Summary
STA-metoden PUT tillader adskillelse af forskellige populationer af spermatogene celler baseret på størrelse og tæthed.
Abstract
Mammalian spermatogenesen er en kompleks differentiering proces, der foregår i flere trin i sædkanalerne af testiklerne. I øjeblikket er der ingen pålidelige cellekultur-system giver mulighed for modningshæmning differentiering in vitro, og de fleste biologiske studier af sædcelledannende celler kræver væv høst fra dyremodeller som mus og rotter. Fordi testiklerne indeholder mange celletyper - både ikke-spermatogene (Leydig, Sertoli, myeloide og epitelceller) og sædcelledannende (spermatogonier, spermatocytter, runde spermatider, kondenserende spermatider og spermatozoer) - undersøgelser af de biologiske mekanismer, der er involveret i spermatogenesen kræver isolation og berigelse af disse forskellige celletyper. STA-metoden PUT muliggør separation af en heterogen population af celler - i dette tilfælde fra testiklerne - via en lineær BSA gradient. Individuelle celletyper sediment med forskellige sedimentering hastighed i henhold til CEll størrelse, samt fraktioner beriget til forskellige celletyper kan opsamles og anvendes i yderligere analyser. Mens STA-metoden PUT ikke resulterer i meget rene fraktioner af celletyper, fx som kan opnås med visse cellesortering metoder, det giver et meget højere udbytte af totale celler i hver fraktion
(~ 1 x 10 8 celler / modningshæmning celletype fra en start befolkning på 7-8 x 10 8 celler). Denne højt udbytte metode kræver kun specialiseret glas og kan udføres i alle kølerum eller stort køleskab, hvilket gør det en ideel metode til laboratorier, som har begrænset adgang til specialiseret udstyr som en fluorescens cellesorteringsapparat (FACS) eller elutriator.
Introduction
Mammalian spermatogenesen er en kompleks differentiering proces, der foregår i flere trin i sædkanalerne af testiklerne 1. Kort fortalt, stængel-lignende spermatogoner at opholde sig nær epitel sædkanalerne kløft og differentiere i spermatocytter, som derefter undergår meiotiske delinger. Efter meiose er færdig, de resulterende haploide celler eller runde spermatider undergår spermiogenesis, en differentiering proces, der involverer udgydelse af cytoplasma og komprimering af kernen. Spermatider gradvist at udvikle en flagellum og gennemgå forlængelse og kondensering af kernen, der producerer forlængede og derefter kondenserende spermatider, hhv. Slutprodukterne spermatozoer, som frigives ind i lumen af sædkanalerne og til sidst i bitestiklen, hvor de modnes yderligere.
Fordi processen med spermatogenesen bygger på særlige hormonelle og molekylære forhold itestiklerne, en pålidelig in vitro-dyrkningssystem for hele processen af spermatogenesen er endnu ikke blevet udviklet 2,3. Er blevet udviklet dyrkningsmetoder for at skabe "primordial kønsceller-lignende celler" og haploide, "runde sædcelleantal-lignende celler" fra stamceller, men disse metoder er endnu ikke i stand til at generere et stort antal af disse celler og undlader at producere senere modningshæmning celle typer 4,5. Heldigvis adskiller de sædcelledannende celletyper betydeligt i størrelse, hvilket giver mulighed for en enkelt-cellesuspension opnået fra hele testiklerne til at blive adskilt med en væske-gradient. STA-PUT metode, viste her, bruger en lineær BSA gradient og enkel sedimentering at adskille sædcelledannende celler baseret på størrelse og masse 6-9.
STA-PUT metode har flere fordele i forhold til de andre to mest udbredte metoder til at adskille sædcelledannende celletyper: FACS og slæmning 10-13. Apparat STA-PUT kræver only flere stykker specialiserede glasvarer samlet i et koldt rum eller stort køleskab. Således er det er billigere end anvendelse af et cellesorteringsapparat eller elutriator. STA-PUT metode giver højere mængder af celler pr celletype og testis end kan sorteres ved FACS i en sammenlignelig tidsramme, men renheden af hver cellepopulation er ikke så høje som dem, der opnås med FACS 11. Cellesortering udnytte magnetiske perler (magnetisk aktiveret celle sortering, MACS) er for nylig blevet anvendt med succes til berigelse af spermatogonier fra en blandet testikelkræft celle befolkning, men det er i øjeblikket uegnet til at adskille spermatocytter eller spermatider på grund af manglende viden om hensigtsmæssig overflademarkører 14. En yderligere fordel af STA-metoden PUT i FACS eller MACS er evnen til at isolere levedygtige celler er egnede til efterfølgende kultur, fordi, i modsætning til de fleste FACS-protokoller, kræver det ikke nogen DNA eller andre former for farvning. For undersøgelser, der kræver large udbytter af sædcelledannende celletyper på ~ 90% renhed, STA-PUT er en ideel metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
STA-PUT-protokollen omfatter tre faser: 1) Opsætning af apparatet og reagenser, 2) Forberedelse af cellesuspension fra hele testikler, og 3) Cell lastning, sedimentering, og fraktion samling. Når de udføres af et team af to forskere, protokollen tager otte timer i gennemsnit.
1.. Opsætning af STA-PUT Apparatur (figur 1)
*** Apparat STA-PUT bør placeres i et 4 ° C stort køleskab eller et koldt rum, der også kan rumme en brøkdel opkøber, hvis denne metode til indsamling foretrækkes.
- Natten før (eller i det mindste et par timer før) du udfører metoden, vaske alt udstyr (især glas og slanger) og sterilisere med 70% ethanol. Lad udstyret tørre helt, før samling af apparatet som vist i figur 1.
- Fastgør de to 2 L cylindre (figur 1B og C), og den celle ladekammeret (
- Placer en lille omrørerstang i cellen ladekammeret (figur 1A) og en større opsigt bar i venstre mest 2 L cylinder (figur 1B), der skal indeholde 2% BSA.
- Anbring 2 L sedimentationskammeret på platformen (figur 1D). Placer metal plade (figur 1F) direkte på toppen af åbningen i bunden af sedimentationskammeret (figur 1D). Dette er kritisk, da vingen forhindrer omhvirvling af væsken og fraktionering af cellen, gradient under fraktionsopsamling. Placer låget oven sedimentationskammeret.
- Efter anvendelse af en meget lille mængde vakuum fedt på fælles slib af trevejshanen (figur 1G), klemme stophanen til bunden af SEdimentation kammer, der forbinder de slib af hanen og sedimentationskammeret.
- Slut celle-ladekammeret (figur 1A) til højre udløb på stophanen med slangen. Vandhanen lukkes.
- Fastgør celle fraktionering slangen til venstre stik stophanen. Fraktionering slangen omfatter et rørstykke med en glas Pasteur-pipette forbundet med den åbne ende. Et stykke af mindre boring slangen er fastgjort til den smalle ende af glaspipette. Den smalle pipetten begrænser strømmen af cellesuspensionen under fraktion indsamling. Klem dette lille rør i bunden.
- Forbered 2 L Krebs (1x) buffer dagen for forsøget (tabel 1). Derefter forberede 550 ml 2% BSA i 1x Krebs, 550 ml 4% BSA i 1x Krebs, og 50 ml 0,5% BSA i 1x Krebs. Filtrer og afkøles disse løsninger til 4 ° C.
- Hæld 4% BSA-opløsning i den højre 2 L cylinder (figur 1C) og 2% BSAopløsning i venstre 2 L cylinder (figur 1B). Sørg for, at der ikke er store bobler i slangen, der forbinder disse flasker.
- Hæld Krebs buffer ind i cellen ladekammeret og fylde slangen forbinder dette kammer med sedimentationskammeret, og sørg for der er ingen store bobler, da disse kan forstyrre gradient. Klemme eller bladrer slangen forsigtigt hjælper med at fjerne boblerne. Kontroller, at alle Krebs buffer er i røret og ikke i cellekammeret.
- Tillade en lille mængde af Krebs buffer at strømme ind i sedimentationskammeret og derefter løbe næsten alle buffer i cellen fraktionering slangen for at fylde røret og fjerne eventuelle store bobler.
- Placer fraktionsopsamler direkte under sedimentationskammeret. Sørg for, at alle fraktion rørene er på plads og dækket med plastfolie for at forhindre forurening.
2. Isolating sædcelledannende Celler fra Whole Testes
3. Cell Loading og Sedimentation
- Kontroller, at vandhanen er lukket, men i den position, som vil tillade væske at strømme fra cellen kammer (figur 1A) i sedimentationskammeret (figur 1D).
- Drej begge omrørerstav plader på et lavt niveau (ca. 70 rpm) for at tillade røre stænger til at bevæge sig kontinuerligt, men langsomt.
- Hæld cellesuspensionen i cellekammeret (figur 1A) og åbne stophanen således at cellerne strømme langsomt ind i sedimentationskammeret ved en hastighed på 10 ml / min (figur 1D). Vandhanen lukkes. Flow kan bestemmes ved mærkning volumen mellemrum på sedimentering kammer.
- Hæld 5 ml 0,5% BSA-opløsning i cellekammeret og løbe ned i sedimentationskammeret ved en hastighed på 10 ml / min. Vandhanen lukkes. Dette trin vil vaske cellerne ud af cellekammeret. Gentag 4x.
- Forbered gradient: Åbn klemmerne mellem celle kammer (figur 1A) og de to 2 L cylindre (figur 1B og C), og begynder at dræne væsken ind i sedimentering kammer med en hastighed på 40 ml / min (figur 1D) straks. Justér flowet, så det tager ca 20-30 min at indlæse BSA gradient ind i sedimentering kammer. En tynd uforstyrret lag af celler, liggende oven påBSA gradient skal være synlig. Når det meste af BSA er indlæst, skal du lukke stophanen og drej den til den position, der vil tillade væsken dryppe ud sedimentationskammeret i fraktionering røret.
- Sluk røre plader.
- Lade cellerne sedimentere i en time og 45 minutter. Ikke forstyrrer APPARAT i dette tidsrum. Enhver mekanisk omrøring kunne forstyrre forløbet.
4.. Fraktionering og analyse af fraktioner
*** Når du udfører følgende trin, skal du passe på ikke at forstyrre forløbet. Hvis BSA gradient er forstyrret, vil proceduren ikke arbejde!
- Når cellerne er sedimenteret, langsomt dræne 50 ml fra sedimentationskammeret i en 50 ml konisk rør og afsat. Denne fraktion indeholder som regel uønskede klumper af celler og snavs.
- Fastgør fraktion røret fraktionsopsamleren. *** Det er også muligt at opsamle de fraktioner ved hånden, hvis en brøkdel Collector er ikke tilgængelig.
- Saml fraktioner: Hastigheden med stophanen, så 10 ml (påfyldning en samling rør) indsamles hver 45 sek.
- Luk rørene fraktionsopsamling og spin i 5 minutter ved 450 RCF ved 4 ° C. Hæld supernatanten forsigtigt, resuspenderes cellerne i de resterende væske, og holde cellerne på is.
- Når alle fraktioner opsamles, mikroskopisk analyse af fraktioner for forskellige cellepopulationer. Kan skelnes baseret på cellestørrelse og kernemorfologi 8,15 forskellige celletyper. Figur 2 illustrerer "repræsentative resultater" for de tre samlede fraktioner, der er beriget med hensyn til (a) somatiske og meiotiske celler og spermatogonia, (b) runde spermatider og (c) forlængede og kondenserende spermatider.
- Type A spermatogonier er 12-14μm ca. i diameter og har runde kerner, der er homogene i kromatin sammensætning.
- Type B spermatogoner er 8-9μm ca. i diameter og har Round kerner, der viser mere tætte heterochromatin langs den nukleare periferien.
- Pre-leptotene spermatocytter er 7,5 8.2μm ca. i diameter, har mindre cytoplasma end type B spermatogonier, og har kerner, der ligner dem, der i type B spermatogonier.
- Leptotene primære spermatocytter er 8-10 um ca. i diameter og har kerner, der ligner dem, der præ-leptotene spermatocytter, men synes at få mere tæt kromatin ved kernemembranen.
- Zygotene primære spermatocytter er 10-12 um ca. i diameter og har kerner, der ligner dem af leptotene primære spermatocytter.
- Pachytene spermatocytter er overalt 12-18 um ca. i diameter og består af en tynd rand af cytoplasma, der omgiver en stor kerne. Flere klumper af tæt kromatin kan ses i kernen.
- Runde spermatider er 10 um ca. i diameter og har en rund kerne med et tæt-farvning chromocenter i midten.
- Resterendeorganer ~ 6,5 um i diameter, er runde, og der mangler en kerne.
- Forlængede og kondenserende spermatider er ens i størrelse til at runde spermatider, men har en unik, segl-formet kerne.
- Start med fraktion 15 og analysere hver fem fraktioner op til 85. Normalt vil fraktioner under 15 være for blandet og clumpy og fraktioner over 85 vil indeholde få til ingen brugbare celler.
- For at analysere en brøk, tage 5UL af væske fra fraktion opsamlingsrør (når cellerne er blevet resuspenderet efter centrifugering) og tilsæt til 5UL 8% formaldehyd i Krebs-puffer. Lad fikserede celler til at sidde ved stuetemperatur i fem minutter.
- Tilføj 5UL 0,1% Triton og DAPI (5 μ / ml Krebs-buffer) til de fikserede celler. Lade cellerne stå ved stuetemperatur i 5 min.
- Placer 10 ul af den resulterende opløsning på et objektglas, dækkes med et dækglas og analysere med et fluorescensmikroskop for at bestemme renheden af hver fraktion.
- Kombiner fraktioner, der ligner i størrelse og kernemorfologi (se "Repræsentative resultater") for at oprette følgende populationer af celler: meiotiske og somatiske diploide celler, runde spermatider og kondenserende / forlængede spermatider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det ideelle resultat af STA-PUT procedure er en temmelig mærkbar adskillelse af celler fra testiklerne baseret på cellestørrelse og massefylde. Mens celler isoleret fra testiklerne er sedimenting gennem BSA gradient, kan flere forskellige bånd af celler overholdes. Eventuelle klumper af celler har tendens til at synke til bunden af gradienten og vil ikke forurene de øvrige fraktioner. Lidt længere oppe gradienten vil være den store somatiske og meiotiske celler. Længere op gradienten stadig vil være mindre runde spermatider. På toppen af gradienten vil kondenseres spermatider, sperm og kontaminerende røde blodlegemer (der synes at være små runde celler uden en kerne).
Fraktioner kan analyseres hurtigt ved hjælp af en kombination af lys og fluorescensmikroskopi (fig. 2) 15. Meiotisk, spermatogontesten og somatiske diploide celler er de største celler findes i testiklerne og vil indeholde store kerner pletten relatively homogent med DAPI. Runde spermatider er mindre celler med mindre runde kerner, generelt med en flotte farvning chromocenter. Kondensering / forlængede spermatider er små celler, der ofte ser aflange, som om en lille hale danner. Disse celler har mindre, kompakte kerner Afsmittende smukt med DAPI og er formet som en segl. Når celle-fraktioner kombineres, kan renheden yderligere bestemmes ved western blot-analyse af cellelysater (figur 3). Fælles markører af meiotiske celler er de synaptonemal komplekse 1-proteiner Scp1 og Sycp2 16. Almindelige markører for kondenserende spermatider er overgangs-proteiner (f.eks TP1) eller protaminer 17.
Selv om hver STA-PUT løb kan være anderledes, vil normalt meiotiske celler, spermatogonier og somatiske diploide celler findes i fraktioner på ca. 25-40, runde spermatider i fraktioner ca. 55-65, og kondenserende / forlængede spermatider i fraktioner på ca.65-75 Grundet en mindre forskel i størrelse mellem somatiske / meiotiske celler og runde spermatider, fraktioner ca. 45-50 ofte har en endnu procentdel af somatiske / meiotiske celler og runde spermatider. Farvning med DAPI vil bidrage til at skelne disse to populationer af celler. Der er mindre overlap af runden sædcelleantal og kondenserende / forlængede sædcelleantal fraktioner på grund af den større forskel i størrelse mellem disse to populationer af celler. Normalt vil fraktioner under 15 indeholder mange store klumper af celler og fraktioner over 85 vil indeholde nogle celler og mange resterende organer eller membranbundne cytoplasma, som er udgydt af spermatider.
