Summary
많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.
Abstract
서브 마이크로 미터 캐리어 (nanocarriers, 나노 결정은) 용해도, 안정성, 순환 시간, 타겟팅 및 방출을 개선하여 약물의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 몸에있는 세포 장벽을 통과하면 개입이 필요한 조직에 혈액 순환 및 전송에 치료 나노 결정의 모두 구두 전달을위한 중요합니다. 인접 셀, 또는 (ii) 상기 세포 횡단의 세포체를 통해 전송 자료는 엔도 시토 시스에 의해 내장되어 경로,,, 분비를 연동 접속점의 일시적인 중단을 통해, (I) 세포층 경로 : 세포 장벽에 걸쳐 NC 전송에 의해 달성된다 반대의 세포 표면 (transyctosis)에서. 세포 장벽에 걸쳐 배달 운송에 관련된 세포 표면 마커에 특이 적으로 결합 대상 에이전트와 치료 또는 사업자의 결합에 의해 촉진 될 수있다. 여기, 우리는 WHI 모델 세포 장벽에 걸쳐 범위와 NC 수송 메커니즘을 측정하는 방법을 제공합니다채널은 트랜스 웰 인서트에있는 다공성 막에 성장 위장의 단층 (GI) 상피 세포로 구성되어 있습니다. 투과성 장벽의 형성은 transepithelial 전기 저항 (티이), 제어 물질 transepithelial 수송, 타이트 접합부의 면역 염색을 측정함으로써 확인된다. 예로서, ~ 200 nm의 중합체 나노 결정은 치료화물을 운반하고 세포 표면 행렬식을 표적으로하는 항체로 코팅되어있는, 사용된다. 항체 또는 치료화물은 방사성 동위 원소 추적에 125 I로 표시되고, 표시된 나노 결정은 시간의 변화 기간 동안 세포 단일 층에 다락방에 추가됩니다. 내부 챔버로 이송 세포 및 / 또는 연결된 나노 결정은 검출 될 수있다. 무료 125 I의 측정 성능이 저하 된 분수의 뺄셈을 할 수 있습니다. 세포층 경로는 위에서 설명한 장벽 매개 변수에 NC 전송으로 인한 잠재적 인 변경을 결정함으로써 평가된다. 세포 횡단 수송 난엔도 시토 시스와 transcytosis 경로를 조절하는 효과를 주소에 의해 결정들.
Introduction
외부 환경과 내부 구획 사이의 게이트웨이 등 신체의 행위에 휴대 장벽. 이는 위장관 혈류 1-3의 외부 노출면을 분리하는 상피의 경우입니다. 세포 장벽은 혈액과 실질 및 조직과 장기의 세포 구성 요소 사이의 인터페이스를 나타낸다. 본문에 이러한 세포 장벽을 통과 할 수있는 능력이 치료 및 진단 요원의 효율적인 전달을 위해 매우 중요 하나 이는 등 혈액 폐 장벽, 혈액 - 뇌 장벽과 같은 혈관의 안쪽 내피 안감의 경우 개입이 필요한 순환 및 조직 / 기관에.
치료 또는 진단 요원의 전달을 향상시키기 위해, 이러한 화합물은 서브 마이크로 미터 nanocarriers (나노 결정)에로드 할 수 있습니다. 이러한 약물 전달 차량은 다양한 제형으로 할 수있다화학 물질 및 약물의 용해도, 보호, 약물 동력학, 릴리스 및 신진 대사 4,5을 최적화 구조. 나노 결정은 또한 치료 조치 2,6 필요한 신체의 영역에 접착을 촉진 또는 친 화성 (예, 항체 등, 펩티드 당, 앱 타머,) 잔기를 표적으로 작용 화 될 수있다. 세포 장벽의 표면에 발현 결정에 나노 결정의 대상으로하는 것은 더 2,6로 및 / 또는 이러한 라이닝에 걸쳐 전송을 용이하게 할 수있다.
선택적으로 두 환경 사이의 물질 수송의 역할은 세포의 층 사이에서 특정 고유의 기능을 필요로합니다. 충치의 루멘에 직면 정점 막 막 형태와 지질, 운송 및 수용체 2의 구성과 관련하여, 조직의 간질을 지향 기저 막에서 변화함으로써 하나의 기능은 세포의 극성입니다. 또 다른 특징은 세포 간 junctio을 포함인접한 셀을 연결 NS. 꽉 접합, 특히 접합부 접착 분자 (용지), occludins 및 claudins을 형성하는 단백질의 규제에 루멘에서 물질의 통과를 허용, 선택적 세포층의 전송로 알려진 세포 사이의 물질의 수송을 허용하거나하지 않도록 장벽 기능을 조절 기저 공간 3. 몸에있는 세포 장벽에 많은 천연 및 합성 요소 (백혈구, 분자, 입자 및 약물 전달 시스템)의 결합은, 그러므로,의 액세스와 안전하지 않은 과도 비교적 무해한 이상 연장하고 수있는, 세포 접합 개방을 유도 할 수있다 장벽 2,5,7-9에서 바람직하지 않은 물질. 결과적으로,이 통로가 transepithelial 전기 저항 (티이) 및 분자의 수동적 세포층 확산 (본원 불리는 세포층 누설)을 측정함으로써 평가 될 수있다 전류 또는 아민의 증가 세포층 누설 저항을 감소기저 공간으로 RT 화합물은 세포 접합의 개방을 나타내는 각각 5,10,11. 염색은 모든 세포 주변 5,10,12 주위 세포 셀 테두리에 집중 나타나는 위치를 이러한 방법을 보완하기 위해, 위에 나열된 꽉 접합 단백질의는 자신의 무결성을 평가하기 위해 염색 할 수 있습니다.
또한, 같은 방 clathrin 코팅 구덩이 또는 caveolae라고 플라스크 모양의 막 함입에 관련된 것과 같은 특정 세포 표면의 결정을 대상으로 약물 전달 시스템, 세포 내 구획 5에 약물 전달을위한 수단을 제공, 엔도 시토 시스에 의해 세포에 기공을 갖는 흡수를 게재 할 수 13. 또한, 엔도 시토 시스는 기저 측 릴리스 transyctosis로 알려진 현상, 또는 세포 횡단 수송 14 세포체에서 소포의 인신 매매로 이어질 수 있습니다. 따라서, 엔도 시토 시스의 반응 속도와 메커니즘의 지식은 세포 내를 악용 할 수있다차 세포층의 노선에 비해 배달 상대적으로 안전하고 제어 모드를 제공 세포 횡단 약물 전달. 엔도 시토 시스의 메커니즘 고전 경로 (방 clathrin 및 카베 올린 매개 엔도 시토 시스, 그리고 macropinocytosis) 또는 비 고전 노선의 변조기로 평가 될 수있다 (예 : 세포 접착 분자의 경우와 (CAM) - 매개 엔도 시토 시스) 5,13,15 .
세포 내 인신 매매는 종종 표준 우물 커버 슬립으로 연구되는 반면, 기저 구획의 부재는 세포 편광 셀 계층에서 전송을 연구 할 수있는 능력을 배제한다. 이 장애물을 극복하기 위해, 세포 단일 층에 걸쳐 전송 긴 트랜스 웰은 상부 (정점) 실, 세포 부착과 꽉 단일 층을 형성 다공질 투과 막으로 구성되는, 10,11,16,17를 삽입하고, 낮은 사용하여 연구되고있다 (기저) 챔버 (그림 1). 이 구성에서는, 전송은 측정 할 수있다정점 간 측저, 상부 챔버로 치료 투여 세포 단층 및 내부 다공성 막을 통해 전송을 다음, 마지막 반송물의 정량화를위한 하부 챔버에 매체를 수집하여 방향. 측저에서 첨단으로의 전송 방향은 상부 챔버 5,10,12,16로부터 하부 챔버 및 후속 컬렉션에 초기 투여에 의해 측정 될 수있다. 다양한 기술이 전술 한 바와 같이, 티이 및 세포층의 전송 분석법 등 트랜스 웰에 투과성 장벽의 형성을 확인하기 위하여 존재한다. 또, 세포가 배양되는 투과 필터 (형광 공 촛점, 전자 현미경에 의해 예) 영상 분석을 위해 제거 될 수 있고, 또한 세포 단층 모델의 검증뿐만 아니라 전송의 메커니즘. 다른 기공 크기, 재질 및 표면 영역에서 사용할 멤브레인 타입의 선택은, 다양한 사실상에 달려이러한 물질의 크기 또는 전송되는 개체, 세포 유형, 및 이미징 방법 16,18-20으로 RS. 트랜스 웰 인서트는 또한 챔버 및 세포 표면 영역의 양이 상수를 공지 된 바와 복잡한 포유류 시스템에 비해 전송 제어하고 정확한 정량을 용이하게한다. 생체 내 전달에 관련된 여러 가지 요소가 등 장 점액의 존재, 전단 응력, 소화 효소, 면역 세포를 포함하여, 제거하는 동안, 체외 모델이 작은 규모의 운송에 관한 유용한 사전 정보를 제공합니다.
휴대 장벽 10,11,16,17 통해 NC 전송을 공부하는이 방법의 적응을 설명하기 위해 예를 들어, 우리는 여기에 GI 상피에서 NC 전송의 가능성을 모델 약물 전달의 통로를 평가에 의해 모델링 된 경우를 설명 인간 상피 대장 선암 (된 Caco-2) 세포의 단일 층을 통해 시스템. 이러한 목적으로, C 들면ELL을 투명하고 현미경 이미징에 사용될 수있는 0.8 μm의 세공 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 필터 (6.4 mm 직경)에서, 트랜스 웰 인서트에서 배양 하였다. 투과성 장벽의 상태는 티이, 제어 물질, 알부민 및 단단한 접합부, occludin 단백질의 요소의 형광 현미경 시각화의 정점 간 측저 전송 측정에 의해 확인된다. 대상 폴리머 NC의 모델은 100 nm의, 생분해 폴리스티렌 나노 입자로 구성된 사용됩니다. 나노 결정은 표면 만 대상으로 항체 흡착 또는 표적 항체의 조합과 구성 요소 중 하나는 방사성 동위 원소 추적 125 I로 표시 할 수있는 치료화물에 의해 코팅된다. 선택된 예에서, 항체는 세포 간 부착을 분자 -1 (ICAM-1)을 인식하고, 단백질은 GI 상피의 표면에 발현 (및 기타), 세포 내 및 세포 횡단 수송 O를 용이하게하기 위해 도시 된 세포 F 약물 사업자와 그들의화물 21. 화물은 α-갈 락토시다 제 (α-GAL), 파브리 질환, 유전 리소좀 저장 장애 (22)의 치료에 사용되는 치료 효소이다.
크기가 약 200nm의 코팅 된 나노 결정은, 시간의 변화 기간의 세포 단일 층에 혀끝의 챔버에 첨가하고 37 ° C에서 배양 된 후 125 나노 결정에 나는 세포 단일 층 및 / 또는 관련된 검출 할 수있다 세포 아래의 기저 챔버로 이송. 무료 125 I의 추가 결정이 코팅 된 NC 전송의 성능이 저하 된 부분 및 추정의 뺄셈을 할 수 있습니다. 운송기구는 상기 세포 횡단 수송이 엔도 시토 시스와 transcytosis의 경로를 변조 할 때 전송의 변화를 검토하여 결정되는 동안, 상기 파라미터를 통해 세포층 경로에 속하는 투과성 장벽의 변화를 조사하여 평가한다.
"ontent> 이들 방법은 모두 세포 장벽을 가로 질러 약물 전달에 대한 가능성을 평가할 수 있도록, 귀중한 셀룰러 배리어 모델에 대한 정보, 약물 전달 시스템의 전송 범위 및 속도와 같은 전송 메커니즘을 제공한다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 없이 Transwell 삽입의 세포 단층 배양
- 멸균, 바이오 안전성 레벨 2 세포 배양 후드에서 0.8 mm 애완 동물은 집게로 (통계적 의미에 대해, 상태 당 4 우물) 24 - 웰 플레이트에 삽입 트랜스 웰 기공 놓습니다. 후드를 입력 모든 자료는 에탄올로 소독해야한다.
참고 : 필터의 기공 크기가 사용되는 NC의 평균 크기에 맞는 선택해야, 멤브레인을 가로 질러 수송 가능하도록. 또한, 통계적으로 유의 한 결과를 각각의 실험 조건은 동일한 실험을 반복 내의 넷 (웰)의 최소 및 세 독립적 인 실험의 최소 필요하다.
- 수조에서 37 ° C로 세포 배양 4.5 g / L 글루코오스, 15 % 소 태아 혈청, 1 % 스트렙토 펜 보충 된 DMEM 배지를 함유하는 매체와 열을 준비한다.
- 세포 매체와 장소에서 (된 Caco-2) 인간의 상피 세포 대장 선암을 희석/ cm 2 1.5 × 105 세포의 밀도로 트랜스 웰 인서트의 상부 (정점) 챔버 내로 세포 용액 200-400 μL. 세포 매체의 900 μL - 700 이하 (기저) 챔버를 입력합니다.
- 단계 1.3에 표시된 양을 사용하여, 모든 3~4일 상부 및 하부 챔버에 매체를 교체 37 °의 C, 5 % CO 2 및 16-21일 95 % 습도에서 배양 세포. 하부 챔버로부터 배지를 흡인 상부 챔버로부터 매체를 대기음, 신선한 매체와 함께 상부 챔버를 채울 수 있고, 하부 챔버와 채우기 : 세포 단층 (오히려 아래보다) 위의 압력을 유지하기 위해 다음과 같은 순서로 배지를 교체 신선한 매체.
2. 단단한 접속점의 GI 상피 투수 Transepithelial 전기 저항을 사용하여 배리어 (봉사자)과 면역 염색의 검증
- 단기 보관 (2 주 미만)의 경우, 전해질 솔루션에 STX100 전극 잠수함기 (0.1 ~ 0.15 M의 KCl 또는 염화나트륨). 시스템이 내부적으로 단락 전극 대칭이 유지되도록 EVOM 볼트 옴 미터의 전극 단자에 전극 케이블을 연결합니다. 장기 저장을 위해, dH보다 2 O 씻어 건조하고 어두운 상태로 저장합니다.
- , 전극을 살균 15 분 동안 에탄올에 담그고 15 초 동안 공기 건조하도록 허용합니다. 대안 적으로, 전극은 UV 후드에 저장 될 수있다. 각각의 저항을 측정하기 전에, 멸균 전해질 용액 (인산 완충 식염수, PBS) 또는 0.1 ~ 0.15 M의 KCl 또는 염화나트륨 용액에 전극을 씻어.
- 볼트 옴 미터는 저항 설정으로 설정 한 상태에서 수직 방향으로 상부 챔버의 짧은 전극과 우물의 바닥에 닿는 하부 챔버의 긴 전극과, 잘 트랜스 웰 인서트를 포함에 전극을 배치합니다. 각 웰에, EVOM 독서가 안정되면 (Ω 옴에 주어진)의 저항 값을 기록합니다.
- 저항 (점 용접을 계산CE는 지역에 정상화; Ω × cm 2) 배경 저항 세포없이 트랜스 웰 인서트 (봉사자)를 뺀 막 면적을 곱하여 샘플. 비저항 값은 주로 문헌에보고되어있다. (설명 참조)
- 봉사자는 일반적으로 세포를 땋는의 순간부터 2 ~ 3 주간 걸립니다 투과성 장벽의 형성을 나타내는 최대 및 고원에 상승 값까지 모든 1-2일 측정을 반복합니다. 고원 티이 값과 장벽의 무결성을 달성하기 위해 필요한 시간은 세포의 통과 수에 따라 다를 수 있습니다.
- 높은 티이 (장벽 형성을위한 임계 값 이상 동일)와 세포 단일 층에있는 단단한 접속점의 존재를 확인하기 위해 15 분 동안 차가운 2 % 파라 포름 알데히드와 배양 세포를 고정합니다. 그런 다음, 1 ㎍ / ㎖의 안티 occludin 실온에서 30 분 동안을 PBS로 세포를 씻어 품어. PBS로 다시 세포를 세척하고 7.5 ㎍ / ㎖의 F 실온에서 30 분 동안 그들을 품어luorescently 표지 된 이차 항체. 장벽 형성을위한 음성 대조군으로 낮은 봉사자와 우물을 사용합니다.
참고 : 안티 occludin 대신 대체 꽉 접합 단백질에 대한 항체를 사용할 수있다.
- 조심스럽게 고정 단층이 부착되어있는 필터 멤브레인을 절제하고, 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지에 대한 슬라이드에 탑재합니다.
3. 대상 사업자의 Transepithelial 전송을 평가
- 이전에 7 설명한 바와 같이, 125 I와 표적 항체 (이 예에서 ICAM-1에 대한 마우스 단일 클론 항체, 항-ICAM를) 레이블. 표지 항체의 항체에 125 I 내용을 결정하는 단백질 농도 및 감마 카운터를 추정하기 위해 브래드 포드 분석을 사용하여, 다음 분 (CPM) 당 카운트에서 특정 활동을 계산 / MG.
참고 : 특이성 제어하기 위해, 다시비 표적 코팅 된 나노 결정을 제조하는 데 사용되는 표지 마우스 IgG에 의해 절차 이탄. 치료화물의 수송을 연구하기 위해,이 예에서화물을 라벨 절차, 예를 들어, 알파 - 갈 락토시다 제 (α-갈)를 반복합니다. 대안 타겟팅 에이전트가 아닌 특정 제어 또는 치료화물을 위해 사용될 수있다. 다른 방법도 또한 화합물을 라벨과 표지 된 대응의 농도를 추정하기 위해 사용될 수있다.
- 몇 나노 결정의 표면에 항체 (예에서 항 ICAM)을 대상으로 표시. 이 예에서, 7 바와 같이, 표면 흡착을 허용하도록 125 I-항-ICAM 실온에서 1 시간 동안 폴리스티렌 나노 비드 (100 nm의 직경) 부화.
참고 :이 아닌 특정 제어 125 I-IgG의를 사용하십시오. 화물의 이동을 추적하기 위해 항체와 125 I-표지화물 (예에서 α-갈)를 대상의 조합을 사용합니다.
- 3 분 13,000 XG에 원심 분리기와 열망에 의해 상층 액의 비 코팅 상대를 제거합니다. 잠재적 인 입자 집계 (20 ~ 30 짧은 펄스를) 방해하는 낮은 전력에서 1 % 소 혈청 피펫으로 PBS에서 알부민 (BSA), 및 초음파 처리를 이용하여 코팅 된 나노 결정을 포함하는 펠렛을 Resuspend.
- NC 특성화, 크기, 분산도 및 동적 광산란 (벤더 지시에 따라)를 사용하여 코팅 된 입자의 ζ 전위를 측정하고, 수를 정량화 (125)를 사용하여 입자 표면에 항체 분자 (예, 항-ICAM)를 대상으로 I-표지 감마 카운터.
참고 :이 방법은 비특이적 및 치료의 대응에 대해 반복 할 수 있습니다. 코팅 된 입자의 크기는 200 나노 미터 주위에 배열한다.
- 티이 &와 합류 된 Caco-2 단층 위의 상부 챔버에, 125 I-항체 나노 결정 (56 NCI / ㎖ 예를 들어 125 I-항 ICAM 나노 결정을) 추가# 8805; 배경에 350 Ω × 센티미터 2 (토론 참조) (16-21일 후 파종). 하나 이상의 원하는 시간 간격으로 37 ° C에서 알을 품다. 투과성 장벽에 나노 결정의 효과를 평가하기 위해 배양 전후 티이 (2.3)를 측정한다.
참고 :이 절차는 비특이적 및 치료의 대응에 대해 반복 할 수 있습니다.
- 상부 및 하부 챔버에서 매체를 수집하고 37 ° C (다락방) 또는 1 ㎖ dH보다 2 O (하부 챔버)에 0.5 ㎖의 DMEM으로 그들을 한 번 씻는다. 감마 카운터를 사용하여 방사성 동위 원소의 총 함량의 측정을위한 세척을 모은다.
- 세포 분획의 측정의 경우, 가장자리가 절단, 세포를 측정하기 전에 10 분 (셀 내용 발매), 1 % 트리톤 X-100으로 감마 계수관에서 배양 면도날을 사용하여 예를 들어, 투과 필터를 절제 총 방사능 관련.
- 나는 다시 125을 측정하려면때문에 잠재적 인 성능 저하, 첫 번째 믹스 PBS에서 3 % BSA 700 μL, 200 μL 트리클로로 아세트산 (TCA)와 (, 상하, 또는 세포 분획) 샘플의 300 μL를 전송하는 동안 나노 결정 또는 임대. 15 분 동안 실온에서 배양한다. 한편 이번에는 감마 카운터에있는이 샘플의 총 방사능 량을 측정합니다.
- 성능이 저하 된 단백질 또는 125 I 분획 (상층)에서 그대로 단백질 (펠렛)을 분리하는 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 TCA 샘플. 무료 125 I 분획의 방사능의 양을 원심 분리하기 전에 측정 된 총 방사능에서이 값을 뺍니다. 이것은 분해되지 않은 표지 단백질의 양을 제공 할 것입니다.
4. 대상 Nanocarriers의 Transepithelial 전송의 메커니즘
- 라벨 이전에 3.1 절에 설명 된대로 내가 125 알부민 7을보고했다.
참고 : 알부민은 66.5입니다따라서 kDa의 단백질과, 상대적으로 큰 물질. 작은 약물 캐리어의 이동을 연구 할 때 더 큰 물체 (예를 들어 200 nm의 나노 결정이 여기에 사용)의 수동 수송에 유효한 제어, 그것은 (토론 참조) 작은 불활성 추적 분자로 대체해야하지만.
- 알부민 세포층 누설, 전술 한 바와 같이 트랜스 웰 인서트에 배양 된 Caco-2 단층을 사용하여 전송 세포층을 평가.
- 세포 단일 층 위의 상부 챔버 매체 (3.5 절에 설명 된대로) 125 I-알부민 형 (누설의 기초 수준을 보여주는 음성 대조군), 또는 125 I-알부민 및 비 방사성 표지 항체를 대상으로 나노 결정 하나를 추가 할 수 있습니다. NC 전송을 테스트 할 때 조사와 일치한다 선택한 시간 간격 (들), 37 ° C에서 알을 품다. 이전, 도중 티이 (2.3 절)을 측정 한 바와 같이 배양 한 후, 다음 총 125 I 무료 125 I 측정을위한 모든 분수를 수집. 제 3 주 : 125 I-알부민 및 비 방사성 동위 원소 제어 IGG 나노 결정의 병용 추가 컨트롤로 사용할 수 있습니다.
- 세포 간 접합을 열기위한 포지티브 대조군으로서, 세포 미디어 트랜스 웰 인서트의 상부 및 하부 챔버에 5 mM의 H 2 O 2를 함유하는 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 그런 다음, 티이 (2.3 절)을 측정하고 선택한 시간 간격에 대한 상부 챔버에 125 I-알부민을 추가합니다. H 2 접합 셀의 O 2에 의한 개방으로 인한 티이 값 붕괴를 확인하기 위해 배양에 걸쳐 다양한 시점에서 봉사자를 측정한다.
- 병렬 실험에서, 50 μM의 monodansylcadaverine 하나와 융합 된 Caco-2 단층 배양 125 I-대상 나토, 또한 transcytosis라고, 세포 횡단 수송을 평가 (MDC, 방 clathrin 매개 엔도 시토 시스의 억제), 1 ㎍ / ㎖의 filipin (caveolar의 억제제 - 매개 엔도 시토 시스), 0.5 μM의 WORTMANN소재, 또는 20 μM [5 - (N-에틸-N-이소 프로필) 아밀로 라이드 (포스파티딜 이노시톨 3 macropinocytosis 개인 키나아제 [PI3K]의 억제제) (macropinocytosis 및 CAM - 매개 엔도 시토 시스 (15)의 억제제 EIPA).
참고 : 125 I-IgG의 나노 결정 (125) 및 I-알부민 이러한 억제제의 효과에 대한 음성 대조군으로서 사용될 수 있고, 다른 방법 (예를 들어 siRNA의 기법)보다 선택적 억제를 제공 할 수있다.
- 단일 층의 투과성에 억제제의 효과에 대한 추가 제어로, 티이시 이전 (2.3 절) 및 억제제 및 방사성 동위 원소 표지 물질과 세포의 배양 후를 측정한다.
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Representative Results
대상으로 나노 결정의 transepithelial 전송을 공부하는 우리의 세포 모델의 검증으로, 그림 2는, 된 Caco-2 세포 단층이 합류 ~ 12 일째에 도달 1.5 × 10 5 세포 / ㎠의 밀도로 도금 일 18까지 단일 층의 무결성을 유지하고 있음을 보여줍니다 티이 (그림 2A)로 표시. 이 낮은 티이에서 가난한 꽉 접합 라벨 (17 Ω × 센티미터 2, 5 일에 비해 높은 티이 (390 Ω × 센티미터 2 일 14)와 단층에 occludin 양성 꽉 접합의 존재 (그림 2B)에 의해 확인되었다 ).
NC 요소에 방사성 라벨의 추적은 기저 측에 이송 처음 혀끝의 챔버에 추가 된 이러한 구성 요소의 총량 (NC 항체 또는화물을 대상으로), 자신의 휴대 관련된 부분, 그 부분을 결정한다. 이러한 값은 NC에 전송을 설명하는 다양한 매개 변수를 계산하기 위해 사용될 수있다더 중요한 방법으로, 특히 성능이 저하 된 대응을 나타내는 각 부분의 무료 125 I 내용의 감산 후. 예를 들어, 항체 분자,화물 분자 또는 횡 세포 단층 절대 전송을 추정하기 위해 계산 될 수있다 연관된 나노 결정의 개수. 또한, 세포 단층에 관련된 분자 또는 나노 결정의 총 개수에 대하여 측저 측으로 이송되고, 상기 분자 또는 나노 결정의 비율의 추정 효율을 수송했다. 마지막으로, 겉보기 투과 계수 (P 응용), 전송 속도에 대한 표준 파라미터가 추정 될 수있다. 그것은 다음과 같이 이러한 매개 변수는 계산된다 :
분자가 수송 또는 나노 결정은 = CPM 기저 × 수송 (분자 추가 또는 NC는 / CPM 추가 추가)
% 분자 또는 나노 결정은 = 100 × [CPM (/ 기저 CPM의 기저 + CPM 전송세포 분획)]
P 응용 프로그램 (CM / S) = (CPM 기저 × 권.) / (A × t × CPM 추가)
CPM이 125 I 카운트 분당 (CPM 첨가) 상부 챔버에 첨가되는 경우, 세포 단층 분획 (CPMcell 분율) 또는 하부 챔버 (CPM의 측저) 및 NC를 첨가하거나 첨가 분자는 나노 결정의 수있다 또는 초기에 상부 챔버에 첨가 분자는은 여과막의 표면적 (cm 2), 권이다. 상부 챔버 (ML)에있는 매체의 볼륨이고, t는 배양 시간 (초)입니다.
방사성 동위 원소는 표적 항체를 라벨 때 예에서,이 분석은 항체 또는 세포와 세포 단층 관련 항체 또는 이송 된 나노 결정의 비율 당 수송 나노 결정의 측면에서 정도와 교통의 효율성 (그림 3a 및 3b를 보여 ), 등 우리P 응용 프로그램 (그림 3D)의 측면에서 수송의 속도와 같은거야. 125 I-항 ICAM 나노 결정에 대한 우리의 예에서 추정 이러한 매개 변수는 역시 비 대상 대응 (그림 3C 및 3D)에 전송 효율 기준을 설명하기 위해 제어 125 I-IgG의 나노 결정의 것과 비교 하였다.
방사능 라벨은 NC화물에 도입 될 때, 설명 된 파라미터는 파브리 병 (표 1)로 알려진 유전 리소좀 저장 장애의 치료에 사용되는 예에서 α-갈 효소였다화물의 운송을 반영한다. 추적하여 NC 전송을 계산하는 것 외에도이 치료 효소의화물, transepithelial 배달 세포 당 수송 α-갈 분자 또는 대량으로 표현함으로써 예를 들어, 예상 할 수있다.
마지막으로,이 방법은 세포층의 경로하거나 전송 경로 속성세포 횡단 노선. MDC, filipin 및 인 wortmannin은 (제어 조건에 관해서는 어떠한 억제제를 전송 수준을 감소하지 않은 반면, 예를 들어, 우리의 예에서, EIPA이 된 Caco-2 세포 단층에 걸쳐 125 I-항 ICAM 나노 결정 (그림 4A)의 전송을 감소 ). 이것은 안티 ICAM 나노 결정이 세포 횡단 수송을 위해 CAM - 매개 엔도 시토 시스를 활용하는 것이 좋습니다,하지만 방 clathrin-,-caveolar, 또는 macropinocytosis 관련 transcytosis. 또한, 세포층의 전송은 봉사자의 감소 및 안티 ICAM 나노 결정의 운송 중에 하부 챔버에 알부민 세포층의 누출의 증가가있을 것있다, 티이 (그림 4B)의 측정 및 알부민 수동 전송 (그림 4C)를 사용하여 제외되었다 세포 간 접합의 지시 중단. 그러나, 안티 ICAM 나노 결정과 배양은 봉사자를 변경하거나 전송하지 않는 IgG의 나노 결정을 제어 할 유사한 48 시간의 기간 동안 125 I-알부민 세포층 누설하지 않았다. 으로접합 셀의 개방과 세포층의 전송에 대한 긍정적 인 제어, H 2 O 2는 기초 수준으로 봉사자를 감소 현저 기저 실 125 I-알부민 누설을 강화했다.
그림 1. 꽉 단층 (16-21일 후 파종, 봉사자에게 형성 될 때까지 위장 상피 세포 모델에서 대상 nanocarriers의 transepithelial 수송의 개략도. (A) transepithelial 전송을 연구하기위한 플랫폼으로 된 Caco-2 세포 단층 트랜스 웰 인서트에 배양 ≥ 350 배경 위에 Ω × 센티미터 2). 같은 125 I-항 ICAM 나노 결정으로 약물 전달 차량의 예는, 세포에 걸쳐 및 기본 다공성 막을 통해 전송을 연구하기 위해 세포 단일 층 위의 상부 (정점) 챔버에 추가됩니다.하단 (기저) 챔버의 매체는 그 다음 전송 된 자료의 정량화를 수집합니다. 세포 단일 층을 통해 (B) 교통 세포층 또는 세포 횡단 / transcytosis 경로 중 하나를 통해 발생합니다. Ghaffarian 등에서 재현., J.는 상대를 제어. 163 (1), 25-33 (2012). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 2. transepithelial 전송을위한 모델로 된 Caco-2 단층은. 된 Caco-2 세포를 1.5 × 10 5 세포 / cm 2에서 트랜스 웰 인서트에 성장했다. (A) Transepithelial 전기 저항 (티이)은 단층의 무결성을 평가하기 위하여 측정 하였다. 데이터는 ± SEM 의미로 표시되며, N = 3. (B꽉 접합) 형광 현미경) (높은 티이 값에 비해 낮은 각각 5 일 또는 14 일에, 반대로 occludin 텍사스 레드 라벨 차 항체와 immunolabeled. Ghaffarian 등에서 재현., J.는 상대를 제어. 163 (1), 25-33 (2012). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 3. 된 Caco-2 세포 단층에 걸쳐 안티 ICAM의 nanocarriers의 교통 수단은. 트랜스 웰 인서트에 성장 플루 된 Caco-2 단층은 125 I-항 ICAM 나노 결정 또는 125 I-IgG의 나노 결정이 혀끝의 챔버에 추가로 배양 하였다. 측저 챔버 (AC) (125)의 콘텐츠는 I를 NCS transp의 양을 계산하기 위해, 지시 된 시점에서 측정했다셀 당 orted (대표 결과 참조). 반송 나노 결정의 (B) 비율은 배합 측저 및 세포 분획에 해당하는 분획에서 발견 측저 담체의 비로서 계산 하였다. 대표 결과에 설명 된대로 (D) 명백한 투수 계수 (P 응용 프로그램)은 125 I-항 ICAM 나노 결정 또는 125 I-IgG의 나노 결정의 전송 속도를 반영하여 산출 하였다. 데이터는 ± SEM 의미로 표시되며, N = 4. Ghaffarian 등에서 재현., J.는 상대를 제어. 163 (1), 25-33 (2012). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 4. 의 전송 메커니즘된 Caco-2 단층에서 NTI-ICAM nanocarriers. (A) 융합 된 Caco-2 단층에 걸쳐 125 I-항 ICAM 나노 결정의 세포 횡단 수송이 20 μM EIPA의 부재 또는 존재에 24 시간에 평가 된, 1 ㎍ / ㎖의 filipin, 50 μM MDC, 0.5 μM의 인 wortmannin. (B) 봉사자는 세포층의 전송을 평가하기 위해, 된 Caco-2 단층에 걸쳐 125 I-항 ICAM 나노 결정의 운송 중에 측정 하였다. 나노 결정의 부재 티이 값은 컨트롤 (파선 간격이 평균값의 SEM을 표시한다)로 표시된다. 5 mM의 H 2 O 2 배양은 세포 간 접합의 개방에 대한 긍정적 인 컨트롤입니다. (C) 5 mM의 H 2 O 2, IgG의 나노 결정, 또는 항-ICAM 나노 결정의 부재 또는 존재하에 세포 단층을 횡단 125 I-알부민의 겉보기 투과 계수 (PAPP)로서 측정 세포층 단백질 누출은, 측정 된 그림 3에서와 같이 계산. 데이터 표시합니다N ± SEM 의미로, N ≥ 4. Ghaffarian 등에서 재현., J.는 상대를 제어. 163 (1), 25-33 (2012). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오
| 총 나노 결정 관련 / 세포 | 세포 내 나노 결정 / 세포 | 수송 나노 결정 / 세포 | % 수송 | 수송 α-갈 분자 / 셀 × 10 5 | PG 수송 / 셀 × 10 -3 | PAPP (× 10-8 cm / 초) | |
| 3 시간 | 663.4 ± 116.0 | 434.0 ± 76.8 | 243.6 ± 15.4 | 44.4 ± 6.7 | 1.8 ± 0.2 | 9.7 ± 1.2 | 8.1 ± 1.1 |
| 24 시간 | 2024.8 ± 409.3 | 1218.9 ± 255.6 | 806.9 ± 164.1 | 40.6 ± 2.0 | 3.9 ± 0.5 | 21.3 ± 2.5 | 1.9 ± 0.4 |
| 나노 결정 = nanocarriers, α-갈 = α-갈 락토시다 아제, 전체 나노 결정 관련 / 세포 = 세포 내 나노 결정 / 전지 + 나노 결정은 / 셀을 운반; % 수송 = 100 × (나노 결정은 / 전체 나노 결정 관련 수송), P 응용 프로그램 = 명백한 투수 계수 (cm / 초). 이러한 매개 변수의 추가로 설명하는 방법을 참조하십시오. (-TNF-α 된 Caco-2 세포) 데이터는 ± SEM (N = 8 우물을) 의미로 표시됩니다. | |||||||
표 1. 안티 ICAM의 nanocarriers에 의해 α-갈의 Transepithelial 전송 콘에서 안티 ICAM / 125 I-α-갈 나노 결정의. 세포 횡단 수송유창 된 Caco-2 단층은 3 시간과 24 시간에 평가되었다. 대표 결과에 설명 된대로, 정점 측저, 세포 분획의 방사성 동위 원소 함량은 전송과 관련된 다양한 값으로 변환 하였다. Ghaffarian 등에서 재현., J. (1), 25-33 (2012) 상대. 163 제어.
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Discussion
상기 논의 된 방법을 사용하여 세포 장벽에 걸쳐 표적 나토 수송을 연구 셀 모델은 이러한 경우의 혈액으로 GI 루멘으로부터 수송을 평가 관련된 된 Caco-2 상피 세포, 제공된 예로서 확립 될 수있다 경구 용 약물 전달 시스템의. 트랜스 웰 인서트의 GI 상피 세포 단일 층의 배양은 세포 투과성 장벽의 형성을 확인하는 봉사자의 측정 꽉 접합의 형광 면역 염색을 가능하게했다. 그 후, 125로 타겟팅 및 치료제의 방사성 표지 나는 세포 단일 층에와 GI에 걸쳐 대상으로 나노 결정의 신속하고 민감한 정량을 제공했다. 마지막으로, 기계 론적 연구는 수송은 세포층의 경로 대 기공을 갖는 경로를 통해 발생하는지 여부를 평가하기 위해 세포 내 이입 억제제, 봉사자, 그리고 알부민 세포층의 누출 분석을 사용하여 적용 하였다.
유사한 모델을 구축하는 데 중요한 매개 변수 나연구중인 세포 장벽의 생리적 특성을 반영해야한다 세포 유형의 선택. 사람 또는 동물 유래의 다양한 상피 세포와 내피 세포는 16,18-20 상업적으로 사용할 수 있습니다. 여기에서 설명한 바와 같이 이들은 단독 번의 배양으로서 성장 될 수도 있고, 다른 세포 유형과 이들 세포와 같은 공동 배양 16,18-20 (예를 들면 세포, 면역 세포, 혈관 주위 세포 등 점액 분비). 이러한 공동 문화의 형태, 트랜스 웰 삽입 조건은 세포 미디어 16,18-20의 차별화 요소에 대한 각각의 성장률과 요구 사항을 조정하는 변조 할 수 있습니다. 예를 들어, 혈액 - 뇌 장벽 모델은 다공성 필터의 대향면에 뇌 미세 혈관 내피 세포와 성상 세포 또는 혈관 주위 세포의 공동 배양을 수반 할 수 있으며, 각 세포 유형에 대한 각 미디어는 각 챔버 (19)에 배치되어야한다. 또한, 세포주에 따라, 세포 외 기질 성분이 될 수있다 REQ다공성 막 18 ~ 20에 효과적인 세포 부착에 대한 uired. 그것은 각각의 특정 모델은 따라서 값을 얻을 이러한 방법이 각 상황에 맞게 최적화 할 필요가 제어, 침투성 장벽 매개 변수 및 전송 속도와 메커니즘에 관해서는 다른 기초 수준을 렌더링하는 것을 고려하는 것이 중요합니다.
이러한 여기에 설명 된 것과 같은 트랜스 웰 인서트는, 널리 혀끝에서 기저 구획으로 또는 그 반대의 경우도 마찬가지 5,10-12,16,17, 세포 단일 층에 걸쳐 물질의 이동을 연구하는 데 사용되었습니다. 그들은 두 개의 독립적 인 구획을 제공하지 않습니다 따라서 셀 정렬의 사실적인 뷰를 제공하지 않을 수 있으므로 이러한 시스템은 교통이 양식을 배제하기 때문에 고전 우물의 coverslips에 세포를 배양하여 달성 될 수 없다. 예를 들어, 자연스럽게 기저 막에서 출시 될 운명 재료는 어려운 RESO로 쉽게, 커버 슬립 모델에서 다른 세포 구획에 비켜 가게 할 수있다세포 횡단 수송의 메커니즘을 LVE. 또한, 커버 슬립 달리, 트랜스 웰의 구성은 세포 분화 및 멤브레인 극성 10,11,16-19와 연관된 생리 학적 관련 기능을 발생시킨다. 예를 들어, 트랜스 웰 상에 성장 된 Caco-2 세포는 미세 융모의 존재와 타이트 접합, 돔을 형성하고, 브러시 테두리 10,11,17 효소의 생산을 포함하여 성숙한 장 세포의 특성을 나타낸다. 다른 파라미터는 GI 상피 세포 교반을 사용하여 트랜스 웰에인가 또는 열 펌프 될 수있다 (예, 점액 흐름 및 수축 운동) 및 혈관 내피 세포 (예를 들어 혈류)의 경우에는 전단 응력 등의 추가 생리학 관련 표현형을 유도 할 , 16, 공동 문화 특정 세포 유형 16,18-20에 필요한 성장과 분화 인자를 생산. 그럼에도 불구하고, 하나의 세포주는 종종 이메일, 신체 조직 세포 다르다는 것을 고려해야. g. 서로 다른 수준에서 어떤 결정을 표현하고, 따라서, 현재의 다양한 기능 및 규정 할 수 있습니다. 예를 들어, 된 Caco-2 세포는 CYP3A4, 약물 대사 효소 10,17,23 등 생체 내에서 구강 치료의 활성화 및 전송에 필요한 모든 수송 단백질과 효소가 포함되어 있지 않습니다. 더 생리적 조건 17,23,24을 반사 시키 이러한 경우, 세포주 서브 클론, 형질 감염, 또는 전사 제의 첨가는 세포주를 변조 사용될 수있다.
트랜스 웰 최적의 모델을 선택함에있어서, 투과성 필터의 다양한 특징은 고려되어야한다. 투과 필터는 다른 기공 크기에서 사용할 수있는 0.4-8 μm의에 이르기까지, 그리고 수송화물의 크기를 수용해야합니다. 모공 3 μm의 이상이 세포 침윤, 체에 사용하는 동안 예를 들어, 작은 기공 크기 (0.4-3 μm의)는 일반적으로, 작은 화합물의 전송의 연구에 사용되는motaxis 및 운동성 연구하는 미생물에서, 면역 및 마이그레이션 세포 수송된다. 일부 세포는 단층 형성을 배제, 파종시 세공을 마이그레이션 있으므로 공극 크기 및 밀도는, 셀 밀도 및 분화에 영향을 미친다. 또, 투과성 세포 생존 및 단층 형성의 평가를위한 지원 영향 촬상 선명도, 및 세포 부착의 소재. 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 필터는 대조적 위상차 현미경 하에서 시인성, 폴리 카보네이트 필터를 반투명 있도록 투명하다. 강화 된 세포 부착의 경우, 콜라겐 또는 피브로넥틴과 프리 코트 투과 지원은 상업적으로 사용할 수 있습니다. (예를 들면 6 - 웰 플레이트에있는) 큰 직경이 세포 단층의 세포층 leakiness을 증가시키는 경향이있다 또한, 다른 웰 플레이트에 대해 조정되는 필터 지름은, 투과성에 영향을 미칠 수있다.
트랜스 웰 모델 appropria 포함한 확립되면세포 유형, 미디어 조성물 및 투과성 필터의 TE 선택은, 세포 단일 층의 상태는 티이을 사용 배양 실험 단계에서 평가 될 수있다. 2) 배양 조건, 예컨대 상기 트랜스 웰 특성, 파종 밀도, 문화, 미디어 조성물 및 pH의 일 등], 3) 물리적 요인 그러나 티이 값은 세포 유형, 소스 및 통로 번호와 연관된 일) 타고난 생물학적 요인에 따라 달라질 , 온도 등, 매체 볼륨, 샘플링 스케줄, 교반 / 세탁 정도, 4) 셀 접합부의 무결성 (예, 사이토 카인, 면역 세포, 산화 스트레스, 약학 첨가제 등)를 열 조절 병리학 및 / 또는 화학적 요인 16, 17. 때문에 티이, 장벽 형성이 정기적으로 배양 기간 동안 실험 조작 후 봉사자를 모니터링하여 각 시스템을 설정해야합니다 나타내는 최소 기준 값에 영향을 미치는 다양한 생물과 환경 요인에. 버지니아150-1,600 Ω × 센티미터 2 (16) 사이의 범위 장벽 형성에 적합하다고 판단되는 매독은 또한 전송 될 수있는 물질의 크기에 따라 그 물질의 수동 세포층의 확산이 제한되도록, 봉사자 ≥ 350 Ω × 동안 cm 2는 여기에 (200 NM)에 나타나는 것과 같은 비교적 큰 나노 결정의 수동적 인 확산을 방해하는 것, 이것은 엄격한 단일 층 (예 : ≥ 700 Ω × 센티미터 2) 요구되는 작은 약물 전달 시스템의 경우하지 않을 수 있습니다. 이 초기 값은 H 2 O 2, 펩티드를 관통 칼슘 킬레이트 제 (예 EDTA), 단백질 키나제 및 포스파타제, 및 기타 다양한 규제 분자 25-27 포함한 침투성 장벽을 방해위한 컨트롤을 사용하여 평가 될 수있다.
봉사자을 보완, 많은 투수 분석은 단일 층의 무결성을 확인하고 세포층의 견인을 평가하기 위해 존재RT. 알부민과 같은, 이러한 측정 알려진 투과성 비율 (P 응용 프로그램)을 비교하는 형광 UV, 또는 방사성 라벨과 함께 할 수있는 만니톨, 루시퍼 노란색, 이눌린 및 덱스 트란, 다양한 크기의 다른 막 투과성 추적 분자, 이러한 용질의 값. 세포층의 전송을 평가할 때, 연구중인 수송 화합물보다 작은 트레이서 분자를 사용하는 것이 중요하다. 예를 들어, 200 나노 입자의 세포층의 교통은 우리의 예에서 사용 된 알부민 등의 작은, 그러나 아직도 비교적 큰 분자의 세포층의 누출을 일으킬 정도로 세포 간 접합을 열 것입니다. 반대로, 그러한 덴드리머 (5 ~ NM)로서 작은 약물 전달 차량의 세포층의 수송은 만니톨과 같은 분자 <5 nm의를 사용하여 평가하여야한다. 세포층 누설 연구 따라서 세포 접합 개구의 크기를 나타내는, 아무런 인해 긴 배양 시간에 그들은 셀 접합부의 일시적인 중단을 식별 할 수없는tions.
장벽의 무결성을 평가하는 또 다른 모드는 이미지에 인접한 셀을 연결하는 단단한 접합입니다. 이 연구에서, 우리는 형광 현미경에 occludin를 면역 염색, 아직 꽉 접합에 존재하는 다양한 단백질 접합 접착 분자 (JAM), claudin 및 occludin 가족의 횡단 단백질을 포함하여,이 분석에 사용할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 permeabilization 단계를 우회하는 세포 외 도메인 스테인드, 아직 세포 내 도메인은 염색 될 수있다. 이것에 부가 아닌 특정 얼룩에 대한 컨트롤의 사용, 형광 차 항체 만, 꽉 접합 부재 (여기에서, 우리는 낮은 봉사자를 나타내는 단일 층으로 세포를 사용), 또는 꽉 접합의 중단 나열된 접합 조절제를 사용하여 사용입니다 위.
transepithelial 전송의 예에서 우리는 ICAM-1 표적 나노 결정을 사용하지만, 트랜스 웰 시스템은 또한 다른 약물 차량 제형의 전송을 수용S, 치료 및 진단 화합물, 임상 연구 또는 경로의 기본적인 이해를위한 가치있는 의미있는 바디, 또는 상기의 조합에서 발견 타고난 화합물. 우리는 세포 단일 층에 걸쳐 전송을 정량화 설명하는 방법은 NC 코트에서 대상 에이전트 또는 치료화물의 방사성 동위 원소 표지를 포함, 아직이 전략은 선형 또는 분 지형 고분자 등 다양한 화학 및 구조, 덴드리머, 입자와 나노 결정을 추적하는 데 사용할 수 있습니다 , 미셀, 리포좀 등 4,5,28,29. 의 기능적 또는 구조적 완전성에 영향을 미치지 않고, 약물 담체뿐만 아니라 화학적 및 생물학적 치료제뿐만 아니라 : 다른 동위 원소 (예 : 125 I, 3 H, 32 P, 등)의 크고 작은 분자의 넓은 범위의 전송을 정량화 할 수있다 부피가 큰 형광 라벨과 달리 화합물. 방사성 표지 비교보다 정량적 감도와 속도를 제공합니다예컨대 겔 전기 영동, PCR, 질량 분광법, HPLC, 형광 분광법 등의 수송을 측정 다른 전략에 관한 것이다. 이 레이블은 또한 UV 분광 광도법과 웨스턴 블롯을 포함하여 다른 단백질 활성 분석에 비해 빠르고 정확한 무료 요오드의 내용을 평가하여 성능 저하의 정도 (예에서 예를 들면 단백질을 표적으로 에이전트 및화물)을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 자유 요오드 통째로 단백질 입체 구조 또는 변형의 부재에 발생할 수있는 활성 변화를 반영하지 않기 때문에 그러나, 상기 대안적인 방법은 또한 수송 재료의 무결성을 평가하기 위해 사용될 수있다. 혀끝의 챔버에 무료로 방사성 동위 원소와 화합물을 관리 할 때 또한, 그것은 세포 단일 층 및 수송 분수에서 발견 된 라벨이 실제 단백질 분해 또는 혀끝 공간에서 무료로 요오드의 확산의 결과인지 불분명하다. 이 제한을 회피하기 위해, 정점 NC의 농도는 할 수있다새로운 배지와 교환 혀끝 매체 제거 뒤에 세포 단층, 및 전송을 평가하기위한 추적 기간에 연관을 허용하는 짧은 시간 간격 동안 적용. 일본어 풀에서 자유 방사성 동위 원소의 양을 처음에 다른 분획으로 누출 될 수 있지만,이 값은 제공된 추적 기간 샘플로부터 결정 및 추적 기간을 포함한 조건으로부터 감산 될 수있다.
운송 메커니즘을 평가의 측면에서, 동일한 방법 (티이, 누설 분석법 및 타이트 접합 얼룩이) 세포층 라우트를 평가할 수있다 단층의 무결성을 검증하는 바와. 세포 횡단 수송을 위해, 세포 내 인신 매매에 관련된 결정의 약물 억제제 (예 : 트랜스페린 방 clathrin 경로에 관련, caveolar 경로 등에 관련된 콜레라 독소 B)를 사용할 수있다 구체적으로 그 결정 요인을 억제하는 효과적인 농도는 t이 필요합니다O 각 시스템에 대해 해명 될 수있다. 우리의 연구에 사용 된 저해제에 대한 대안은 caveolae 매개로 흡수 (30)에 대해 특정 클로르 프로 마진, 칼륨 고갈, 방 clathrin 의존 엔도 시토 시스에 대한 특정하고, 제니스테인 및 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD)를 포함한다. 약물 억제제의 잠재적 인 비 특정 효과를 피할 수있는 다른 전략은 형광 또는 방사성 동위 원소 표지, 컨트롤과 같은 특정 리간드의 활용 (예를 들어, 트랜스페린 또는 콜레라 독소 B, 위에 표시된대로)를 사용하여 이러한 결정과 수송화물의 공동 현지화 및 siRNA를 참여 이러한 경로의 조절 인자의 발현을 녹다운하기.
이 연구에서, 우리는 transepithelial 전송에 관한 주요 예비 정보를 제공하는 다양한 매개 변수에 방사능 데이터를 변환하기위한 방정식을 보여줍니다. 예를 들어, transepithelial 수송의 정도는, 나노 결정 또는 셀 당 수송 분자로 표시된다 세포를 결합하거나 입력 내용을 전송의 효율을 운반 세포 관련 나노 결정 또는 분자의 비율로 표시하고, 다른 용질 사이의 투과성의 비교를 허용 전송 속도는, P 응용 프로그램에 의해 의미합니다. 치료제의 대형 우편 (예, 생체 내 투여를 위해 필요한 투여 량) 대상 나노 결정의 전위를 이해하기 위해서는, 이러한 방정식은 거시적 규모에 전송 된 값을 추정하기 위해 수정 될 수있다. 예를 들어, 단위 표면 장 조직의 에리어 (㎎ / cm 2)뿐만 아니라, 환자의 위장관에 걸쳐 전위 대금 당 이송 치료화물의 양이, 다음의 방정식으로부터 추정 될 수있다
대량화물 수송 / ㎠ 조직 = (CPM의 기저 / 특정 활동) / A
소장 = [(CPM의 기저 / 특정 활동) × TA] / A를 통해 전송 대량화물
트랜스 웰 인서트에서 발전, 더 나은 교통의 생리 학적 복잡성을 반영하는 모델은 역동적 인 유체의 흐름과 혈관으로, 공기와의 접촉을 최소화 포함 된 챔버를 제공한다 "Ussing"챔버와 마이크로 유체 장치를 포함한다. 이 모델은 또한 조직 절편 전에 생체 (17, 18)에있는 유효성 검사 생체 연구, 배양 할 수 있습니다.
결론적으로, 본 연구에 사용 된 방법은 efficie 측면에서, 모델 약물 전달 시스템의 전송에 관한 유용한 예비 정보를 제공했고NCY, 세포 단일 층에 걸쳐. 우리는 이후의 생체 내 연구를위한 방법을 포장, 경구 약물 전달의 맥락에서 ICAM-1 타겟팅 nanocarrier 플랫폼의 가능성을 입증 아직 발견 세포 장벽을 가로 질러 수송을 필요로하는 다른 시스템에 대해 수정 될 수도 세포 배양 모델을 사용 몸.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) RG, 그리고 건강 (그랜트 R01 - HL98416)의 국립 연구소와 미국 심장 협회 (American Heart Association, 그랜트 09BGIA2450014)가 SM에게 수여 자금의 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
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