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Biology

Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation

doi: 10.3791/50648 Published: October 9, 2013

Summary

Procédé STA-PUT permet la séparation des différentes populations de cellules spermatiques fonction de la taille et de la densité.

Abstract

Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules. Actuellement, il n'existe pas de système de culture cellulaire fiable permettant la différenciation de la spermatogenèse in vitro, et la plupart des études biologiques des cellules spermatiques nécessite récolte des tissus de modèles animaux comme la souris et le rat. Parce que le testicule contient de nombreux types cellulaires - à la fois non-spermatogenèse (Leydig, de Sertoli, myéloïdes et les cellules épithéliales) et la spermatogenèse (spermatogonies, spermatocytes, spermatides rondes, condensation spermatides et spermatozoïdes) - études des mécanismes biologiques impliqués dans la spermatogenèse nécessiter l'isolement et l'enrichissement de ces différents types cellulaires. Procédé STA-PUT permet la séparation d'une population hétérogène de cellules - dans ce cas, des testicules - à travers un gradient linéaire de BSA. Types cellulaires individuels sédimentent avec la vitesse de sédimentation différente selon CEtaille de ll, et les fractions enrichies en différents types de cellules peuvent être recueillies et utilisées dans d'autres analyses. Bien que la méthode STA-PUT n'entraîne pas de fractions très pures de types de cellules, par exemple comme on peut obtenir avec certaines méthodes de tri cellulaire, il ne fournit avec un rendement beaucoup plus élevé de cellules totales dans chaque fraction
(~ 1 x 10 8 cellules / spermatogenèse type à partir d'une population de départ de 08.07 x 10 8 cellules de la cellule). Cette méthode à haut rendement nécessite que la verrerie spécialisée et peut être effectuée dans n'importe quelle pièce froide ou grand réfrigérateur, ce qui en fait une méthode idéale pour les laboratoires qui ont un accès limité à de l'équipement spécialisé comme un trieur activé par fluorescence de cellules (FACS) ou élutriateur.

Introduction

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Spermatogenèse chez les mammifères est un processus de différenciation complexe qui se produit en plusieurs étapes dans les tubules séminifères des testicules 1. En bref, la tige-comme spermatogonies qui résident près de l'épithélium du tubule séminifère fracture et se différencient en spermatocytes, qui subissent alors des divisions méiotiques. Après la méiose est terminée, les cellules haploïdes résultant, ou spermatides rondes, subissent la spermiogenèse, un processus de différenciation qui implique l'effusion du cytoplasme et le compactage du noyau. Spermatides développent progressivement un flagelle et subissent un allongement et la condensation du noyau, la production d'allongement puis condensation spermatides, respectivement. Les produits finaux sont les spermatozoïdes, qui sont libérés dans la lumière du tube séminifère et finalement dans l'épididyme, où ils mûrissent plus loin.

Parce que le processus de la spermatogenèse dépend des conditions hormonaux et moléculaires spéciauxles testicules, un système fiable de culture in vitro pour l'ensemble du processus de la spermatogenèse n'a pas encore été mis au point 2,3. Les méthodes de culture ont été développés pour créer des "cellules analogues à des cellules germinales primordiales» et «cellules rondes de spermatides comme" haploïdes à partir de cellules souches, mais ces méthodes ne sont pas encore en mesure de générer un grand nombre de ces cellules et ne parviennent pas à produire cellule spermatogenèse plus tard types de 4,5. Heureusement, les types de cellules spermatiques diffèrent de manière significative dans la taille, ce qui permet une suspension à cellule unique obtenue à partir de testicules entiers à séparer avec un gradient liquide. La méthode STA-PUT, démontré ici, utilise un gradient linéaire BSA et simple sédimentation pour séparer les cellules spermatiques fonction de la taille et de la masse 6-9.

La méthode STA-PUT a plusieurs avantages par rapport aux deux autres méthodes les plus utilisées pour séparer les types de cellules spermatiques: FACS et élutriation 10-13. L'appareil STA-PUT nécessite ONLy plusieurs pièces de verrerie spécialisé assemblés dans une chambre froide ou un grand réfrigérateur. Ainsi, il est moins coûteux que d'utiliser un trieur de cellules ou un séparateur par décantation. La méthode STA-PUT produit des quantités plus élevées de cellules par type de cellule et les testicules que peuvent être triés par FACS dans un laps de temps comparable, bien que la pureté de chaque population de cellules n'est pas aussi élevés que ceux obtenus avec FACS 11. Tri cellulaire utilisant des billes magnétiques (magnétique tri cellulaire activé, MACS) a récemment été utilisée avec succès pour l'enrichissement de spermatogonies à partir d'une population de cellules testiculaires mixte, mais il est actuellement inadapté pour séparer spermatocytes ou spermatides en raison du manque de connaissances de surface appropriée les marqueurs 14. Un avantage supplémentaire de la méthode STA-PUT sur FACS ou MACS est la capacité à isoler des cellules viables aptes à la culture ultérieure parce que, contrairement à la plupart des protocoles de FACS, il ne nécessite pas d'ADN ou d'autres types de coloration. Pour des études nécessitant lrendements arge de la spermatogenèse types de cellules à ~ 90% de pureté, le STA-PUT est une méthode idéale.

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Protocol

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Le protocole STA-PUT comporte trois étapes: 1) Mise en place de l'appareil et les réactifs, 2) Préparation de la suspension de cellules de testicules entiers, et 3) Cell, la sédimentation, et la collecte de fractions. Quand elle est réalisée par une équipe de deux chercheurs, le protocole faut huit heures en moyenne.

Une. Mise en place du Dispositif STA-PUT (Figure 1)

*** Appareil STA-PUT doit être placé dans un 4 ° C grand réfrigérateur ou une chambre froide qui peut également accueillir un collecteur de fraction, si ce mode de collecte est préférable.

  1. La nuit avant (ou au moins quelques heures avant), vous effectuez la méthode, laver tous les équipements (en particulier la verrerie et de tubes) et stériliser à l'éthanol à 70%. Laissez sécher le matériel avant le montage de l'appareil, comme illustré à la figure 1.
  2. Fixez les deux cylindres 2 L (figures 1B et C) et la chambre cellule de chargement (
  3. Placer une petite barre d'agitation dans la chambre cellule de chargement (figure 1A) et une plus grande barre d'agitation dans le cylindre 2 L plus à gauche (figure 1B) qui contiendra le 2% de BSA.
  4. Placer la chambre de sédimentation de 2 L sur la plate-forme (figure 1D). Placer la chicane métallique (figure 1F) directement au-dessus de l'ouverture dans le fond de la chambre de sédimentation (Figure 1D). Ceci est important, car la chicane empêche tourbillonnement du liquide et de la perturbation du gradient de la cellule au cours de la collecte de fraction. Placer le couvercle sur le dessus de la chambre de sédimentation.
  5. Après l'application d'une très petite quantité de graisse à vide pour le joint en verre rodé du robinet à trois voies (Figure 1G), serrer le robinet d'arrêt à la partie inférieure de la sechambre de dimentation, reliant les joints en verre rodé du robinet d'arrêt et la chambre de sédimentation.
  6. Relier la chambre de cellule de chargement (Figure 1A) vers la droite la sortie du robinet d'arrêt avec tubulure. Fermer le robinet.
  7. Fixer le tube de fractionnement de cellule vers la sortie du robinet d'arrêt gauche. Le tube de fractionnement comprend un morceau de tube avec une pipette Pasteur en verre reliée à l'extrémité ouverte. Un petit morceau de tube de diamètre est fixée à l'extrémité étroite de la pipette en verre. La pipette étroite limite l'écoulement de la suspension de cellules pendant la fraction collecteur. Fixez ce petit tube au bas.
  8. Préparer 2 L Krebs (1x) tamponner le jour de l'expérience (tableau 1). Ensuite, préparer 550 ml de 2% de BSA dans du Krebs 1x, 550 ml de 4% de BSA dans du Krebs 1x, et 50 ml de 0,5% de BSA dans du Krebs 1x. Filtrer et refroidir ces solutions à 4 ° C.
  9. Verser la solution de BSA à 4% dans le cylindre droit 2 L (figure 1C) et la BSA à 2%solution dans le cylindre de gauche 2 L (figure 1B). Assurez-vous qu'il n'y a pas de grosses bulles dans le tube qui relie ces cylindres.
  10. Verser tampon Krebs dans la chambre cellule de chargement et de remplir le tube reliant cette chambre avec la chambre de sédimentation, en veillant qu'il n'y a pas de grosses bulles, car ils pourraient perturber le gradient. Presser ou effleurant le tube aide doucement pour enlever les bulles. Assurez-vous que tout le tampon de Krebs est dans le tube et pas dans la chambre de cellule.
  11. Laissez une petite quantité de tampon Krebs de s'écouler dans la chambre de sédimentation et puis égouttez presque tout le tampon dans le tube de fractionnement cellulaire afin de remplir le tube et enlever les grosses bulles.
  12. Placer le collecteur de fractions, directement sous la chambre de sédimentation. Assurez-vous que tous les tubes de fractions sont en place et recouverts d'une pellicule de plastique pour éviter la contamination.

2. Isoler les cellules de la spermatogenèse de testicules entiers

Disséquer les testicules de ca 12 souris adultes (de préférence au moins huit semaines) et les placer dans un tampon de Krebs à la température ambiante pour laver toute matière contaminante. Ce protocole est démontré implique l'utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec les lignes directrices de l'Université de Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux en Pennsylvanie.
  • Ajouter 45 mg de collagénase à 50 ml de tampon Krebs dans un tube conique juste avant vous avez l'intention d'ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques.
  • Décapsuler les testicules dans une plaque séparée contenant 8 ml de tampon Krebs, en rejetant la tunique albuginée et libérer les tubules séminifères. La tunique albuginée est la fine membrane qui entoure les tubes séminifères. Les tubes devraient facilement se détacher de l'albuginée. Pour ce faire, faire une incision dans la tunique albuginée, maintenez cette membrane avec une pair des forceps, et pousser les tubes et hors de l'écart de la membrane avec une autre paire de forceps.
  • Ajouter 4 ml de tampon de Krebs contenant les tubules à chaque tube conique contenant 25 ml de solution de collagénase et incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min. A la fin, les tubules devraient avoir une apparence «spaghetti-comme".
  • Laisser les tubules se déposer pendant environ 5 min à la partie inférieure du tube. Verser le surnageant et laver 2x dans 25 ml de tampon Krebs (à température ambiante), ce qui permet les tubules de se déposer au fond du tube à chaque fois. Ajouter 5 ml de tampon Krebs ~ dans chaque tube.
  • Bien laver, ajouter 30 mg de trypsine à 50 ml de tampon Krebs dans un tube falcon juste avant vous avez l'intention d'ajouter les tubules séminifères. Laisser cette solution se réchauffer à 33 ° C pendant quelques minutes. Répartis également en deux tubes de 50 ml coniques.
  • Ajouter 25 ml de solution de trypsine à chacun des deux tubes contenant les tubules. Ajouter 3 pg DNAse (1 μg/10ml) à chaque tube pour éviter cellules à partir de l'agglutination. Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant 10 min.
  • Utiliser une pipette de grand calibre pour agiter la solution contenant les tubes, les pipetage dans et hors d'environ 10x. La solution devrait commencer à ressembler davantage à une suspension cellulaire unique.
  • Incuber, en agitant, à 33 ° C pendant encore 10 min. Utiliser une pipette de grand calibre pour disperser les tubules dans une suspension de cellules individuelles, les pipetage dans et hors d'environ 25x. Si vous voyez encore beaucoup de tubes ou amas de cellules, disperser plus avec la pipette et / ou ajouter un autre 3 pg DNAse à chaque tube (concentration initiale double).
  • On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille 100 um (un pour chaque tube de 30 ml de suspension cellulaire). Combiner les suspensions cellulaires et de compter le nombre total de cellules (qui devrait être entre 7-8 x 10 8 cellules). *** NE PAS charger plus de 800 000 000 cellules sur le gradient.
  • Sur la base du nombre de cellules obtenu à l'étape 2.10, le culot approprle volume iate de cellules filtrées à 450 rcf pendant 5 minutes et laver avec 30 ml de tampon Krebs. Répétez. Habituellement *** 22 testicules vont produire plus de 800 000 000 cellules, mais ne chargez pas plus de ce nombre de cellules.
  • Remettre en suspension les cellules avec précaution dans 25 ml de 0,5% de BSA contenant entre 2,5 et 5 pg de DNAse (en fonction du degré d'agglutination cellulaire) sans créer de bulles. Assurez-vous que les cellules ne se collent pas. On filtre la suspension de cellules individuelles à travers un tamis de maille de 100 um. Les cellules sont maintenant prêts à charger. Mélangez bien avant le chargement en inversant le tube plusieurs fois.
  • 3. Cellule de chargement et de sédimentation

    1. Assurez-vous que le robinet d'arrêt est fermée, mais dans la position qui permet au liquide de s'écouler de la chambre de cellule (figure 1A) dans la chambre de sédimentation (Figure 1D).
    2. Tournez les deux plaques de barres d'agitation sur un réglage bas (environ 70 min) pour permettre aux barres d'agitation pour se déplacer en permanence, mais lentement.
    3. Verser la suspension de cellules dans la chambre de cellule (figure 1A) et d'ouvrir le robinet d'arrêt de telle sorte que les cellules s'écoulent lentement dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min (figure 1D). Fermer le robinet. Le débit peut être déterminé par le marquage des intervalles de volume de la chambre de sédimentation.
    4. Verser 5 ml de solution de BSA à 0,5% dans la chambre de cellule et de s'écouler dans la chambre de sédimentation à un débit de 10 ml / min. Fermer le robinet. Cette étape de lavage des cellules en dehors de la chambre de cellule. Répétez 4x.
    5. Préparer le gradient: ouvrir les pinces entre la chambre à cellules (Figure 1A) et les deux cylindres 2 L (Figure 1B et C), et de commencer à vider le liquide dans la chambre de décantation à un débit de 40 ml / min (figure 1D) immédiatement. Ajuster le débit d'écoulement de sorte qu'il faut environ 20 à 30 min pour charger le gradient de BSA dans la chambre de sédimentation. Une mince couche de cellules intactes située au-dessus de laBSA gradient doit être visible. Une fois la plupart des BSA est chargé, fermer le robinet et le tourner à la position qui permettra liquide s'écouler de la chambre de sédimentation dans le tube de fractionnement.
    6. Eteignez les plaques d'agitation.
    7. Laisser les cellules sédimenter pendant une heure et 45 minutes. NE TOUCHEZ PAS L'APPAREIL PENDANT CE TEMPS. Toute agitation mécanique pourrait perturber le gradient.

    4. Le fractionnement et l'analyse des fractions

    *** Lorsque vous effectuez les étapes suivantes, veillez à ne pas perturber le gradient. Si le gradient BSA est perturbé, la procédure ne fonctionnera pas!

    1. Une fois que les cellules ont sédimenté, vider lentement 50 ml de la chambre de sédimentation dans un tube conique de 50 ml et mettre de côté. Cette fraction contient généralement des amas de cellules non désirées et les débris.
    2. Fixez le tube de fraction vers le collecteur de fraction. *** Il est également possible de recueillir les fractions à la main si une fraction de collecteur n'est pas disponible.
    3. Recueillir des fractions: Régler le débit avec le robinet de sorte que 10 ml (remplissage d'un tube de collecte) sont recueillies toutes les 45 sec.
    4. Boucher les tubes de collecte de fraction et tourner pendant 5 min à 450 rcf à 4 ° C. Verser doucement le surnageant, remettre les cellules en liquide restant, et garder les cellules sur la glace.
    5. Une fois toutes les fractions sont recueillies, analyser au microscope les fractions de différentes populations cellulaires. Différents types de cellules peuvent être distingués en fonction de la taille des cellules et la morphologie nucléaire 8,15. Figure 2 illustre "des résultats représentatifs" pour les trois fractions rassemblées qui sont enrichies en cellules et les spermatogonies (a) somatiques et méiotiques, (b) spermatides rondes, et (c) allongement et condensation spermatides.
      • Tapez spermatogonies sont 12 14μm environ. de diamètre et ont des noyaux ronds qui sont homogènes en composition de la chromatine.
      • Spermatogonies de type B sont 8-9μm ca. de diamètre et ont rounnoyaux d qui montrent hétérochromatine plus dense le long de la périphérie du noyau.
      • Spermatocytes pré-leptotène sont 7,5 8.2μm ca. de diamètre, ont moins de cytoplasme de spermatogonies de type B, et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de type B spermatogonies.
      • Spermatocytes primaires sont leptotène 8-10 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes pré-leptotène, mais semblent gagner la chromatine plus dense à la membrane nucléaire.
      • Zygotene spermatocytes primaires sont 10-12 um ca. de diamètre et ont des noyaux qui ressemblent à ceux de spermatocytes primaires leptotène.
      • spermatocytes Pachytène sont partout de 12 à 18 um ca. de diamètre et sont constituées d'un mince rebord du cytoplasme entourant un gros noyau. Plus amas de chromatine dense peuvent être vus dans le noyau.
      • spermatides rondes sont de 10 um ca. de diamètre et ont un noyau rond avec une forte densité de coloration chromocentre au milieu.
      • Résiduelcorps sont ~ 6,5 m de diamètre, sont ronds, et n'ont pas de noyau.
      • D'allongement et condensation spermatides sont de taille similaire à arrondir spermatides, mais avoir un noyau unique, en forme de faucille.
      1. Commencez par fraction de 15 et d'analyser tous les cinq fractions jusqu'à 85. Habituellement, les fractions inférieures à 15 seront trop mixte et touffue, et les fractions supérieures à 85 contiennent peu ou pas de cellules utilisables.
      2. Pour analyser une fraction, prendre 5uL de liquide depuis le tube de collecte de fractions (une fois que les cellules ont été remises en suspension après centrifugation) et ajouter à 5uL de 8% de formaldehyde dans du tampon Krebs. Laisser les cellules fixées au repos à température ambiante pendant cinq minutes.
      3. Ajouter 5uL de 0,1% de Triton et DAPI (5 de tampon μ / ml de Krebs) pour les cellules fixes. Laisser les cellules au repos à température ambiante pendant 5 min.
      4. Placer 10 ul de la solution obtenue sur une lame, couvrir avec une lamelle, et d'analyser avec un microscope à fluorescence pour déterminer la pureté de chaque fraction.
      5. Combiner les fractions qui sont similaires en taille et la morphologie nucléaire (voir «Les résultats représentatifs») pour créer les populations suivantes de cellules: les cellules diploïdes de la méiose et somatiques, spermatides rondes et condensation / montaison spermatides.

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    Le résultat idéal de la procédure STA-PUT est une séparation assez notable des cellules des testicules sur la base de la taille des cellules et de la densité. Alors que les cellules isolées à partir des testicules sont sédimentation à travers le gradient de BSA, plusieurs bandes distinctes de cellules peuvent être observées. Toutes les amas de cellules ont tendance à couler au fond de la pente et ne pas contaminer les autres fractions. Un peu plus haut sur la pente sera le grand cellules somatiques et méiotiques. Plus haut sur la pente sera toujours plus petits spermatides rondes. Au sommet de la pente sera condensée spermatides, le sperme, et contaminer des globules rouges (ceux-ci semblent être des petites cellules rondes sans noyau).

    Les fractions peuvent être analysés rapidement en utilisant une combinaison de lumière et microscopie en fluorescence (Figure 2) 15. Méiose, des spermatogonies, cellules diploïdes et somatiques sont les plus grandes cellules présentes dans les testicules et contiennent de grands noyaux que relati tachevement homogène avec DAPI. spermatides rondes sont plus petites cellules avec des noyaux plus petits ronds, généralement avec une coloration chromocentre vives. Condensation / montaison spermatides sont de petites cellules qui ressemblent souvent oblongue, comme si une petite queue se forme. Ces cellules sont plus petites, noyaux compacts qui se colorent brillamment avec DAPI et sont en forme de faucille. Une fois que les fractions de cellules sont combinés, la pureté peut être en outre déterminée par une analyse Western blot des lysats de cellules (Figure 3). Marqueurs ordinaires de cellules méiotiques sont les complexes synaptonémiques une SCP1 protéines et Sycp2 16. Marqueurs communs de condensation spermatides sont des protéines de transition (par exemple TP1) ou protamines 17.

    Bien que chaque terme STA-PUT peut être différente, les cellules habituellement méiose, les spermatogonies et les cellules diploïdes somatiques se trouvent dans les fractions ca. 25-40, spermatides rondes dans les fractions ca. 55-65, et condensation / montaison spermatides dans les fractions ca.65-75 En raison d'une petite différence de taille entre les cellules méiotiques / somatiques et spermatides rondes, fractions ca. 45-50 ont souvent un pourcentage encore plus de cellules méiotiques / somatiques et spermatides rondes. La coloration avec DAPI aidera à distinguer ces deux populations de cellules. Il ya moins de chevauchement de la spermatide ronde et condensation / montaison fractions spermatides en raison de la grande différence de taille entre ces deux populations de cellules. Habituellement, les fractions inférieures à 15 contiennent de nombreux grands amas de cellules et de fractions de plus de 85 contiendra quelques cellules et de nombreux corps résiduels, ou cytoplasme lié à la membrane qui est versé par les spermatides.

    Généralement, lorsque les cellules de ~ 22 testicules sont fractionnés à la procédure STA-PUT, il donne ca. 10 8 cellules / spermatogenèse de type cellulaire (cellules diploïdes méiose / somatiques, spermatides rondes, et de condensation / montaison spermatides). Les fractions qui sont combinés pour créer la population finale des cellules doivent être d'au moinsPur à 80% pour le type de cellules en question. Si vous ne voyez pas ce degré de pureté ou plus, il peut y avoir un problème avec la séparation des cellules ou le gradient BSA. Aussi, si il ya quelques cellules dans les 20 premières fractions et une abondance de cellules dans les fractions 80 +, ou si il ya une abondance de cellules dans les 20 premières fractions et guère dans les fractions 70 +, le temps de sédimentation doit encore être optimisé. S'il vous plaît voir la discussion des suggestions sur la façon de dépanner.

    Figure 1
    Figure 1. Mise en place du Dispositif STA-PUT: Une image schématique et réelle de l'appareil STA-PUT sont présentées. Toute la verrerie est relié par un tube en plastique, y compris le tube qui relie l'appareil vers le collecteur de fraction. Les flèches indiquent l'emplacement des pinces. A) chambre cellules de chargement, contient une barre d'agitation, B) 2 L cylindre pour 2% de BSA, contient une barre d'agitation; C) 2 L cylindre pour 4% de BSA; D) chambre de sédimentation; E) des plaques de Stir; F) Baffle;. G) Robinet Cliquez ici pour agrandir l'image .

    Figure 2

    Figure 2. Les populations de cellules obtenues à partir de la STA-PUT: fractions ont été combinées en trois populations distinctes de cellules: les cellules méiotiques et somatiques, spermatides rondes et condensation et allonger spermatides. Chaque population est coloré avec du DAPI pour montrer les différences dans la taille et la morphologie nucléaire. Contraste de phase imagerie traduit des différences de taille des cellules et la forme. Barre blanche représente 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

    _content "fo: keep-together.within page =" always "> Figure 3

    Figure 3. Les marqueurs de différentes populations de cellules obtenues à partir de la STA-PUT: des extraits de cellules entières ont été fabriqués à partir de chaque population de cellules représenté sur la figure 1 et l'analyse western blot a été réalisée pour montrer les différences d'expression de protéine pour chaque population.. Synaptonémal protéine complexe 1 (SCP1) est une protéine exprimée exclusivement lors de la méiose et se trouve enrichi dans les fractions de la méiose, tandis que la fraction de spermatide condensation est enrichie en protéines de transition 1 (PE1), une protéine exprimée à la fin de la spermiogenèse. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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    Discussion

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    Ceux qui étudient la spermatogenèse s'appuient sur ​​des modèles animaux pour des échantillons de cellules spermatiques, comme il n'existe pas encore un système de culture cellulaire fiable pour générer tous les types cellulaires de la spermatogenèse 3. Bien que les cellules spermatiques sont facilement collectées à partir des testicules entiers, seule une population mixte résulte. Cela pose un problème pour ceux qui souhaitent étudier les sous-types spécifiques de ces cellules, comme les cellules méiotiques, les spermatides rondes et spermatides condensation. Trois méthodes différentes sont actuellement utilisées pour séparer ces sous-types de cellules spermatiques: STA-PUT, FACS, et élutriation 6-13. Les deux dernières méthodes nécessitent l'accès à des pièces coûteuses de matériel: un trieur de cellules et une élutriateur, respectivement. Bien que le procédé donne FACS des populations très pures des différents types de cellules spermatiques, le processus prend six heures et il donne seulement 0,5 à 2,0 x 10 6 cellules par type de cellules par deux à trois testicules 11. Élutriation, comme la meth STA-PUTod, sépare les cellules basées sur la taille et la densité, mais exige l'accès à un élutriateur, qui est plus cher que l'appareil STA-PUT.

    La procédure STA-PUT utilise un gradient BSA simple de séparer les cellules spermatiques de différentes tailles avec un assez haut rendement (~ 10 8 cellules / population par ~ 22 testicules). Par rapport aux procédés FACS, la procédure STA-PUT donne plusieurs cellules / testicules et prend beaucoup moins de temps pour séparer les types de cellules. Par rapport à FACS et élutriation, la procédure STA-PUT est relativement simple et peu coûteuse. Le STA-PUT nécessite seulement une chambre froide ou un grand réfrigérateur et un ensemble de verrerie spécialisée, ce qui en fait une méthode idéale pour les laboratoires qui n'ont pas accès à un trieur de cellules ou élutriateur. Quand elle est réalisée correctement, le STA-PUT peut fournir une population pure à environ 90% de spermatides rondes ou spermatides condensation.

    La méthode STA-PUT est très utile, mais nécessite une optimisation à plusieurs étapes différentes, notamment sedimentation. Séparation sous-optimale de types de cellules peut être causée par plusieurs problèmes différents, la plupart liées au gradient BSA. Pour faire un gradient approprié, activer les barres d'agitation dans la chambre cellule de chargement et le 2 L cylindre maintenant la BSA 2% pendant que vous créez le gradient. Effacer aussi tous les tubes de bulles et de mettre la chicane en place dans la chambre de sédimentation avant de charger les cellules. La réduction du taux de la BSA de l'écoulement dans ou hors de la chambre de sédimentation peut être utile. Plus important encore, l'appareil STA-PUT doit pas être perturbé au cours de la création du gradient, la sédimentation, ou la collecte de fraction.

    Sous-optimale les rendements cellulaires peuvent être le résultat d'une quantité insuffisante / taille des testicules, de la séparation cellulaire inadéquate pendant le traitement de la collagénase / trypsine, et l'agglutination des cellules. Si l'on est incapable d'obtenir le nombre approprié de cellules de ce protocole STA-PUT en raison de l'utilisation de souris néonatales ou des génotypes qui produisent un petit nombre de cel spermatogenèsels, il peut être nécessaire d'utiliser plus d'animaux par STA-PUT ou pour commander une trousse STA-PUT verrerie optimisé pour les petits volumes et le nombre de cellules (disponible à partir de ProScience) 18. Pour obtenir un nombre optimal de cellules (700 à 800.000.000), utiliser au moins 11 souris mâles en âge de procréer, ancien idéalement au moins 8-9 semaines. Cependant, pas plus de 800 millions de cellules doivent être chargés dans un STA-PUT. Si les cellules ne sont pas dissociées en une suspension cellulaire unique, après traitement à la trypsine, la concentration de DNase peut être augmentée jusqu'à 1 mg / 5 ml de solution. DNAse est sensible à répéter des cycles de gel / dégel, et l'utilisation de DNAse fraîche à chaque fois se traduira par une dispersion plus efficace de tubules dans une suspension cellulaire unique. On peut utiliser une pipette de grand calibre pour aider briser amas de cellules avant de filtrer à travers une toile.

    Un aspect de la méthode STA-PUT qui nécessitera l'optimisation est la quantité de temps les cellules sont autorisés à sédimenter à travers le gradient BSA. Une heureet 45 min fonctionne généralement bien, mais ce délai peut varier d'un laboratoire à. Habituellement, les différentes couches de cellules peut être vu tout au long du gradient visuellement BSA. S'il ya peu de cellules dans les 20 premières fractions recueillies et une abondance de cellules dans les fractions 80 +, le temps de sédimentation peut avoir besoin d'être étendu. S'il n'y a trop de cellules au cours des 20 premières fractions recueillies et il ya une séparation insuffisante de types de cellules, le temps de sédimentation peut avoir besoin d'être abaissé.

    Les cellules acquis à la procédure STA-PUT peuvent être utilisés pour de nombreux types d'expériences. Le STA-PUT fournit ample matière à analyse Western blot, immunofluorescence, et l'analyse de l'ARN, bien que des expériences de biochimie à grande échelle peuvent nécessiter la combinaison de plusieurs matériaux différents passages STA-PUT. Lorsqu'ils sont séparés des autres types de cellules, les spermatides haploïdes peuvent être cultivées et soumises à la manipulation moléculaire in vitro pour jusqu'à trois jours, qui peut être plus facile que 19> in vivo. Les cellules obtenues avec le protocole STA-PUT décrit ont été cultivées pendant une journée, sans signe évident de contamination, mais si les cellules doivent être utilisées pendant de longues expériences de culture cellulaire, les équipements doivent être stérilisé avec de l'éthanol, les solutions doivent être stérilisées par filtration, et tout étapes avant la cellule de chargement et après le prélèvement de fractions doivent être effectuées dans une hotte de culture de tissu. En outre, les milieux de culture contenant des antibiotiques doit être utilisé. Le fait que le procédé STA-PUT ne nécessite pas la fixation de la cellule permet une procédure idéale pour des expériences qui nécessitent des cellules viables.

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    Disclosures

    Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents. Ce protocole est démontré implique l'utilisation de la souris de laboratoire et a été exécuté en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Animaux utilisés dans ce protocole sont maintenues sous la direction et l'approbation de l'Université de comité de protection et d'utilisation des animaux Pennsylvanie (IACUC protocole # 804284).

    Acknowledgments

    Cette recherche a été financée par le NIH subventions GM055360 de SLB et U54HD068157 de RGM. JMB a été pris en charge par la subvention de formation T32 génétique à l'Université de Pennsylvanie (GM008216).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BSA Affymetrix/USB 10857 100MG Alternate can be used.
    0.5%, 2%, and 4% BSA solutions Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
    KREBS (10x) 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
    KREBS (1x) Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
    Collagenase Sigma C9891-1G
    DNAse Sigma DNEP-5MG
    Trypsin Sigma T9201-1G
    DAPI Preference of researcher
    Triton-X100 Preference of researcher
    Formaldehyde (~37%) Preference of researcher
    TABLE 2: EQUIPMENT
    Equipment Company Catalog # Comments
    Complete STA-PUT apparatus ProScience Glass Shop STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
    10 μm mesh filter Fisherbrand 22363549
    Mouse dissection tools Preference of researcher
    14 ml round bottom fraction collection tubes with caps Preference of researcher
    Need approximately 100 tubes
    Fraction collector GE Healthcare Life Sciences Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 Alternate can be used.
    Microscope slides, cover glass Preference of researcher
    Light/Fluorescent Microscope Preference of researcher

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    References

    1. Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
    2. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
    3. Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
    4. Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
    5. Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
    6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
    7. Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
    8. Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
    9. Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
    10. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
    11. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
    12. Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
    13. Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
    14. Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
    15. Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
    16. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
    17. Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
    18. Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
    19. Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
    Séparation des types cellulaires de la spermatogenèse Utilisation STA-PUT vitesse de sédimentation
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    Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation. J. Vis. Exp. (80), e50648, doi:10.3791/50648 (2013).More

    Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation. J. Vis. Exp. (80), e50648, doi:10.3791/50648 (2013).

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