Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Separation av spermatogenesisk celltyper med STA-PUT Velocity Sedimente

doi: 10.3791/50648 Published: October 9, 2013

Summary

STA-PUT metod möjliggör för separation av olika populationer av spermatogeniska celler baserat på storlek och täthet.

Abstract

Däggdjurs spermatogenesen är en komplex differentiering process som sker i flera steg i sädeskanalerna i testiklarna. För närvarande finns det inga tillförlitliga cellodlingssystem möjliggör spermatogenesisk differentiering in vitro, och de flesta biologiska studier av spermatogenescykler celler kräver vävnad skörd från djurmodeller såsom mus och råtta. Eftersom testiklarna innehåller många celltyper - både icke-spermatogenesisk (Leydig, Sertoli, myeloid och epitelceller) och spermatogenescykler (spermatogonier, spermatocyter, runda spermatider, kondensespermatider och spermier) - studier av de biologiska mekanismer som är inblandade i spermatogenes kräver isolering och anrikning av dessa olika celltyper. STA-PUT metod möjliggör för separation av en heterogen population av celler - i detta fall, från testiklarna - genom en linjär BSA-gradient. Individuella celltyper sediment med olika sedimenteringshastighet enligt cell storlek och fraktioner anrikade med avseende på olika celltyper som kan samlas in och användas i vidare analyser. Medan STA-PUT metod inte resulterar i mycket rena fraktioner av celltyper, t.ex. som kan erhållas med vissa cellsorteringsmetoder, men det ger ett mycket högre utbyte av totala celler i varje fraktion
(~ 1 x 10 8 celler / spermatogenesisk celltyp från en start befolkning på 7-8 x 10 8 celler). Denna höga avkastning metoden kräver endast specialiserade glas och kan utföras i något kylrum eller stort kylskåp, vilket gör det till en idealisk metod för labb som har begränsad tillgång till specialutrustning som en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) eller elutriatorn.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Däggdjurs spermatogenesen är en komplex differentiering process som sker i flera steg i sädeskanalerna i testiklarna 1. Kortfattat, stem-like spermatogonier att uppe nära epitelet sädeskanalens tubulus klyftan och differentiera till spermatocyter, vilka sedan genomgår meiotiska delningar. Efter meios är klar, de resulterande haploida celler, eller runda spermatider, genomgår spermiogenesen, en differentieringsprocess som involverar avgivande av cytoplasman och kompaktering av kärnan. Spermatider successivt utveckla en flagellum och genomgå töjning och kondensering av kärnan, som producerar förlängning och sedan kondensespermatider, respektive. Slutprodukterna är spermatozoer, som släpps in i lumen sädeskanalens tubulus och slutligen in epididymis där de mognar ytterligare.

Eftersom processen av spermatogenesen är beroende av speciella hormonella och molekylära förhållanden itestiklarna, en pålitlig odling in vitro-system för hela processen av spermatogenes har ännu inte utvecklats 2,3. Odlingsmetoder har utvecklats för att skapa "primordial könscellsliknande celler" och haploida, "runda spermatid-liknande celler" från stamceller, men dessa metoder är ännu inte kan generera stort antal av dessa celler och misslyckas med att producera senare spermatogenesisk cell typer 4,5. Lyckligtvis spermatogenescykler celltyper skiljer sig avsevärt i storlek, vilket gör det möjligt för en encelliga fjädring erhållits från hela testiklarna att separeras med en vätska lutning. STA-PUT-metod, visade här, använder en linjär BSA-gradient och enkel sedimentering för att separera spermatogeniska celler baserat på storlek och massa 6-9.

STA-PUT metod har flera fördelar jämfört med de andra två mest använda metoderna för att åtskilja spermatogeniska celltyper: FACS och elutriation 10-13. STA-PUT apparat kräver only flera stycken av specialiserade glas monterat i ett kallt rum eller stort kylskåp. Sålunda är det billigare än att använda en cellsorterare eller en elutriatorn. STA-PUT metod ger större mängder av celler per celltyp och testis än kan sorteras genom FACS i en jämförbar tidsram, även om renheten hos varje cellpopulation är inte lika höga som de som erhölls med FACS-11. Cellsortering utnyttjar magnetiska kulor (magnetisk aktiverad cellsortering, MACS) har nyligen framgångsrikt använts för anrikning av spermatogonier från en blandad testikelcellpopulation, men det är för tillfället olämpligt för att separera spermatocyter eller spermatider på grund av bristande kunskap om lämplig yta markörer 14. En ytterligare fördel med STA-PUT-metod under FACS eller MACS är förmågan att isolera livsdugliga celler som är lämpliga för efterföljande kultur, eftersom det i motsats till de flesta FACS-protokoll, behöver den inte någon DNA-eller andra typer av färgning. För studier som kräver lArge avkastning av spermatogenescykler celltyper vid ~ 90% renhet, är det STA-PUT en idealisk metod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

