De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van verschillende populaties van spermatogenese cellen op basis van grootte en dichtheid.
Zoogdieren spermatogenese is een complex differentiatie proces dat plaatsvindt in verschillende stadia in de testes van de testes. Momenteel is er geen betrouwbare celkweeksysteem waardoor spermatogene differentiatie in vitro, en de meeste biologische studies van spermatogene cellen vereisen weefsel oogst uit dierlijke modellen zoals de muis en rat. Omdat de testis bevat een groot aantal celtypen – zowel niet-spermatogene (Leydig, Sertoli, myeloïde en epitheelcellen) en spermatogene (spermatogonia, spermatocyten, ronde spermatiden, condenseren spermatiden en spermatozoa) – studies van de biologische mechanismen die betrokken zijn bij de spermatogenese vereisen de isolatie en verrijking van deze verschillende celtypes. De STA-PUT methode zorgt voor de scheiding van een heterogene populatie van cellen – in dit geval, de testes – via een lineaire gradiënt BSA. Individuele celtypen sediment met verschillende sedimentatiesnelheid volgens cell grootte en fracties verrijkt verschillende celtypen kunnen worden verzameld en gebruikt in verdere analyses. Terwijl de STA-PUT methode niet leidt tot zeer zuivere fracties celtypes, bijvoorbeeld verkregen kunnen worden met bepaalde celsorteringsmethoden, verstrekt het een veel hogere opbrengst van de totale cellen in elke fractie
(~ 1 x 10 8 cellen / spermatogenese celtype uit een uitgangspopulatie van 7-8 x 10 8 cellen). Deze high yield methode vereist alleen gespecialiseerd glaswerk en kan worden uitgevoerd in een koude kamer of grote koelkast, waardoor het een ideale methode voor laboratoria die beperkte toegang tot gespecialiseerde apparatuur zoals een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder (FACS) of afslibinrichting hebben.
Zoogdieren spermatogenese is een complex proces dat differentiatie in verschillende stadia van de testes van de testes 1. In het kort, stam-achtige spermatogonia dat wonen in de buurt van het epitheel van de seminiferous verdeel en differentiëren in spermatocyten, die vervolgens ondergaan meiotische delingen. Nadat meiose is voltooid, de resulterende haploïde cellen of ronde spermatiden ondergaan spermiogenese een differentiatieproces dat het afstoten van cytoplasma en verdichting van de kern omvat. Spermatiden geleidelijk een flagellum en ondergaan rek en condensatie van de kern, het produceren verlengen en vervolgens condenseren spermatiden, respectievelijk. De eindproducten spermatozoa, die vrijkomen in het lumen van de seminiferous en uiteindelijk in de bijbal, waar ze verder rijpen.
Omdat het proces van spermatogenese steunt op speciale hormonale en moleculaire omstandigheden inde testes, een betrouwbare in vitro kweeksysteem voor het gehele proces van spermatogenese nog niet ontwikkeld 2,3. Cultuur methoden ontwikkeld voor het creëren "primordiale kiemcel-achtige cellen" en haploïde, "rond spermatide-achtige cellen" van stamcellen, maar deze methoden zijn nog niet in staat om grote aantallen van deze cellen te genereren en niet later spermatogenese cellen produceren types 4,5. Gelukkig is de spermatogenese celtypen sterk verschillen in omvang, waardoor voor een enkele-celsuspensie verkregen uit geheel testes met een gradiënt vloeistof te scheiden. De STA-PUT methode, hier aangetoond, maakt gebruik van een lineaire gradiënt BSA en eenvoudig sedimentatie te spermatogene cellen te scheiden op basis van grootte en massa 6-9.
De STA-PUT methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van de andere twee meest gebruikte methoden om spermatogene celtypes scheiden: FACS en elutriatie 10-13. De STA-PUT apparaat vereist only verschillende stukken van gespecialiseerde glaswerk geassembleerd in een koude kamer of grote koelkast. Zo is goedkoper dan het gebruik van een cel sorteerder of een afslibinrichting. De STA-PUT methode levert grotere hoeveelheden cellen per celtype en testis dan kan worden gesorteerd door FACS op een vergelijkbare tijdsspanne, hoewel de zuiverheid van elke celpopulatie is niet zo hoog als die verkregen met FACS 11. Celsortering gebruik magnetische korrels (magnetisch geactiveerde celsortering, MACS) is recent ook succesvol toegepast voor verrijking spermatogonia uit een gemengde testicular celpopulatie, maar het is nog niet geschikt voor het scheiden spermatocyten of spermatiden door gebrek aan kennis van geschikte oppervlakte-markers 14. Een bijkomend voordeel van de STA-PUT methode via FACS of MACS is de mogelijkheid om levende cellen voor verdere kweek isoleren omdat in tegenstelling tot de meeste FACS protocollen, het geen DNA of andere vormen van vlekken vereisen. Voor studies die ik nodigarge opbrengsten van spermatogene cellen vormen op ~ 90% zuiverheid, de STA-PUT is een ideale methode.
Degenen die spermatogenese studeren vertrouwen op dierlijke modellen voor spermatogene cel monsters, als een betrouwbare celcultuur systeem bestaat nog niet voor het genereren van alle spermatogene celtypen 3. Hoewel spermatogene cellen gemakkelijk worden verzameld uit heel testes, maar een gemengde bevolking leidt. Dit vormt een probleem voor degenen die wensen om specifieke subtypes van deze cellen, zoals cellen in de meiose, ronde spermatiden en condenseren spermatiden bestuderen. Drie verschillende method…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door NIH subsidie GM055360 aan SLB en U54HD068157 te RGM. JMB werd gesteund door de T32 Genetics Training Grant aan de Universiteit van Pennsylvania (GM008216).
BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
DAPI | Preference of researcher | ||
Triton-X100 | Preference of researcher | ||
Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
TABLE 2: EQUIPMENT | |||
Equipment | Company | Catalog # | Comments |
Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
Need approximately 100 tubes | |||
Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |