minute (CPM) / mg de l'anticorps marqué.

Remarque: Pour contrôler la spécificité, retourbe par la procédure d'étiquetage de l'IgG de souris, qui sera utilisé pour préparer CN enrobés non ciblées. Pour étudier le transport d'une cargaison thérapeutique, répétez la procédure d'étiquetage de la cargaison, par exemple, l'alpha-galactosidase (α-Gal) dans cet exemple. Alternatives peuvent être utilisés pour l'agent de ciblage, le contrôle non spécifique, ou de la cargaison thérapeutique. D'autres méthodes peuvent également être utilisées pour marquer les composés et estimer la concentration des homologues marqués.

2. Couple le ciblage marqué anticorps (anti-ICAM dans notre exemple) à la surface du CN. Dans cet exemple, incuber nanobilles de polystyrène (diamètre de 100 nm) pendant 1 heure à température ambiante avec du ^{125I-anti-ICAM} pour permettre l'adsorption de surface, tel que décrit ^7.

Remarque: Pour le contrôle non spécifique, utilisez ¹²⁵ I-IgG. Pour tracer le transport d'une cargaison, utiliser une combinaison de ciblage anticorps et ¹²⁵ I-marqué fret (α-Gal dans notre exemple).

3. Centrifuger à 13 000 g pendant 3 min et retirez les homologues non revêtues dans le surnageant par aspiration. Remettre en suspension le culot contenant les CN enrobés en utilisant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS par pipetage, et de traitement par ultrasons à faible puissance pour perturber agrégats de particules de potentiel (20-30 brèves impulsions).
4. Pour NC caractérisation, mesurer la taille, polydispersité, et ζ potentiel de particules enrobées en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (en suivant les instructions du fournisseur), et de quantifier le nombre de ¹²⁵ I-marqué ciblant des molécules d'anticorps (par exemple, anti-ICAM) sur la surface des particules en utilisant un compteur gamma.

Note: Ces méthodes peuvent être répétées pour les homologues non spécifiques et thérapeutiques. La taille des particules enrobées est comprise d'environ 200 nm.

5. Ajouter ¹²⁵ CN I-anticorps (par exemple, ^{125I-anti-ICAM;} MDO 56 nCi / ml) à la chambre supérieure au-dessus de confluence des monocouches Caco-2 avec TEER et# 8805; 350 Ω x cm ² (voir discussion) sur fond (16-21 jours après le semis). Incuber à 37 ° C pendant une temps ou des intervalles plus désiré. Mesurer TEER (section 2.3) avant et après incubation à évaluer les effets de la CN sur la barrière de perméabilité.

Remarque: Cette procédure peut être répétée pour les homologues non spécifiques et thérapeutiques.

6. Recueillir moyen des chambres supérieures et inférieures et les laver une fois avec 0,5 ml de DMEM à 37 ° C (chambre haute) ou 1 ml dH ₂ O (chambre basse). Recueillir les lavages pour la mesure de la teneur totale de radio-isotope à l'aide d'un compteur gamma.
7. Pour la mesure de la fraction de cellules, exciser le filtre perméable, par exemple en utilisant une lame de rasoir pour couper les bords, et incuber dans un tube compteur gamma avec 1% de Triton X-100 pendant 10 min (pour libérer le contenu des cellules), avant de la cellule de mesure associée à la radioactivité totale.
8. Pour mesurer ¹²⁵ je reloué de CN pendant le transport ou en raison de la dégradation potentielle, premier mélange 300 ul d'échantillon (des fractions supérieures, inférieures ou cellulaires) avec 700 pi de 3% de BSA dans du PBS et 200 ul d'acide trichloroacétique (TCA). Incuber à température ambiante pendant 15 min. Entre-temps ce temps, mesurer la radioactivité totale de l'échantillon dans un compteur gamma.
9. Centrifuger les échantillons de TCA à 3000 xg pendant 5 minutes pour séparer les protéines intactes (pastille) à partir de la protéine dégradée ou ^125I fraction (surnageant). Quantifier la radioactivité de la libre ¹²⁵ je fraction et soustraire cette valeur de la radioactivité totale mesurée avant la centrifugation. Cela fournira la quantité de protéine marquée qui n'est pas dégradé.

4. Mécanisme de transepitheliale Transport de nanocarriers ciblées

1. Étiquette albumine avec ¹²⁵ I tel que décrit à la section 3.1 et précédemment rapporté ^7.

Note: L'albumine est un 66,5kDa et, par conséquent, une substance relativement grande. Même si un contrôle valable pour le transport passif des objets plus grands (par exemple 200 nm CN utilisés ici), il doit être remplacé par de plus petites molécules traceurs inertes d'étudier le transport des transporteurs de drogue petits (voir Discussion).

2. Pour évaluer le transport paracellulaire utilisant paracellulaire fuite de l'albumine, de la culture Caco-2 Des monocouches sur des inserts Transwell tels que décrits ci-dessus.
3. Au milieu de la chambre supérieure au-dessus de la monocouche cellulaire, ajouter soit ¹²⁵ I-albumine seul (contrôle négatif indiquant le niveau basal de fuite), ou ¹²⁵ Comités Nationaux d'anticorps ciblés I-albumine et non radiomarqués (tel que décrit à la section 3.5). Incuber à 37 ° C pour l'intervalle sélectionné de temps (s), ce qui devrait correspondre à ceux examinés lors de l'essai de transport NC. Mesurer TEER (section 2.3) avant, pendant et après l'incubation, collecter toutes les fractions pour un total ^{de 125} I et ¹²⁵ I gratuits mesures comme indiqué. dans la section 3 Remarque: outre concomitante de ¹²⁵ commande I-albumine et non radiomarqué CN IgG peut être utilisé comme un contrôle.
4. En tant que témoin positif pour l'ouverture des jonctions intercellulaires, ajouter milieux cellulaires contenant 5 mM de H ₂ O ₂ dans les chambres supérieure et inférieure de l'insert Transwell, et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Ensuite, mesurez TEER (section 2.3) et ajouter ¹²⁵ I-albumine à la chambre supérieure pour les intervalles de temps choisis. Mesurer la TEER à différents points dans le temps tout au long de l'incubation pour identifier décroissance de la valeur TEER provoquée par H ₂ O _2-ouverture induite par des jonctions cellulaires.
5. Dans des expériences parallèles, évaluer transport transcellulaire, également appelé transcytose, de ¹²⁵ Comités Nationaux je ciblées par incubation confluentes Caco-2 monocouches soit avec 50 uM monodansylcadavérine (MDC; inhibiteur de l'endocytose clathrine), 1 pg / ml filipine (inhibiteur de caveolar endocytose médiée), 0,5 uM Wortmanndans (inhibiteur de la phosphatidylinositol 3-kinase [PI3K], impliqué dans macropinocytose), ou 20 uM [5 - (N-éthyl-N-isopropyl) amiloride] (IEAP, inhibiteur de macropinocytose et endocytose médiée ^CAM-15).

Note: ¹²⁵ I-IgG CN ^I-125 et de l'albumine peuvent être utilisés comme témoins négatifs pour l'effet de ces inhibiteurs, et d'autres méthodes (par exemple des techniques de siARN) peuvent fournir une inhibition plus sélective.

6. Mesurer TEER (section 2.3), avant, pendant, et après incubation des cellules avec des inhibiteurs et des matériaux radio-marqués, comme un contrôle supplémentaire de l'effet des inhibiteurs sur la perméabilité de la monocouche.

Representative Results

Comme validation de notre modèle cellulaire pour étudier le transport transépithélial de CN ciblées, la figure 2 montre que les cellules Caco-2 Des monocouches de cellules étalées à une densité de 1,5 x 10 ⁵ cellules / cm ² atteint la confluence ~ Jour 12 et maintenu l'intégrité de la monocouche jusqu'au jour 18, indiqué par la TEER (Figure 2A). Cela a été validé par la présence de jonctions serrées occludines positif (figure 2B) dans les monocouches à haute TEER (390 Ω x cm ^2, Jour 14), par rapport au mauvais étiquetage serré de jonction à faible TEER (17 Ω x cm ^2, Jour 5 ).

Traçage du marqueur radioactif sur des éléments CN détermine la quantité totale de ces composants (NC ciblage anticorps ou de la cargaison) initialement ajoutée à la chambre apicale, leur fraction associée aux cellules, et leur fraction transportée vers le côté basolatéral. Ces valeurs peuvent être utilisées pour calculer les différents paramètres qui décrivent le transport NC dans unde manière plus pertinente, en particulier après soustraction de contenu gratuit ¹²⁵ I de chaque fraction, qui représente homologues dégradées. Par exemple, le nombre de molécules d'anticorps, des molécules de fret, ou NCS associés qui sont transversale la monocouche cellulaire peut être calculé pour estimer le transport absolu. En outre, le pourcentage de molécules ou desdits CN qui est transporté vers le côté basolatéral par rapport au nombre total de molécules ou CN associés à la monocouche de cellules, estime l'efficacité du dit transport. Enfin, le coefficient apparent de perméabilité (P _app), un paramètre standard pour la vitesse de transport, peut être estimé. Ces paramètres sont calculés comme il suit:

Molécules transportées ou CN transportés = × _{basolatérale} CPM (molécules _ajoutée ou NC _ajouté / CPM _ajouté)
% de molécules ou CN transportés = 100 x _{[basolatérale} / (CPM _{basolatérale} CPM CPM +fraction cellulaire)]
P _app (cm / s) = (CPM _{basolatérale} × Vol.) / (A × t × CPM _ajoutée)

où CPM sont le ¹²⁵ je comptages par minute ajoutée à la chambre supérieure (CPM _ajouté), la fraction de monocouche cellulaire (fraction CPMcell), ou la chambre basse (CPM _{basolatérale),} et NC _ajoutés ou molécules _ajoutée le nombre de Comités Nationaux ou des molécules initialement ajoutées à la chambre supérieure, A est l'aire de surface de la membrane du filtre (cm ^2), vol. est le volume du milieu dans la chambre supérieure (ml), et t est le temps d'incubation (s).

Dans notre exemple, lorsque l'isotope radioactif est de l'étiquetage d'anticorps ciblant, cette analyse révèle le degré et l'efficacité des transports en termes d'anticorps ou CN transportés par cellule et le pourcentage d'anticorps ou de Comités Nationaux qui ont été transportées monocouche associés aux cellules (figure 3A et 3B ), comme nous l'll que la vitesse de transport en termes de P _application (figure 3D). Ces paramètres estimés, dans notre exemple de ¹²⁵ CN I-anti-ICAM, ont également été comparés à ceux de contrôle ¹²⁵ I-IgG CN pour démontrer l'efficacité du transport par rapport à un homologue non ciblée (figure 3C et 3D).

Lorsque le marqueur radioactif est incorporé sur la cargaison NC, les paramètres décrits reflètent le transport de la cargaison, qui dans notre exemple est α-Gal enzyme utilisé pour le traitement d'un trouble de surcharge lysosomale génétique connue comme la maladie de Fabry (tableau 1). En plus de calculer le transport NC en traçant ladite cargaison, livraison transépithélial de cette enzyme thérapeutique peut être estimée, par exemple, en l'exprimant sous forme de molécules de masse ou de α-Gal transporté par cellule.

Enfin, cette méthode attribue la voie de transport de la voie paracellulaire ou l'transcellulaire itinéraire. Par exemple, dans notre exemple, l'IEAP a réduit le transport de ¹²⁵ Comités Nationaux I-anti-ICAM travers Caco-2 monocouches de cellules (figure 4A), tandis que MDC, filipine, et wortmannine n'ont pas réduit les niveaux de transport par rapport à la condition de contrôle (pas d'inhibiteur ). Ceci suggère que les CN anti-ICAM utilisent endocytose CAM médiation pour le transport transcellulaire, mais pas la clathrine, caveolar, ou transcytose liés macropinocytose. En outre, le transport paracellulaire a été écarté en utilisant des mesures de TEER (figure 4B) et un transport passif de l'albumine (figure 4C), grâce à quoi une diminution de la TEER et une augmentation de la fuite paracellulaire de l'albumine dans la chambre inférieure pendant le transport des commandes numériques anti-ICAM auraient la perturbation indiquée de jonctions intercellulaires. Cependant, l'incubation avec un anticorps anti-ICAM CN n'a pas modifié TEER ou ¹²⁵ I-albumine paracellulaire fuite sur une période de 48 h, semblable à contrôler CN IgG qui ne sont pas transportés. Commeun témoin positif pour l'ouverture des jonctions cellulaires et le transport paracellulaire, H ₂ O ₂ TEER a diminué à des niveaux basaux et nettement améliorée fuite ¹²⁵ I-albumine de la chambre basolatérale.

Figure 1. Schéma de transport trans-épithélial de nanocarriers ciblées à travers un modèle épithélial gastro-intestinal. (A) En tant que plate-forme pour étudier le transport trans-épithélial, Caco-2 monocouches de cellules sont cultivées sur des inserts transwell jusqu'à une monocouche étanche est formé (16-21 jours après le semis, TEER ≥ 350 Ω x cm ² sur fond). Un exemple d'un véhicule d'administration de médicament, tels que ¹²⁵ CN I-anti-ICAM, est ajouté à la (apicale) chambre au-dessus de la monocouche cellulaire supérieure pour étudier le transport à travers les cellules et à travers la membrane poreuse sous-jacente.Le milieu dans le (basolatéral) chambre inférieure est ensuite recueilli, pour la quantification de matière transportée. (B) Le transport à travers la monocouche cellulaire se produit soit par un paracellulaire ou transcellulaire / transcytose itinéraire. Reproduit de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Cliquez ici pour agrandir la figure

Figure 2. Les monocouches Caco-2 en tant que modèle pour le transport trans-épithélial. Cellules Caco-2 ont été cultivées sur des inserts Transwell à 1,5 × 10 ⁵ cellules / cm ^2. (A) transepitheliale résistance électrique (TEER) a été mesurée pour évaluer l'intégrité de la monocouche. Les données sont représentées en tant que moyennes ± SEM, n = 3. (B) La microscopie à fluorescence des jonctions serrées immunomarquées avec un anti-occludine et un anticorps secondaire marqué Texas Red, aux jours 5 et 14 (par rapport à de faibles valeurs élevées de TEER, respectivement). Reproduit de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Cliquez ici pour agrandir la figure

Figure 3. Transport des nanovecteurs anti-ICAM travers Caco-2 Des monocouches de cellules. Confluentes monocouches Caco-2 cultivées sur des inserts Transwell ont été incubées avec ¹²⁵ CN I-anti-ICAM ou ¹²⁵ I-IgG CN ajouté à la chambre apicale. (AC) ¹²⁵ I contenu dans la chambre basolatérale a été mesurée à des points de temps indiqués, pour calculer le montant de CN transpsignalés auparavant par cellule (voir résultats représentatifs). (B) Pourcentage de commandes numériques transportés a été calculée comme le rapport de supports présents dans la fraction à basolatérale que dans les fractions cellulaires et basolatéral combinées. (D) les coefficients de perméabilité apparente (P _app) ont été calculées comme décrit dans Les résultats représentatifs, en raison de taux de transport de ¹²⁵ Comités Nationaux I-anti-ICAM ou ¹²⁵ I-IgG CN. Les données sont représentées en tant que moyennes ± SEM, n = 4. Reproduit de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Cliquez ici pour agrandir la figure

Figure 4. Mécanisme de transport d'unnanocarriers nti-ICAM travers Caco-2 monocouches. (A) le transport transcellulaire de ¹²⁵ Comités Nationaux I-anti-ICAM travers confluentes Caco-2 monocouches a été évaluée à 24 heures en l'absence ou en présence de 20 pM IEAP, 1 pg / ml filipine, 50 uM MDC, ou 0,5 uM wortmannine. (B) TEER a été mesurée pendant le transport de ¹²⁵ Comités Nationaux I-anti-ICAM travers Caco-2 monocouches, pour évaluer le transport paracellulaire. Les valeurs TEER en l'absence de commandes numériques sont présentés comme témoins (l'intervalle pointillés marque SEM de la valeur moyenne). L'incubation avec 5 mM de H ₂ O ₂ est un témoin positif pour l'ouverture des jonctions intercellulaires. (C) protéine fuite paracellulaire, mesurée comme le coefficient de perméabilité apparente (Papp) de ^{125I-albumine} traversant la monocouche cellulaire en l'absence ou en présence de 5 mM de H ₂ O _2, IgG CN, ou anti-ICAM CN, a été mesurée et calculé comme dans la figure 3. données sont spectaclen en tant que moyenne ± SEM, n ≥ 4. Reproduit de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012). Cliquez ici pour agrandir la figure

	Nombre de CN / associé cellule	Intracellulaire CN / cellule	Transporté CN / cellule	Transporté%	Transportés molécules α-Gal / x 10 5 cellules	pg transporté / Cellule × 10 -3	Papp (x 10 -8 cm / sec)
3 heures	663,4 ± 116,0	434,0 ± 76,8	243.6 ± 15,4	44,4 ± 6,7	1,8 ± 0,2	9,7 ± 1,2	8,1 ± 1,1
24 h	2024,8 ± 409,3	1218,9 ± 255,6	806,9 ± 164,1	40,6 ± 2,0	3,9 ± 0,5	21,3 ± 2,5	1,9 ± 0,4
MDO = nanocarriers; α-Gal = α-galactosidase; total CN associé / cellule = intracellulaire CN / cellules + CN transportés / cellule;% Transporté = (CN transporté / Total CN associé) x 100; P app = coefficient de perméabilité apparente (cm / s). Voir Méthodes pour une description plus détaillée de ces paramètres. Les données sont représentées en tant que moyennes ± SEM (n = 8 puits); (TNF-α-cellules Caco-2).

Tableau 1. Le transport trans-épithélial de α-Gal par nanocarriers anti-ICAM. Transports transcellulaire des anti-ICAM / ¹²⁵ I-α-Gal CN en serfluides Caco-2 monocouches a été évalué à 3 h et 24 h. contenu de radio-isotopes de fractions apical, basolatérales et cellulaires ont été converties en différentes valeurs pertinentes pour le transport, comme décrit dans Les résultats représentatifs. Reproduit de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel. 163 (1), 25-33 (2012).

Discussion

En utilisant les méthodes discutées ci-dessus, un modèle cellulaire pour l'étude du transport des commandes numériques ciblées à travers les barrières cellulaires peut être établi, tel que l'exemple fourni pour Caco-2 des cellules epitheliales, ce qui est pertinent pour l'évaluation du transport de la lumière du GI dans le sang, dans le cas des systèmes d'administration de médicaments par voie orale. Mise en culture des monocouches de cellules épithéliales gastro-intestinal dans des inserts Transwell activée et mesure de fluorescence TEER immunomarquage des jonctions serrées pour confirmer la formation d'une barrière de perméabilité cellulaire. Par la suite, le marquage radioactif de ciblage et des agents thérapeutiques avec ¹²⁵ I a fourni une quantification rapide et sensible des CN ciblées dans et à travers GI monocouches de cellules. Enfin, des études mécanistiques ont été appliquées en utilisant des inhibiteurs d'endocytose, TEER, et un test de fuite paracellulaire albumine pour déterminer si le transport se fait par une route vésiculaire par rapport à une voie paracellulaire.

Un paramètre important dans l'établissement des modèles similaires is le choix d'un type de cellule, qui doivent refléter la nature physiologique de la barrière cellulaire à l'étude. Différentes cellules épithéliales et endothéliales sont d'origine humaine ou animale sont disponibles dans le commerce ^16,18-20. Ceux-ci peuvent être cultivés seuls comme cultures simples tel que décrit ici, ou en tant que co-cultures de ces cellules avec d'autres types cellulaires ^16,18-20 (par exemple les cellules, les cellules immunitaires, les péricytes, etc sécrétant du mucus). Dans une telle forme de co-culture, transwell conditions d'insertion peuvent être modulées pour ajuster les taux et les exigences de croissance respectifs des facteurs de différenciation dans les milieux cellulaires ^16,18-20. Par exemple, un modèle de barrière hémato-encéphalique peut impliquer la co-culture de cellules et les astrocytes ou péricytes endothéliales microvasculaires du cerveau sur la surface opposée du filtre poreux, et les médias respectifs pour chaque type de cellule doit être placé dans chaque chambre ^19. En outre, en fonction de la lignée cellulaire, des composants de la matrice extracellulaire peuvent être demuired pour la fixation des cellules efficace de la membrane poreuse ^{18 à 20.} Il est important de considérer que chaque modèle particulier rendra différents niveaux basales en ce qui concerne les paramètres perméabilité de barrière et les taux et le mécanisme de transport, donc de contrôler les valeurs doivent être obtenues et ces méthodes optimisées pour chaque situation.

Transwell inserts tels que ceux décrits ici, ont été largement utilisés pour étudier le transport des matières à travers des monocouches de cellules, à partir de l'apex vers un compartiment basolatéral ou vice versa ^{5,10-12,16,17.} Cela ne peut pas être atteint par la culture de cellules sur des puits ou des lamelles classiques car ces systèmes ne permettent pas ce type de transport car ils n'offrent pas deux compartiments indépendants et donc ne peuvent pas donner une vue réaliste de tri cellulaire. Par exemple, les matériaux destinés à être naturellement libération de la membrane basolatérale peuvent être shuntés vers d'autres compartiments cellulaires dans un modèle de lamelle couvre-objet, ce qui rend difficile de resosustentent le mécanisme de transport transcellulaire. En outre, contrairement aux lamelles couvre-objet, la configuration Transwell donne lieu à des caractéristiques physiologiquement pertinents associés à la différenciation cellulaire et la membrane polarité ^10,11,16-19. Par exemple, cellules Caco-2 cultivées sur transwells présentent les caractéristiques d'entérocytes matures, y compris la présence de microvillosités et des jonctions serrées, la formation de dôme, et la production d'enzymes de la bordure en brosse ^10,11,17. D'autres paramètres peuvent induire un phénotype plus physiologiquement pertinente, telle que la contrainte de cisaillement dans le cas de cellules épithéliales gastro-intestinales (par exemple, de flux de mucus et les mouvements de contraction) et des cellules endothéliales vasculaires (par exemple la circulation sanguine), qui peut être appliqué dans transwells en utilisant une agitation ou des pompes ^{10 , 16,} et des co-cultures pour produire la croissance nécessaire et des facteurs de différenciation de certains types cellulaires ^16,18-20. Néanmoins, il faut considérer que les lignées cellulaires diffèrent souvent de cellules dans les tissus du corps, e. G. Ils peuvent exprimer certains déterminants à différents niveaux et, par conséquent, les fonctions et les divers règlements actuels. Par exemple, cellules Caco-2 ne contiennent pas toutes les protéines de transport et les enzymes nécessaires pour l'activation et le transport de la thérapeutique par voie orale in vivo, telles que la CYP3A4, une enzyme métabolisant les médicaments ^10,17,23. Dans ces cas, les sous-clones de lignées cellulaires, transfection, ou addition d'agents de transcription peuvent être utilisés moduler la lignée cellulaire de mieux refléter les conditions physiologiques ^17,23,24.

En sélectionnant un modèle optimal de transwell, les différentes caractéristiques du filtre perméable doivent être pris en compte. Filtres perméables sont disponibles en différentes tailles de pores allant de 0,4 à 8 pm, et doivent s'adapter à la taille de la cargaison transportée. Par exemple, des tailles de pores plus petits (0,4 à 3 um) sont typiquement utilisés pour des études de transport de petits composés chimiques, tandis que les pores de 3 um ou plus sont utilisés pour l'invasion des cellules, chemotaxis, et des études de motilité dans lequel microbienne, les cellules immunitaires, et migrateurs sont transportés. La taille des pores et la densité affecte également la densité et la différenciation cellulaires, comme certaines cellules peuvent migrer à travers des pores lors de l'ensemencement, ce qui empêche la formation de la monocouche. En outre, le matériau de l'influence de support perméable à l'imagerie de clarté, pour l'évaluation de la viabilité cellulaire et la formation de la monocouche, et la fixation des cellules. Polyéthylène téréphtalate (PET), les filtres sont transparents, ce qui permet une visibilité sous microscopie à contraste de phase, à la différence de filtres en polycarbonate translucide. Pour améliorer la fixation des cellules, des supports perméables pré-revêtues avec du collagène ou la fibronectine sont disponibles dans le commerce. En outre, le diamètre du filtre, qui est ajustée pour des plaques à puits différents, peuvent influencer la perméabilité, de sorte que les plus grands diamètres (par exemple dans des plaques de 6 puits) ont tendance à augmenter la perméabilité paracellulaire de la monocouche cellulaire.

Une fois qu'un modèle Transwell est établie, y compris l'appropriationte sélection de type de cellule, la composition des milieux, et filtre perméable, le statut de la monocouche cellulaire peut être évaluée au cours de la mise en culture et l'étape expérimentale utilisant TEER. Cependant, les valeurs TEER varient avec 1) les facteurs innés biologiques associés avec le type de cellule, la source et le numéro de passage; 2) les conditions de culture, telles que les caractéristiques précitées transwell, la densité de semis, jours de culture, la composition du milieu et le pH; 3) facteurs physiques , telles que la température, le volume des médias, le plan d'échantillonnage, et le degré d'agitation / lavage et 4) des facteurs pathologiques et / ou chimiques qui modulent cellule intégrité de jonction (par exemple, les cytokines, les cellules immunitaires, le stress oxydatif, les additifs pharmacologiques, etc) ^{10, 16,17.} En raison de divers facteurs biologiques et environnementaux qui influent sur la TEER, une valeur de référence minimum indiquant la formation de la barrière doit être établi pour chaque système en surveillant régulièrement TEER pendant la période de culture et après manipulations expérimentales. Virginielues qui sont jugées adéquates pour la formation de la barrière, qui peut varier entre 150-1,600 Ω × ¹⁶ cm ^2, dépendent également de la taille de la matière à transporter de telle sorte que la diffusion passive paracellulaire de cette substance est limitée, tandis que la TEER ≥ 350 Ω × cm ² semble exclure la diffusion passive de relativement grandes CN tels que ceux présentés ici (200 nm), ce ne peut être le cas pour les petits systèmes de délivrance de médicaments, dans lequel monocouches strictes (par exemple ≥ 700 Ω × cm ²⁾ sont nécessaires. Cette valeur de référence peut également être évaluée en utilisant des contrôles de perturber la barrière de perméabilité, y compris H ₂ O _2, en pénétrant peptides, chélateurs de calcium (par exemple, EDTA), les protéine kinases et les phosphatases, et diverses autres molécules régulatrices ^25-27.

Complémentaire à TEER, de nombreux essais de perméabilité existent pour vérifier l'intégrité de la monocouche et évaluer transposition paracellulairert. Comme l'albumine, d'autres molécules de traçage membrane imperméable de tailles diverses, tels que le mannitol, le jaune Lucifer, l'inuline, et les dextranes, qui peut être couplé avec un UV, fluorescent, ou un marqueur radioactif pour mesurer et comparer les taux de perméabilité (P _appli) à connue valeurs de ces solutés. Lors de l'évaluation du transport paracellulaire, il est important d'utiliser une molécule de traceur qui est plus petit que le composé transporté à l'étude. Par exemple, le transport paracellulaire de 200 nm particules ouvrirait jonctions intercellulaires assez pour provoquer une fuite paracellulaire de petits, et pourtant encore relativement grosses molécules, comme l'albumine utilisée dans notre exemple. En revanche, le transport paracellulaire de véhicules d'administration de médicaments plus petits tels que des dendrimères (~ 5 nm) devrait être évaluée en utilisant des molécules <5 nm, tels que le mannitol. Études de fuite paracellulaires indiquent donc la taille de l'ouverture de jonction de cellule, mais en raison de temps d'incubation longs ne peuvent pas identifier les perturbations transitoires de jonction cellulairetions.

Un autre mode d'évaluation de l'intégrité de la barrière est à l'image des jonctions serrées qui connectent des cellules adjacentes. Dans cette étude, nous immunocolorées occludine pour la microscopie de fluorescence, mais diverses autres protéines présentes dans la jonction étanche peut être utilisé pour cette analyse, y compris les protéines transmembranaires de la molécule jonction d'adhérence (JAM), claudine, et les familles occludines. Ici, nous avons coloré le domaine extracellulaire de contourner une étape de perméabilisation, encore des domaines intracellulaires peut aussi être colorées. Complémentaire à cela est l'utilisation des contrôles pour la coloration non spécifique, en utilisant des anticorps secondaires fluorescents seulement, absence de jonctions serrées (ici, nous avons utilisé des cellules d'une monocouche montrant bas TEER), ou la perturbation des jonctions serrées à l'aide des agents de jonction modulation énumérés ci-dessus.

Dans notre exemple du transport trans-épithélial nous utilisons CN ICAM-1 ciblée, mais le système de transwell accueille également le transport de l'autre formulation de véhicule de drogues, des composés thérapeutiques et diagnostiques, des composés innées trouvés dans le corps, ou une combinaison de ce qui précède, avec des implications de grande valeur pour des études cliniques ou compréhension des voies fondamentales. Les méthodes que nous décrivons à quantifier le transport à travers des monocouches de cellules impliquent l'étiquetage de radio-isotopes de l'agent de ciblage ou de la cargaison thérapeutique dans le manteau NC, mais cette stratégie peut également être utilisé pour suivre CN avec divers produits chimiques et de structures, y compris les polymères linéaires ou ramifiés, les dendrimères, les particules , des micelles, des liposomes, etc ^4,5,28,29. Différents isotopes (par exemple, ¹²⁵ I, ³ H, ³² P, etc) sont disponibles pour quantifier le transport d'un large éventail de petites et grosses molécules: non seulement les transporteurs de drogue, mais aussi thérapeutiques chimiques et biologiques, sans affecter l'intégrité structurelle ou fonctionnelle le composé, à la différence des marqueurs fluorescents encombrants. Le radiomarquage offre une plus grande sensibilité et la vitesse par rapport quantitatifà d'autres stratégies qui mesurent le transport, telles que l'électrophorèse sur gel, PCR, la spectrométrie de masse, HPLC et spectrométrie de fluorescence. Cette étiquette peut également être utilisé pour déterminer le degré de dégradation (par exemple, la protéine de l'agent de ciblage et de la cargaison dans notre exemple) en évaluant la teneur en iode libre, qui est rapide et précise par rapport à d'autres dosages de l'activité de la protéine, y compris spectrophotométrie UV et Western blot. Cependant, étant donné que l'iode libre ne reflète pas entièrement des altérations dans la conformation ou l'activité qui peut se produire en l'absence de dégradation des protéines, les méthodes de substitution ci-dessus peuvent être utilisés pour évaluer davantage l'intégrité des matériaux transportés. Aussi, lorsque l'administration de composés avec des radio-isotopes gratuits dans la chambre apicale, il est difficile de savoir si l'étiquette trouvée dans la monocouche cellulaire et fractions transportés résultent de réelle dégradation des protéines ou la diffusion de l'iode libre de l'espace apical. Pour contourner cette limitation, la concentration NC apicale peutêtre appliqué pendant un bref laps de temps pour permettre à l'association de la monocouche cellulaire, suivie de l'élimination du milieu apical en échange d'un milieu frais, et une période de chasse pour l'évaluation du transport. Bien qu'une quantité de radio-isotopes gratuits de la piscine originale peut d'abord s'infiltrer dans les autres fractions, cette valeur peut être déterminée à partir d'échantillons sans période de chasse et soustraite de conditions impliquant une période de chasse.

En termes d'évaluation du dispositif des transports, les mêmes méthodes décrites pour valider l'intégrité de la monocouche (TEER, des essais de fuite, et serré coloration de jonction) peuvent être utilisés pour évaluer la voie paracellulaire. Pour le transport transcellulaire, inhibiteurs pharmacologiques des déterminants impliqués dans le trafic intracellulaire (par exemple la transferrine associés à des voies de clathrine, la toxine cholérique B associée à des voies caveolar, etc) peut être utilisé, de sorte que les concentrations efficaces pour inhiber spécifiquement ces déterminants doivent to élucider pour chaque système. Alternatives aux inhibiteurs utilisés dans notre étude comprennent la chlorpromazine et de l'épuisement de potassium, spécifique pour la clathrine endocytose dépendante, et la génistéine et la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), spécifique pour caveolae médiée absorption ^30. D'autres stratégies qui peuvent éviter les effets non spécifiques potentielles d'inhibiteurs pharmacologiques impliquent la co-localisation de la cargaison transportée avec ces déterminants à l'aide de la fluorescence ou un marquage par radio-isotope, l'utilisation de ligands spécifiques en tant que témoins (par exemple, la transferrine ou la toxine cholérique B, comme indiqué ci-dessus), et de siRNA à knockdown de l'expression d'éléments de régulation de ces voies.

Dans cette étude, nous démontrons les équations de conversion de données de radioactivité à différents paramètres qui fournissent des informations préliminaires clé en matière de transport trans-épithélial. Par exemple, le degré de transport transépithélial est représenté par CN ou des molécules transportées par cellule, l'efficacité du transport de contenu qui se lie ou pénètre dans les cellules est représenté par le pourcentage de CN ou des molécules associées aux cellules transportées, et la vitesse de transport, qui permet de comparer la perméabilité entre les différents solutés, est signifié par P _app. Afin de comprendre le potentiel de CN ciblées pour la livraison à grande échelle des produits thérapeutiques (par exemple la dose nécessaire pour l'administration in vivo), ces équations peuvent être modifiées pour estimer les valeurs de transport à l'échelle macroscopique. Par exemple, la quantité thérapeutique d'une cargaison transportée par unité de surface de tissu intestinal (mg / cm ^2), ainsi que la distribution de potentiel à travers le tractus gastro-intestinal d'un patient peut être estimée à partir des équations suivantes,
Cargaison masse transportée / cm ² de tissu = (CPM _{basolatérale} / activité spécifique) / A
Cargaison masse transportée à travers l'intestin grêle = [(CPM _{basolatérale} / activité spécifique) × TA] / A

ve_content "> où l'activité spécifique représente l'unité, mesurée CPM / masse de la cargaison (voir le protocole, l'étape 3.1), et TA représente la surface totale d'absorption de l'intestin grêle (2000000 cm ^2). Par conséquent, les données issues de nos méthodes donne augmenter à un large éventail d'analyses possibles quantitatives qui décrivent le transport en termes pertinents.

L'avancement de plaquettes transwell, modèles qui reflètent mieux la complexité physiologique de transports comprennent des chambres "Ussing" et des dispositifs microfluidiques, qui fournissent l'écoulement de fluide dynamique et une chambre contenue qui minimise le contact avec l'air, comme dans les vaisseaux sanguins. Ces modèles permettent également d'explants de tissus à être cultivées ex vivo pour les études, avant la validation in vivo ^17,18.

En conclusion, les méthodes utilisées dans cette étude ont fourni des informations préliminaires utiles concernant le transport d'un système de délivrance de médicaments de modèle, en termes de véhicunce, à travers des monocouches de cellules. En utilisant ce modèle de culture cellulaire, nous avons démontré le potentiel de la plate-forme de nanocarrier ICAM-1 ciblée dans le cadre de l'administration de médicaments par voie orale, ouvrant la voie à des études ultérieures in vivo, mais peut être modifié pour d'autres systèmes nécessitant un transport à travers les barrières cellulaires trouvés dans la corps.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90