STA-PUT-protokollet omfattar tre steg: 1) Ställ in i apparaten och reagenser, 2) Beredning av cellsuspension från hela testiklar, och 3) Cell lastning, sedimentering, och bråk samling. När utförs av ett team av två forskare, tar det protokoll åtta timmar i genomsnitt.

1. Inställning av STA-PUT Apparat (figur 1)

*** STA-PUT apparat bör placeras i ett 4 ° C stort kylskåp eller ett kallt rum som även rymmer en fraktionssamlare, om denna metod för insamling är att föredra.

  1. Kvällen innan (eller åtminstone ett par timmar innan) du utför metoden, tvätta all utrustning (speciellt glas och slangar) och sterilisera med 70% etanol. Låt utrustningen torka helt innan montering av apparaten som illustreras i figur 1.
  2. Säkra de två 2 L cylindrar (figurerna 1B och C) och cellladdningskammaren (
  3. Placera en liten omrörarstav i cellen laddningskammaren (Figur 1A) och en större omrörarstav i den vänstra 2 L cylinder (Figur 1B) som ska innehålla 2% BSA.
  4. Placera 2 L sedimenteringskammare på plattformen (figur 1D). Placera metall baffel (figur 1F) direkt ovanpå öppningen i botten av sedimenteringskammare (figur 1D). Detta är kritiskt, eftersom baffeln förhindrar virvelbildning av vätskan och upplösning av cell gradient under fraktionsuppsamling. Placera locket på toppen av sedimenteringskammaren.
  5. Efter applicering av en mycket liten mängd av vakuum fett till marken glaskoppling av tre-vägskranen (Figur 1G), kläm kranen mot botten av se-dimentation kammare, som förbinder de slipningar av kranen och sedimenteringskammare.
  6. Anslut den cell-laddningskammaren (Figur 1A) till höger utlopp kranen med slangen. Stäng vattenkranen.
  7. Fäst cellfraktione slangen till vänster utlopp kranen. Fraktione slangen innefattar ett rörstycke med en glas pasteurpipett förbunden med den öppna änden. En bit av mindre innerdiameter är fäst till den smala änden av glaspipett. Den smala pipetten begränsar flödet av cellsuspensionen under fraktion samlande. Kläm denna lilla röret längst ner.
  8. Förbered två L Krebs (1x) buffra dagen för experimentet (tabell 1). Därefter bereda 550 ml 2% BSA i 1x Krebs, 550 ml 4% BSA i 1x Krebs, och 50 ml 0,5% BSA i 1x Krebs. Filtrera och kyla dessa lösningar till 4 ° C.
  9. Häll BSA-lösning 4% på högra två L cylinder (figur 1C) och 2% BSAlösning i den vänstra 2 L cylinder (Figur 1B). Se till att det inte finns några stora bubblor i slangen som förbinder dessa cylindrar.
  10. Häll Krebs buffert i cellen laddningskammaren och fyll slangen ansluter denna kammare med sedimenteringskammaren, vilket gör att det inte finns några stora bubblor, eftersom dessa kan störa lutning. Klämma eller snärta slangen hjälper försiktigt för att ta bort bubblorna. Se till att alla av Krebs-bufferten är i röret och inte i cellkammaren.
  11. Låt en liten mängd av Krebs-buffert att strömma in i sedimenteringskammaren och låt rinna nästan hela bufferten i cellen fraktione slangen för att fylla röret och avlägsnande av eventuella stora bubblor.
  12. Placera fraktionssamlaren direkt under sedimenteringskammaren. Se till att alla fraktionsrören är på plats och täckt med plastfolie för att förhindra kontaminering.

2. Isolera spermatogenescykler Celler från hela Testiklar

Dissekera testiklar från ca 12 vuxna möss (helst minst åtta veckor gamla) och plats i Krebs buffert vid rumstemperatur för att tvätta bort kontaminerande material. Detta protokoll som demonstreras innebär användning av laboratoriemöss och avrättades i enlighet med riktlinjerna från University of Pennsylvania Institutional Animal Care och användning kommittén.
  • Lägg till 45 mg kollagenas till 50 ml Krebs buffert i ett koniskt rör precis innan du tänker lägga sädeskanalerna. Tillåt lösningen att värmas upp till 33 ° C under ett par minuter. Dela upp jämnt i två 50 ml koniska rör.
  • Decapsulate testiklarna på en separat skylt som innehåller 8 ml Krebs buffert, kasta tunica albuginea och släppa sädeskanalerna. Tunica albuginea är den tunna membran som omger sädeskanalerna. Tubuli bör lätt lossnar från tunica albuginea. För att göra detta, gör ett snitt i tunica albuginea, håller detta membran med ett pair av pincett och tryck tubuli ur och bort från membranet med en annan pincett.
  • Lägg 4 ml Krebs-buffert innehållande tubuli till varje koniskt rör innehållande 25 ml kollagenaslösning och inkubera, skakning vid 33 ° C under 10 min. Vid slutet bör tubuli har en "spagetti-liknande" utseende.
  • Tillåt tubuli sedimentera under ~ 5 min till botten av röret. Häll ut supernatanten och tvätta 2x i 25 ml Krebs-buffert (vid rumstemperatur), vilket tillåter tubuli att sedimentera till botten av röret varje gång. Lägg till ~ 5 ml Krebs-buffert i varje rör.
  • Även tvätt, tillsätt 30 mg trypsin till 50 ml Krebs buffert i en falk rör precis innan du tänker lägga sädeskanalerna. Tillåt lösningen att värmas upp till 33 ° C under ett par minuter. Dela upp jämnt i två 50 ml koniska rör.
  • Tillsätt 25 ml trypsinlösning till vardera av de två rör innehållande tubuli. Lägg till 3 mikrogram DNAs (1 μg/10ml) till varje rör för att förhindra cells från klumpar. Inkubera under skakning vid 33 ° C under 10 min.
  • Använd en bred borrning pipett för att agitera lösningen innehållande tubuli, pipettera dem in och ut cirka 10x. Lösningen ska börja se mer ut som en enda cell suspension.
  • Inkubera under skakning vid 33 ° C under ytterligare 10 min. Använd en bred borrning pipett för att skingra tubuli i en enda cellsuspension, pipettera dem in och ut cirka 25x. Om du fortfarande ser en hel del tubuli eller cellklumpar, skingra mer med pipett och / eller lägga till en annan 3 mikrogram DNAs till varje rör (dubbel initial koncentration).
  • Filtrera den enda cellsuspension genom en 100 | im mesh cellfilter (ett för varje rör av 30 ml cellsuspension). Kombinera de cellsuspensioner och räkna det totala antalet celler (bör vara mellan 7-8 x 10 8 celler). *** Fyll inte på mer än 800 miljoner celler på lutningen.
  • Baserat på antalet celler som erhölls i steg 2,10, pelletera approprIATE volym av filtrerade cellerna vid 450 RCF i 5 minuter och tvätta med 30 ml Krebs-buffert. Upprepa. *** Vanligtvis 22 testiklar kommer att ge mer än 800 miljoner celler, men inte i mer än detta antal celler.
  • Noggrant återsuspendera cellerna i 25 ml 0,5% BSA, som innehåller mellan 2,5 och 5 | ig DNas (beroende på graden av cellklumpning) utan att skapa bubblor. Se till att cellerna inte klumpar. Filtrera den enda cellsuspension genom en 100 | im mesh cell sil. Cellerna är nu redo att ladda. Blanda väl före lastning genom att vända röret några gånger.
  • 3. Cell Lastning och sedimentation

    1. Säkerställ att kranen är stängd, men i den position som kommer att tillåta vätska att strömma från cellkammaren (Figur 1A) in i sedimenteringskammare (figur 1D).
    2. Vrid båda omrörarstav plattorna vidare till en låg nivå (ca 70 varv per minut) för att låta stir listerna för att röra sig kontinuerligt, men långsamt.
    3. Häll cellsuspensionen in i cellkammaren (Figur 1A) och öppna kranen så att cellerna flyta långsamt in i sedimenteringskammaren med en hastighet av 10 ml / min (figur 1D). Stäng vattenkranen. Flöde kan bestämmas genom att markera volymintervall på sedimenteringskammaren.
    4. Häll 5 ml av 0,5% BSA-lösning i cellkammaren och dränera in i sedimenteringskammaren med en hastighet av 10 ml / min. Stäng vattenkranen. Detta steg kommer att tvätta cellerna ut ur cellkammaren. Upprepa 4x.
    5. Förbered gradient: Öppna klämmorna mellan cellkammaren (Figur 1A) och de två 2 L cylindrar (Figur 1B och C), och börjar att tömma vätska in i sedimenteringskammaren med en hastighet av 40 ml / min (figur 1D) omedelbart. Justera flödeshastigheten så att det tar cirka 20 till 30 minuter för att ladda den BSA-gradient in i sedimenteringskammaren. Ett tunt, ostörd lager av celler som ligger på toppen avBSA lutning ska vara synligt. När de flesta av BSA är laddad, stäng kranen och vrid den till det läge som gör att vätskan rinna från sedimenteringskammaren i fraktioneringsröret.
    6. Stäng uppståndelse plattorna.
    7. Låt cellerna sedimentera under en timme och 45 minuter. STÖR INTE APPARATEN under denna tid. Varje mekanisk omrörning kunde störa lutning.

    4. Fraktionering och analys av fraktioner

    *** Som du utföra följande steg, vara noga med att inte störa lutning. Om BSA gradienten störs, kommer förfarandet inte att fungera!

    1. När cellerna har sjunkit, sakta rinna 50 ml från sedimenteringskammaren i en 50 ml koniska rör och ställ åt sidan. Denna fraktion innehåller vanligtvis oönskade klumpar av celler och skräp.
    2. Fäst fraktion röret till fraktionssamlaren. *** Det är också möjligt att samla fraktionerna hand om en bråkdel Collector är inte tillgänglig.
    3. Samla fraktioner: Justera flödet med kranen så att 10 ml (fyller en provröret) samlas varje 45 sek.
    4. Förslut bråkdel uppsamlingsrören och snurra i 5 minuter vid 450 RCF vid 4 ° C. Häll av supernatanten försiktigt, suspendera cellerna i kvarvarande vätska, och hålla cellerna på is.
    5. När alla fraktioner uppsamlas, mikroskopiskt analysera fraktioner av olika cellpopulationer. Olika celltyper kan särskiljas baserat på cellstorlek och nukleär morfologi 8,15. Figur 2 illustrerar "representativa resultat" för de tre poolade fraktioner som är anrikade på (a) somatiska och meiotiska celler och spermatogonier (b) runda spermatider och (c) förlängning och kondensespermatider.
      • Typ A spermatogonier är 12-14μm ca. i diameter och har runda kärnor som är homogena i kromatin sammansättning.
      • Typ B spermatogonier är 8-9μm ca. i diameter och har runt fed kärnor som visar tätare heterokromatin längs den nukleära periferin.
      • Pre-leptotene spermatocyter är 7.5-8.2μm ca. i diameter, har mindre cytoplasman än typ B spermatogonier, och har kärnor som liknar de i typ B spermatogonier.
      • Leptotene primära spermatocyter är 8-10 um ca. i diameter och har kärnor som liknar de av pre-leptotene spermatocyter, men tycks få tätare kromatin på det nukleära membranet.
      • Zygotene primära spermatocyter är 10-12 um ca. i diameter och har kärnor som ser liknar leptotene primära spermatocyter.
      • Pachytene spermatocyter är någonstans 12-18 um ca. i diameter och består av en tunn kant av cytoplasma omger en stor kärna. Fler klumpar av tät kromatin kan ses i kärnan.
      • Runda spermatider är 10 | im ca. i diameter och har en rund kärna med en tät-färgning chromocenter i mitten.
      • Residualkroppar är ~ 6,5 ^ m i diameter, är runda, och saknar en cellkärna.
      • Förlängning och kondensespermatider är ungefär lika stor som runda spermatider, men har en unik, skäran-formad kärna.
      1. Börja med fraktion 15 och analysera varje fem fraktioner upp till 85. Vanligtvis kommer fraktioner under 15 vara för blandad och klumpiga, och fraktioner över 85 kommer att innehålla några få till några användbara celler.
      2. För att analysera en fraktion, ta 5ul av vätska från den fraktion uppsamlingsrör (när celler har återsuspenderades efter centrifugering) och tillsätt till 5ul av 8% formaldehyd i Krebs buffert. Låt de fixerade cellerna att stå vid rumstemperatur under fem minuter.
      3. Lägg 5ul av 0,1% Triton och DAPI (5 μ / ml Krebs-buffert) till de fixerade cellerna. Låt cellerna att stå vid rumstemperatur under 5 min.
      4. Placera 10 | il av den resulterande lösningen på en bild, täck med ett täckglas, och analysera med ett fluorescensmikroskop för att bestämma renheten hos varje fraktion.
      5. Kombinera fraktioner som har liknande storlek och nukleär morfologi (se "Representativa resultat") för att skapa följande populationer av celler: meiotic och somatiska diploida celler, runda spermatider och kondense / förlängning spermatider.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Den idealiska resultatet från STA-PUT förfarande är en ganska märkbar separation av celler från testiklarna baserat på cellstorlek och täthet. Även celler som isolerats från testiklarna är sedimente genom BSA lutning, kan observeras flera olika band av celler. Eventuella klumpar av celler som har en tendens att sjunka till botten av gradienten och kommer inte förorena de andra fraktionerna. Lite längre upp gradienten kommer att vara den stora somatiska och meiotiska celler. Längre upp gradienten fortfarande kommer att vara mindre runda spermatider. På toppen av gradienten kommer att kondensspermatider, sperma, och kontaminerande röda blodkroppar (dessa verkar vara små runda celler utan kärna).

    Fraktionerna kan analyseras snabbt med användning av en kombination av ljus och fluorescensmikroskopi (figur 2) 15. Meiotiska, spermatogoniala och somatiska diploida celler är de största cellerna funna i testiklarna och kommer att innehålla stora kärnor som färgas relatidevis homogent med DAPI. Runda spermatider är mindre celler med mindre runda kärnor, i allmänhet med en ljust färgning chromocenter. Kondens / förlängning spermatider är små celler som ofta ser avlånga, som om en liten svans bildar. Dessa celler har mindre, kompakta kärnor som färgas ljust med DAPI och är formad som en skära. När cellfraktioner kombineras, kan renhet ytterligare fastställas genom western blot-analys av cellysaten (Figur 3). Vanliga markörer av meiotiska celler är synaptonemal komplexa 1 proteiner Scp1 och Sycp2 16. Vanliga markörer för kondensespermatider är övergångsproteiner (t ex TP1) eller protaminer 17.

    Även om varje STA-PUT körning kan vara olika, vanligtvis meiotiska celler, spermatogonier och somatiska diploida celler finns i fraktioner ca. 25-40, runda spermatider i fraktioner ca. 55-65, och kondense / förlängning spermatider i fraktioner ca.65-75 På grund av en mindre skillnad i storlek mellan somatiska / meiotiska celler och runda spermatider, fraktioner ca. 45-50 har oftast en jämn andel av somatiska / meiotiska celler och runda spermatider. Färgning med DAPI hjälper till att skilja mellan dessa två populationer av celler. Det finns mindre överlappning av den runda spermatid och kondense / elongating spermatid fraktioner på grund av den större skillnaden i storlek mellan dessa två populationer av celler. Vanligtvis kommer fraktioner under 15 innehåller många stora klumpar av celler och fraktioner över 85 kommer att innehålla några celler och många rest organ eller membranbundna cytoplasman som spridas av spermatider.

    Generellt, när celler från ~ 22 testiklarna är fraktion med STA-PUT förfarande, ger det ca. 10 8 celler / spermatogenesisk celltyp (meiotic / somatiska diploida celler, runda spermatider, och kondense / förlängning spermatider). Fraktioner som är kombinerade för att skapa den slutliga populationen av celler bör vara minst80% renhet för den typ av cell i fråga. Om du inte ser denna renhetsgrad eller högre, kan det finnas ett problem med cellseparation eller BSA lutning. Dessutom, om det finns några celler i de första 20 fraktionerna och ett överflöd av celler i fraktionerna 80 +, eller om det finns ett överflöd av celler i de första 20 fraktionerna och knappast någon i fraktionerna 70 + behöver sedimente tid att vara ytterligare optimeras. Se diskussion för förslag på hur man kan felsöka.