Generelt, når celler fra ~ 22 testikler er fraktioneret med STA-PUT procedure, det giver ca. 10 8 celler / modningshæmning celle type (meiotiske / somatiske diploide celler, runde spermatider og kondenserende / forlængede spermatider). Fraktioner, der er kombineret til at skabe den endelige population af celler skal være mindst80% ren for den type pågældende celle. Hvis du ikke kan se denne renhedsgrad eller højere, kan der være et problem med celle separation eller BSA gradient. Også, hvis der er få celler i de første 20 fraktioner og en overflod af celler i fraktionerne 80 +, eller hvis der er en overflod af celler i de første 20 fraktioner, og næppe nogen i fraktionerne 70 +, sedimentation tid skal yderligere optimeres. Se venligst Diskussion om forslag til, hvordan problemer med at skyde.
Figur 1. Opsætning af STA-PUT Apparatur: En skematisk og faktiske billede af STA-PUT apparatet vises. Alle glasvarer er forbundet med plastrør, herunder rør, der forbinder apparaturet fraktionsopsamleren. Pile angiver placeringen af klemmer. A) Cell ladekammeret, indeholder en omrørerstang, B) 2 L cylinder for 2% BSA, indeholder en omrørerstang, C) 2 L cylinder til 4% BSA, D) Sedimentation kammer e) Stir plader, F) Baffle. G) Stophane Klik her for at se større billede .
Figur 2. Cellepopulationer opnået fra STA-PUT: fraktioner blev kombineret i tre separate populationer af celler: meiotiske og somatiske celler, runde spermatider og kondenserende og forlængede spermatider. Hver population farves med DAPI at vise forskelle i nukleare størrelse og morfologi. Fasekontrast billeddannelse formidler forskelle i cellestørrelse og form. Hvide søjle repræsenterer 10 um. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Markører for forskellige cellepopulationer opnået fra STA-PUT: Hele celleekstrakter blev fremstillet fra hver cellepopulation er vist i figur 1, og Western blot-analyse blev udført for at vise proteinekspression forskelle for hver population.. Synaptonemal kompleks protein 1 (Scp1) er et protein, der udtrykkes udelukkende under meiose og findes beriget meiotiske fraktioner, mens den kondenserende sædcelleantal fraktion beriget for overgang protein 1 (TP1), et protein, der udtrykkes sent i spermiogenesis. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dem, der studerer spermatogenesen stole på dyremodeller for sædcelledannende celleprøver, som en pålidelig cellekultur-system endnu ikke eksisterer for at generere alle sædcelledannende celletyper 3. Selv sædcelledannende celler let indsamles fra hele testikler, kun en blandet population resultat. Det er et problem for dem, der ønsker at studere specifikke undertyper af disse celler, såsom meiotiske celler, runde spermatider og kondenserende spermatider. Er i øjeblikket anvendes tre forskellige metoder til at adskille disse undertyper af sædcelledannende celler: STA-PUT, FACS, og elutriation 6-13. De sidstnævnte to metoder kræver adgang til dyre stykker udstyr: en celle sorteringsanlæg og en elutriator hhv. Selv FACS metode giver meget rene populationer af de forskellige sædcelledannende celletyper, processen tager seks timer og giver kun 0,5-2,0 x 10 6 celler pr celletype pr 2-3 testikler 11. Elutriering, ligesom STA-PUT method, separerer celler baseret på størrelse og tæthed, men kræver adgang til en elutriator, som er dyrere end STA-PUT apparatet.
STA-PUT procedure bruger et simpelt BSA gradient til at adskille sædcelledannende celler i forskellige størrelser med en forholdsvis højt udbytte (~ 10 8 celler / befolkning pr ~ 22 testikler). I forhold til FACS-metoder, STA-PUT fremgangsmåde giver flere celler / testis og tager meget mindre tid til at adskille celletyper. Sammenlignet med FACS og slæmning, STA-PUT fremgangsmåde er relativt enkel og billig. STA-PUT kræver kun et koldt rum eller stort køleskab og et sæt af specialiserede glas, hvilket gør det til en ideel metode til laboratorier uden adgang til en celle sorteringsanlæg eller elutriator. Når de udføres korrekt, kan STA-PUT giver en cirka 90% ren population af runde spermatider eller kondenserende spermatider.
STA-PUT metode er meget anvendelig, men kræver optimering på flere forskellige trin, specielt sedimentation. Sub-optimal adskillelse af celletyper kan være forårsaget af flere forskellige spørgsmål, mest vedrørende BSA gradient. For at gøre en ordentlig gradient, tænde røre barer i cellen ladekammeret og 2 L cylinder holder 2% BSA, mens du opretter forløbet. Også rydde alle slanger af bobler og sætte skvulpeskærmen på plads i sedimentering kammer, før du lægger cellerne. Reduktion af strømningshastigheden af BSA ind i eller ud af sedimentationskammeret kan hjælpe. Vigtigst af alt skal STA-PUT apparatet ikke blive forstyrret under oprettelsen af gradienten, sedimentering, eller brøkdel samling.
Suboptimal celleudbytter kan være resultatet af utilstrækkeligt antal / størrelse af testiklerne, utilstrækkelig celle adskillelse under collagenase / trypsinbehandling, og celle sammenklumpning. Hvis man ikke er i stand til at opnå et passende antal celler til denne STA-PUT protokol på grund af brugen af neonatale mus eller genotyper, der producerer et lille antal modningshæmning cells, kan det være nødvendigt at anvende flere dyr pr STA-PUT eller at bestille en STA-PUT glasvarer kit er optimeret til mindre mængder og celletal (tilgængelig fra ProScience) 18. For at opnå et optimalt antal celler (700-800.000.000), brug mindst 11 hanmus i den fødedygtige alder, ideelt mindst 8-9 uger gamle. Imidlertid bør ikke mere end 800 millioner celler blive indlæst i en STA-PUT. Hvis cellerne ikke har adskilt ind i en enkelt celle suspension efter trypsinbehandling kan DNAse koncentrationen øges op til 1 pg / 5 ml opløsning. DNAse er følsom til at gentage cyklusser af frysning / optøning, og ved hjælp af friske DNAse hver gang vil resultere i en mere effektiv dispersion af tubuli i en enkelt cellesuspension. Man kan bruge en bred boring pipette til at hjælpe med at bryde hinanden celleklumper før filtrering gennem mesh.
Et aspekt af STA-PUT metode, der vil kræve optimering er den mængde tid, cellerne lov til at sedimentere gennem BSA gradient. En timeog 45 min normalt fungerer godt, men denne gang kan variere fra laboratorium til laboratorium. Normalt kan de forskellige lag af celler ses visuelt hele BSA gradient. Hvis der er få celler i de første 20 fraktioner opsamlet og en overflod af celler i fraktionerne 80 +, kan sedimentering tid skal udvides. Hvis der er for mange celler i de første 20 opsamlede fraktioner, og der er utilstrækkelig adskillelse af celletyper, kan sedimentering tid skal sænkes.
Cellerne erhvervet med STA-PUT procedure kan anvendes til mange forskellige typer af eksperimenter. STA-PUT giver rigelig materiale til western blot analyse, immunfluorescens, og RNA-analyse, selv om store biokemiske eksperimenter kan kræve at kombinere materiale fra flere forskellige STA-put kørsler. Når adskilt fra andre celletyper kan haploide spermatider dyrkes og underkastet in vitro molekylær manipulation i op til tre dage, hvilket kan være lettere end
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Denne protokol demonstreres indebærer brug af laboratoriemus og blev henrettet i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer, regler og reguleringsorganer. Dyr anvendt i denne protokol opretholdes under vejledning og godkendelse af University of Pennsylvania Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC protokol # 804.284).
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af NIH tilskud GM055360 SLB og U54HD068157 til RGM. JMB blev støttet af T32 Genetics Training Grant ved University of Pennsylvania (GM008216).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