    Figur 1
    Figur 1. Inställning av STA-PUT Apparat: En schematisk och faktisk bild av STA-PUT apparaten visas. Allt glas är ansluten genom plastslang, inklusive röret som förbinder anordningen till fraktionssamlaren. Pilar indikerar läget för klämmorna. A) Cell laddningskammare, innehåller en omrörare, B) 2 L cylinder för 2% BSA, innehåller en omrörare, C) 2 L cylinder för 4% BSA, D) Sedimentekammare, E) Rör plattor, F) Baffle;. G) Kranen Klicka här för att visa en större bild .

    Figur 2

    Figur 2. Cellpopulationer som erhållits från STA-PUT: Bråk kombinerades i tre separata populationer av celler: meiotic och somatiska celler, runda spermatider och kondense och förlängning spermatider. Varje population är färgade med DAPI för att visa skillnader i kärn storlek och morfologi. Faskontrast avbildning förmedlar skillnader i cellstorlek och form. Vit stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .

    _content "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 3

    Figur 3. Markörer av olika cellpopulationer som erhållits från STA-PUT: Helcellsextrakt framställdes från varje cellpopulation visas i figur 1 och western blot-analys utfördes för att visa proteinuttrycksskillnader för varje population.. Synaptonemal komplexa protein 1 (Scp1) är ett protein som uttrycks enbart under meios och finns anrikat i meiotiska fraktioner, medan den kondense spermatid fraktionen anrikas för övergångs protein 1 (TP1), ett protein som uttrycks sent i spermiogenesen. Klicka här för att visa en större image .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    De som studerar spermatogenes beroende av djurmodeller för spermatogenescykler cellprover, som en pålitlig cellodlingssystem ännu inte existerar för att generera alla spermatogenescykler celltyper 3. Även spermatogenescykler celler lätt samlas in från hela testiklar, resulterar endast en blandad befolkning. Detta innebär ett problem för dem som vill studera specifika subtyper av dessa celler, såsom meiotiska celler, runda spermatider och kondensespermatider. Tre olika metoder används för närvarande för att separera dessa subtyper av spermatogenescykler celler: STA-PUT, FACS, och elutriation 6-13. De två senare metoderna kräver tillgång till dyra delar av utrustning: en cellsorterare och en elutriator, respektive. Även om FACS metod ger mycket rena populationer av olika spermatogenescykler celltyper, tar processen sex timmar och ger bara 0,5-2,0 x 10 6 celler per celltyp per 2-3 testiklar 11. Slamning, som STA-PUT methOD, separerar celler baserade på storlek och täthet, men kräver tillgång till en elutriator, vilket är dyrare än den STA-PUT-apparatur.

    STA-PUT procedur använder ett enkelt BSA-gradient för att separera spermatogenescykler celler av olika storlek med en ganska hög avkastning (~ 10 8 celler / invånare per ~ 22 testiklar). I förhållande till FACS-metoder, ger STA-PUT förfarande fler celler / testikel och tar mycket mindre tid att separera celltyper. Jämfört med FACS och slamning, är relativt enkel och billig att STA-PUT-förfarandet. STA-PUT kräver endast ett kallt rum eller stort kylskåp och en uppsättning specialiserade glas, vilket gör det till en idealisk metod för labb utan tillgång till en cellsorterare eller elutriatorn. När utförs på rätt sätt, kan det STA-PUT ger en ca 90% ren population av runda spermatider eller kondensespermatider.

    STA-PUT-metod är mycket användbar, men kräver optimering vid flera olika steg, i synnerhet mellanedimentation. Sub-optimal separation av celltyper kan orsakas av flera olika frågor, mest rör BSA-gradient. För att göra en ordentlig lutning, slå på stir barer i cellens laddningskammaren och 2 L cylindern håller 2% BSA medan du skapar gradienten. Också rensa alla slangar av bubblor och sätta baffeln på plats i sedimenteringskammaren innan du lägger cellerna. Reducering av flödeshastigheten för den BSA in i eller ut ur sedimenteringskammaren kan hjälpa. Viktigast bör STA-PUT apparat inte störas under skapandet av gradienten, sedimentering, eller del samling.

    Sub-optimala cellutbyten kan vara resultatet av otillräckligt antal / storlek på testiklarna, otillräcklig cellseparation under kollagenas / trypsin behandling, och cellklumpning. Om man inte kan få lämpligt antal celler för STA-PUT-protokollet på grund av användningen av neonatala möss eller genotyper som producerar små mängder spermatogenesisk cells, kan det vara nödvändigt att använda fler djur per STA-PUT eller för att beställa en STA-PUT glassats optimerad för mindre volymer och cell nummer (tillgänglig från ProScience) 18. För att få ett optimalt antal celler (700 till 800.000.000), använda minst 11 hanmöss i fertil ålder, helst minst 8-9 veckor gamla. Emellertid bör inte mer än 800 miljoner celler laddas i en STA-PUT. Om celler inte dissocieras till en enkelcellsuspension efter trypsinbehandling, kan ökas DNAse koncentration av upp till 1 ^ g / 5 ml lösning. DNAse är känslig för att upprepa cykler av frysning / tining, och med hjälp av färsk DNAse varje gång kommer att resultera i en mer effektiv dispersion av tubuli i en enda cellsuspension. Man kan använda en bred borrning pipett för att bidra till att bryta sönder cellklumpar innan filtrering genom nät.

    En aspekt av STA-PUT-metod som kommer att kräva optimering är den tid som cellerna får sedimentera genom BSA-gradient. En timmeoch 45 min brukar fungera bra, men den här gången kan skilja sig från labb till labb. Vanligtvis kan olika lager av celler ses visuellt hela BSA-gradient. Om det inte finns några celler i de första 20 fraktionerna uppsamlade och ett överflöd av celler i fraktionerna 80 +, kan sedimenteringstiden behöva förlängas. Om det finns för många celler i de första 20 fraktionerna som samlats in och det finns otillräcklig separation av celltyper, kan sedimenteringstiden behöva sänkas.

    De celler som är anskaffade med STA-PUT-procedur kan användas för många olika typer av experiment. STA-PUT ger gott om material för Western blot-analys, immunofluorescens och RNA-analys, även om stora biokemiska experiment kan kräva att kombinera material från flera olika STA-PUT körningar. Avskuren från andra celltyper, kan haploida spermatider odlas och underkastas in vitro molekylär manipulation i upp till tre dagar, vilket kan vara lättare än 19. Celler som erhållits med den beskrivna STA-PUT-protokollet har odlats under en dag utan uppenbara tecken på kontaminering, men om cellerna skall användas under längre cellodlingsexperiment, bör utrustningen steriliseras med etanol bör alla lösningar filtersteriliseras och hela steg före cellbelastning och efter fraktionsuppsamling bör utföras i en vävnadsodling huva. Dessutom bör odlingsmedia innehållande antibiotika användas. Det faktum att STA-PUT-metoden inte kräver cellfixering gör det till en idealisk förfarande för experiment som kräver viabla celler.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Detta protokoll som demonstreras innebär användning av laboratoriemöss och avrättades i enlighet med alla relevanta riktlinjer, regler och tillsynsmyndigheter. Djur som används i detta protokoll upprätthålls under vägledning och godkännande av University of Pennsylvania Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC protokoll # 804.284).

    Acknowledgments

    Denna forskning stöds av NIH bidrag GM055360 till SLB och U54HD068157 till RGM. JMB stöddes av T32 Genetics utbildningsstipendium vid University of Pennsylvania (GM008216).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BSA Affymetrix/USB 10857 100MG Alternate can be used.
    0.5%, 2%, and 4% BSA solutions Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
    KREBS (10x) 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
    KREBS (1x) Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
    Collagenase Sigma C9891-1G
    DNAse Sigma DNEP-5MG
    Trypsin Sigma T9201-1G
    DAPI Preference of researcher
    Triton-X100 Preference of researcher
    Formaldehyde (~37%) Preference of researcher
    TABLE 2: EQUIPMENT
    Equipment Company Catalog # Comments
    Complete STA-PUT apparatus ProScience Glass Shop STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
    10 μm mesh filter Fisherbrand 22363549
    Mouse dissection tools Preference of researcher
    14 ml round bottom fraction collection tubes with caps Preference of researcher
    Need approximately 100 tubes
    Fraction collector GE Healthcare Life Sciences Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 Alternate can be used.
    Microscope slides, cover glass Preference of researcher
    Light/Fluorescent Microscope Preference of researcher

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
    2. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
    3. Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
    4. Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
    5. Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
    6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
    7. Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
    8. Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
    9. Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
    10. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
    11. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
    12. Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
    13. Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
    14. Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
    15. Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
    16. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
    17. Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
    18. Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
    19. Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
    Separation av spermatogenesisk celltyper med STA-PUT Velocity Sedimente
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation. J. Vis. Exp. (80), e50648, doi:10.3791/50648 (2013).More

    Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation. J. Vis. Exp. (80), e50648, doi:10.3791/50648 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter