Summary
STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수 있습니다.
Abstract
포유류의 정자는 고환의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 현재, 체외에서 정자 형성 차별화 있도록 신뢰성있는 세포 배양 시스템은없고, 정자 형성 세포의 대부분의 생물학적 연구는 마우스와 쥐와 같은 동물 모델에서 조직 수확을 필요로합니다. 비 정자 형성 (간질, 세르 톨리, 골수, 상피 세포) 및 정자 형성 모두 (정조 세포, 정모 세포, 둥근 정자, 정자 및 정자를 응축) - - 고환은 많은 종류의 세포가 포함되어 있기 때문에 정자에 관련된 생물학적 메커니즘 연구를 분리해야 이들 상이한 세포 유형의 농축. 이 경우, 고환에서 - - 선형 BSA 그라데이션을 통해 STA-PUT 방법은 세포의 이종 집단의 분리를 허용한다. 개별 세포 유형은 CE에 따라 다른 침강 속도로 침강LL 사이즈, 및 다른 세포 유형의 농축 분획을 수거하고 추가 분석에 이용 될 수있다. STA-PUT 방법은 특정 셀 정렬 방법으로 수득 될 수있는 예를 들어 세포 유형의 고도로 순수한 분획물을 초래하지 않지만, 각 분획의 전체 세포의 더 높은 수율을 제공 않는다
(7 ~ 8 × 10 8 세포의 시작 인구에서 ~ 1 × 108 세포 / 정자 형성 세포 유형). 이 고수익 방법은 전문 유리를 필요로하고 형광 활성화 된 셀 분류기 (FACS) 또는 elutriator 같은 전문 장비에 대한 액세스가 제한 실험실을위한 이상적인 방법하고, 어떤 차가운 방이나 대형 냉장고에 수행 할 수 있습니다.
Introduction
포유류의 정자는 고환 1의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 간단히, 정액을 운반하는 가느 다란 분할의 상피 세포 근처에있는 정조 세포를 같은 줄기 후 감수 분열을 거쳐 정모 세포로 분화. 감수 분열이 완료되면, 그 결과 반수체 세포, 또는 원형 정자는 spermiogenesis, 세포질과 핵의 압축 흘림을 포함하는 분화 과정을 겪는다. 정자는 점차적으로 각각 편모를 개발하고 핵의 신장 및 응축을 받다, 길게 한 후 응축 정자를 생산. 최종 제품은 정소 세관 및 궁극적으로 더 성숙 부고환으로의 루멘 내로 방출되는 정자이다.
정자의 과정에서 특별한 호르몬 분자 조건에 의존하기 때문에고환은 정자의 전체 프로세스에 대한 신뢰할 수있는 체외 배양 시스템은 아직 2,3를 개발되지 않았습니다. 배양 방법은 줄기 세포에서 "원시 생식 세포 유사 세포"및 반수체, "라운드 spermatid 같은 세포"를 만들기 위해 개발되었지만, 이들 방법은 아직 이러한 세포를 다수 생성하여 저장 정자 형성 세포를 생산하는 데 실패 할 수 없다 유형 4.5. 다행히도, 정자 형성 세포 유형은 액체 구배로 분리 될 전체 정소로부터 얻어진 단일 세포 현탁액을 허용하는 크기가 상당히 다르다. STA-PUT 방법은 여기에 설명, 크기와 질량 6-9에 따라 정자 형성 세포를 분리하기 위해 선형 BSA의 그라데이션과 간단한 침을 사용합니다.
FACS 및 elutriation 10-13 : STA-PUT 방법은 정자 형성 세포 유형을 구분하는 다른 두 가지 가장 널리 사용되는 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. STA-PUT 장치는 ONL 필요전문 유리의 Y 여러 조각 추운 방이나 대형 냉장고에 조립. 따라서, 셀 소터 나 elutriator를 사용하는 것보다 덜 비싸다. 각 세포 집단의 순도는 FACS 11로 얻은만큼 높지는 않지만 STA-PUT 방법은, 세포 분류와 비교할 시간 프레임에서 FACS에 의해 분류 될 수있는 것보다 정소 당 세포의 높은 금액을 산출한다. 셀 (자기 활성화 된 셀 정렬, MACS)이 최근 성공적으로 혼합 고환 세포 인구에서 정조 세포의 농축을 위해 사용되어왔다, 그러나 14 마커 적절한 표면의 지식의 부족으로 인해 정모 세포 또는 정자를 분리하는 현재 적합하지 않은 자석 구슬을 이용하여 정렬. FACS 나 MACS 이상의 STA-PUT 방법의 또 다른 장점은 대부분 FACS 프로토콜과 대조적으로, 어떤 DNA 또는 염색 다른 타입을 필요로하지 않기 때문에 이후의 배양에 적합 가능한 세포를 분리 할 수있는 능력이다. L을 필요로 연구를위한정자 형성 세포 유형의 아게 수율은 ~ 90 %의 순도, STA-PUT 이상적인 방법입니다.
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Protocol
STA-PUT 프로토콜은 세 단계를 포함한다 : 1) 장치 및 시약의 설정, 전체 고환에서의 세포 현탁액 2) 준비, 3) 셀 로딩, 침강 및 분수 수집. 두 연구원의 팀에 의해 수행하는 경우, 프로토콜은 평균 8 시간이 소요된다.
1. STA-PUT의 장치를 설정한다 (그림 1)
수집의 방법을 선호하는 경우 *** STA-PUT 장치는 4 ° C 대형 냉장고 나 또한 일부 컬렉터를 수용 할 수있는 차가운 방에 배치해야합니다.
- 전에 (또는 적어도 몇 시간 전에) 당신이 방법을 수행 밤, 모든 장비 (특히 유리와 튜브)를 세척하고 70 % 에탄올로 소독. 완전도 1에 도시 된 바와 같이 장치를 조립하기 전에 장비를 건조 시키.
- 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C) 및 셀 로딩 챔버 (보안
- 셀 로딩 챔버에있는 작은 교반 막대 (그림 1A)와 2 % BSA를 포함 할 가장 왼쪽이 L 실린더에 큰 교반 막대 (그림 1B)를 놓습니다.
- 플랫폼 (그림 1D)에 2 L 침강 챔버를 놓습니다. 직접 침강 챔버 (도 1D)의 바닥에있는 개구부의 상부에 금속 배플 (도 1F)을 배치. 배플은 분수를 수집하는 동안 셀 그라데이션의 액체 및 중단의 소용돌이로 교반 방지 등이 중요하다. 침전 챔버의 상부에 뚜껑을 놓습니다.
- 삼방 스톱 콕 (도 1G)의 그라운드 글라스 조인트에 진공 그리스의 미량을 적용하면, SE의 아래쪽 콕 클램프dimentation 챔버, 스톱 콕 및 침강 실의 그라운드 글라스 조인트를 연결.
- 튜브와 코크의 오른쪽 콘센트에 셀 로딩 챔버 (그림 1A)를 연결합니다. 마개를 닫습니다.
- 마개의 왼쪽 콘센트에 세포 분별 튜브를 연결합니다. 분별 튜브의 개방 단부에 연결된 유리 파스퇴르 피펫으로 튜브의 조각을 포함한다. 작은 구멍 튜브의 조각은 유리 피펫의 좁은 끝 부분에 부착되어있다. 좁은 피펫은 분수를 수집하는 동안 세포 현탁액의 흐름을 제한합니다. 맨 아래에이 작은 튜브를 클램프.
- 2 L 크렙스 준비 (1X) 실험 (표 1)의 일을 버퍼. 그런 다음, 1X 레브 550 ml의 2 % BSA, 1X 레브에있는 550 ㎖의 4 % BSA 및 1X 크렙스에 50 ㎖의 0.5 % BSA를 준비합니다. 필터와 4 ° C.에 이러한 솔루션을 냉각
- 오른쪽 2 L 실린더 (그림 1C)의 4 % BSA 용액과 2 % BSA를 부어왼쪽 2 L 실린더 (그림 1B)의 솔루션을 제공합니다. 확인이 실린더를 연결하는 튜브에 큰 거품이 없는지 확인하십시오.
- 이러한 그라데이션을 방해 할 수로, 셀 로딩 챔버로 크렙스 버퍼를 따르고 있는지 더 큰 거품이 없다하고, 침전 챔버와이 챔버를 연결하는 튜브를 입력합니다. 압박 또는 튜브를 가볍게 치는 것은 부드럽게 거품을 제거하는 데 도움이됩니다. 크렙스 버퍼의 모든 튜브가 아닌 세포 실에 있는지 확인합니다.
- 크렙스 완충액 소량 침강 챔버 내로 유동하고 튜브를 채우고있는 큰 기포를 제거하기 위해 세포 분획 튜빙으로 거의 모든 버퍼를 배출되도록.
- 직접 침전 실 아래 부분 수집기를 놓습니다. 모든 분수 튜브가 제자리에 있고 오염을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 덮여 있는지 확인합니다.
2. 전체 고환에서 정자 형성 세포를 분리
3. 셀 로딩 및 침전
- 반드시 마개가 닫혀 있는지,하지만 액체가 침전 실 (그림 1D)에 셀 챔버 (그림 1A)로부터의 정보 흐름을 허용 할 위치에서 확인합니다.
- 낮은 설정 교반 막대가 지속적으로 이동 할 수 있도록 (약 70 RPM)에 모두 교반 막대 판을 돌려, 그러나 천천히.
- 셀 챔버 (도 1a)에 세포 현탁액을 넣고 세포를 10 ㎖ / 분 (도 1D)의 속도로 침강 챔버 내로 서서히 유동되도록 스톱 콕을 열어. 마개를 닫습니다. 유속은 침강 실에 체적 간격을 표시함으로써 결정될 수있다.
- 셀 챔버에 0.5 % BSA 용액 5 ㎖을 넣고 10 ㎖ / 분의 속도로 침강 챔버로 흘려. 마개를 닫습니다. 이 단계는 세포 챔버로부터 세포를 세척한다. 배를 반복합니다.
- 그라데이션을 준비 셀 챔버 (그림 1A)와 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C)의 클램프를 열고, 40 ㎖ / 분의 속도 (그림 1D)에서 침강 실에 액체를 배출하기 시작 즉시. 그것은 침전 챔버로 BSA 구배를로드하는 데 약 20 ~ 30 분 소요되도록 유량을 조절합니다. 상단에 거짓말 세포의 얇은, 흐트러 층BSA 그라데이션 볼 수 있어야합니다. BSA의 대부분이로드되면, 마개를 닫고 액체가 분별 튜브에 침전 챔버에서 배출 할 수 있도록 위치로 돌립니다.
- 볶음 판을 끕니다.
- 세포가 1 시간 45 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이 시간 동안 장치를 방해하지 않습니다. 기계적 교반 그라데이션을 방해 할 수 있습니다.
4. 분수의 분류 및 분석
다음 단계를 수행 ***, 그라데이션을 방해하지 않도록주의하십시오. BSA 구배 방해가되는 경우, 절차는 작동하지 않을 것이다!
- 세포가 침전 한 후, 천천히 50 ML 원뿔 튜브에 침전 실에서 50 ㎖를 배출하고 따로 설정합니다. 이 부분은 일반적으로 세포와 파편의 원치 않는 덩어리가 포함되어 있습니다.
- 분수의 집에 분수 튜브를 연결합니다. *** 그것은 손으로 분수를 수집 할 수도 있습니다 경우 분수 콜레ctor에 사용할 수 없습니다.
- 분수를 수집 : 10 ㎖ (한 포집 관을 채우는)가 매 45 초를 수집되도록 꼭지와 유량을 조절합니다.
- 분수 수집 관을 씌우고 4 ℃에서 450 RCF에서 5 분 동안 회전 조심스럽게 뜨는을 붓고 나머지 액체에 세포를 재현 탁하고, 얼음에 세포를 유지.
- 모든 분수가 수집되면, 현미경으로 다른 세포 집단의 분수를 분석 할 수 있습니다. 상이한 세포 유형은 세포의 크기 및 핵 형태학 8,15 기반으로 구별 될 수있다. 2 (a) 체세포와 감수 세포 정조 세포에 대해 충실 세 풀링 된 분획은 "대표 결과", (b) 라운드 정자 등을 도시하는데,도 (C) 길게과 정자를 응축.
- 정조 세포 유형은 12-14μm 캘리포니아입니다. 직경 및 염색질 조성 동질 둥근 핵이있다.
- B 형 정조 세포는 8 9μm 캘리포니아입니다. 직경과 둥근 목 한핵 주변을 따라 더 밀도가 이질 염색질을 보여 D 핵.
- 사전 leptotene의 정모 세포는 7.5-8.2μm 캘리포니아입니다. 직경, B 형 정조 세포보다 세포질을 가지고 있고, B 형 정조 세포와 유사한 모양의 핵이있다.
- Leptotene 차 정모 세포는 8 ~ 10 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 사전 leptotene의 정모 세포의 것과 유사하지만, 핵 막에 더 조밀 한 염색질을 얻을 것 같다 핵이있다.
- 접합기에 이어지는시기로 차 정모 세포는 10 ~ 12 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 leptotene 차 정모 세포의 것과 유사 핵이있다.
- Pachytene의 정모 세포 어디서나 12 ~ 18 μm의 캘리포니아에서입니다. 직경과 큰 핵 주변 세포질의 얇은 테두리로 구성되어 있습니다. 조밀 염색질 이상의 덩어리가 핵에서 볼 수있다.
- 원형 정자는 10 ㎛ 캘리포니아입니다. 직경이 중간에 밀집 염색 chromocenter 라운드 핵이있다.
- 잔여체는 직경이 6.5 μm의 원형이며, 핵이 부족 ~하다.
- 길게 및 응축 정자는 정자를 둥글게 크기가 비슷하지만, 고유, 낫 모양의 핵이있다.
- 분수 15로 시작하는 85까지 매 5 분수를 분석 할 수 있습니다. 보통, 15 이하 분수도 혼합 덩어리 진 것입니다, 그리고 85 위의 분수없이 사용할 수있는 세포에 몇 가지를 포함합니다.
- 분수 수집 관 (세포를 원심 분리 후 재 부유 한 후)에서 액체의 5UL을 가지고 크렙스 버퍼에 8 %의 포름 알데히드의 5UL에 추가 부분을 분석 할 수 있습니다. 고정 된 세포는 실온에서 5 분 앉아 할 수 있습니다.
- 고정 된 세포에 0.1 % 트리톤과 DAPI (5 μ / ㎖ 크렙스 버퍼)의 5UL를 추가합니다. 세포를 5 분 동안 실온에서 앉을 수있다.
- 슬라이드 상에 생성 된 용액 10 μl를 놓고 커버 슬립으로 덮고, 각 분획의 순도를 결정하기 위하여 형광 현미경으로 분석한다.
- 감수 분열과 체세포 이배체 세포, 둥근 정자, 그리고 길게 / 응축 정자 : 크기와 핵 형태에서 유사 세포의 다음 인구를 만들 수있는 ( "대표 결과"참조) 분수를 결합합니다.
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Representative Results
STA-PUT 절차에서 이상적인 결과는 셀의 크기 및 밀도에 기초하여 세포의 고환에서 상당히 눈에 띄는 박리이다. 정소로부터 격리 세포 BSA 그라데이션을 통해 침전되는 동안, 셀들의 몇몇 뚜렷한 밴드가 관찰 될 수있다. 세포 덩어리는 상관 그라데이션의 바닥에 가라 그리고 다른 분획을 오염되지 경향이있다. 좀 더 그라데이션까지 대형 체세포 및 감수 세포 될 것입니다. 멀리 그라데이션까지 아직도 작은 원형 정자 될 것입니다. 그라데이션의 상단이 정자, 정자, 적혈구 오염을 응축됩니다에서 (이 핵없이 작은 원형 세포로 나타납니다).
분수는 빛과 형광 현미경의 조합 (그림 2) (15)를 사용하여 신속하게 분석 할 수 있습니다. 감수,의 정원, 체세포 이배체 세포는 고환에있는 가장 큰 세포이며, 큰 핵에게 그 얼룩 relati를 포함합니다되었습니다 Vely 균일 DAPI와. 원형 정자는 일반적으로 밝게 염색 chromocenter으로, 작은 둥근 핵을 가진 작은 세포입니다. 길게 / 응축 정자는 작은 꼬리를 형성하는 것처럼 자주, 직사각형 모양의 작은 세포입니다. 이 세포는 DAPI로 밝게 염색과 낫 모양의 더 작은, 소형 핵이있다. 세포 분획이 결합되면, 순도는 더 세포 용 해물의 웨스턴 블롯 분석 (그림 3)에 의해 결정될 수있다. 감수 세포의 일반적인 마커 synaptonemal 복잡한 1 단백질 SCP1 및 Sycp2 16입니다. 정자를 응축의 일반적인 마커 전이 단백질 (예 TP1) 또는 protamines 17입니다.
각 STA-PUT 실행은 다를 수 있지만, 일반적으로 감수 세포, 정조 세포와 체세포 이배체 세포 분수 라운드 정자가 주. 55 ~ 65. 분수 캘리포니아에있는 25 ~ 40를 찾을 수, 분수 캘리포니아에있는 정자를 길게 / 응축.체세포 / 감수 세포와 원형 정자 사이의 크기의 작은 차이로 인해 65 ~ 75, 분획물. 45 ~ 50은 종종 신체적 / 감수 세포와 원형 정자의 비율도이 주. DAPI로 염색하여 세포의 두 집단을 구분하는 데 도움이 될 것입니다. 적은 라운드 spermatid의 중복 인해 세포의 두 집단 사이의 크기에서 큰 차이 spermatid 분수를 길게 / 응축이있다. 보통, 15 이하 분수 85 위 세포와 분수의 많은 큰 덩어리를 포함하는 것이다 몇 가지 세포와 많은 잔류 기관, 또는 정자가 흘렸다 막 바인딩 세포질이 포함됩니다.
~ 22 고환의 세포가 STA-PUT 절차에 분류 된 경우 일반적으로, 그것은 캘리포니아를 얻을 수 있습니다. / 정자 형성 세포 유형 (감수 / 체세포 이배체 세포, 둥근 정자, 그리고 길게 / 응축 정자) 10 8 세포. 세포의 최종 인구를 만들 결합되어 분수는 최소한이어야한다해당 셀의 유형에 대한 순수한 80 %. 당신은 순도 이상이 학위가 표시되지 않는 경우, 세포 분리 또는 BSA의 그라데이션에 문제가있을 수 있습니다. 또한, 몇 가지 제 20 분획 세포 분수 세포의 풍부가있는 경우 80 +, 또는이 세포의 풍부가 처음 20 분수에 있고 거의 모든 분수 70 +, 침강 시간은 더 할 필요가없는 경우 최적화. 방법에 문제가 촬영에에 대한 제안 설명을 참조하시기 바랍니다.
그림 1. STA-PUT 장치의 설계도와 실제 이미지가 표시됩니다 : STA-PUT 장치 설정. 모든 유리 제품은 분획 콜렉터에 장치를 연결하는 튜브 등 플라스틱 배관에 의해 접속된다. 화살표는 클램프의 위치를 나타냅니다. A) 셀 로딩 챔버, 교반 막대를 포함, B) 2 L 실린더 2 % BSA를 들어, 교반 막대를 포함, 4 % BSA에 대한 C) 2 L 실린더, D) 침전 실, E) 볶음 판, F) 배플;. G) 조절판 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. STA-PUT에서 얻은 세포 인구 : 감수 분열과 체세포, 원형 정자 및 정자를 응축 길게 : 분수는 세 개의 셀 별도의 집단으로 결합되었다. 각각의 인구는 핵의 크기와 형태의 차이를 보여 DAPI로 염색한다. 위상 콘트라스트 이미징은 세포의 크기와 모양의 차이를 전달한다. 흰색 막대는 10 μm의를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. STA-PUT에서 얻은 다른 세포 집단의 마커 : 전체 세포 추출물은 그림 1과 같이 각 세포 인구에서 만들어진 및 웨스턴 블롯 분석은 각 집단에 대한 단백질 발현의 차이를 표시 하였다.. Synaptonemal 복잡한 단백질 1 (SCP1)는 단백질이 세포의 감수 분열 동안 독점적으로 표현하고 응축 spermatid 분율이 전이 단백질 1 (TP1)에 충실하면서, 감수 분수에 충실 발견, 후반 spermiogenesis에 표현 된 단백질은. 더 보려면 여기를 클릭하십시오 이미지 .
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Discussion
신뢰할 수있는 세포 배양 시스템은 아직 모든 정자 형성 세포 유형 3을 생성하는 존재하지 않는 정자를 연구하는 사람들은 정자 형성 세포 샘플에 대한 동물 모델에 의존하고 있습니다. 정자 형성 세포가 쉽게 전체 고환에서 수집되어 있지만, 단지 혼합 인구가 발생합니다. 이는 감수 세포, 둥근 정자 및 응축 정자 등이 세포의 특정 아형을 공부하고자하는 사람들을위한 문제가있다. 세 가지 다른 방법은 현재 정자 형성 세포의 이러한 하위 유형을 구분하는 데 사용되는 : STA-PUT, FACS 및 elutriation 6-13. 각각의 셀 분류기 및 elutriator : 후자의 두 가지 방법은 장비의 비싼 조각에 대한 액세스를 필요로합니다. FACS 방법은 다른 정자 형성 세포 유형의 고순도의 개체군을 산출하더라도, 프로세스 6 시간 걸리고 2-3 고환 (11) 당 셀 분류 당 0.5-2.0 × 106 세포를 수득 하였다. STA-PUT 메타 같은 Elutriation,OD, 크기 및 밀도에 따라 세포를 분리하지만, STA-PUT 장치보다 비싼 elutriator에 액세스 할 수 있어야합니다.
STA-PUT 절차 (~ 22 고환 당 ~ 10 8 셀 / 인구) 상당히 높은 수율로 다양한 크기의 정자 형성 세포를 분리하는 간단한 BSA의 그라데이션을 사용합니다. FACS 방법을 기준으로, STA-PUT 절차는 이상의 셀 / 고환을 생성하고 세포 유형을 구분하기 위해 훨씬 적은 시간이 소요됩니다. FACS 및 elutriation에 비해, STA-PUT 절차는 비교적 간단하고 저렴하다. STA-PUT는 셀 분류기 또는 elutriator에 액세스하지 않고 실험실에 이상적인 방법을 만들기 만 냉장실 또는 대형 냉장고, 특수 유리의 집합이 필요합니다. 제대로 수행 할 때, STA-PUT은 원형 정자 또는 응축 정자의 약 90 % 순수 인구를 제공 할 수 있습니다.
STA-PUT 방법은 매우 유용하지만, 여러 단계의 최적화, 특히의를 필요로edimentation. 세포 유형의 차선 분리는 여러 가지 문제가 가장 BSA 구배 관련 의해 야기 될 수있다. 적절한 그라데이션을 만들려면, 셀 로딩 챔버의 교반 막대 및 그라데이션을 만드는 동안 2 % BSA를 들고 2 L 실린더의 전원을 켭니다. 또한 모든 거품 튜브를 취소하고 세포를로드하기 전에 침전 실에서 장소에 배플을 넣어. 내부 또는 침강 챔버 밖으로 BSA의 유량을 줄이면 도울 수있다. 가장 중요한 것은, STA-PUT 장치는 그라데이션, 침전, 또는 분수 모음을 만드는 동안 방해 할 수 없습니다.
하위 최적의 세포 수율은 고환의 수가 부족 / 크기, 콜라게나 / 트립신 처리 도중 부적절한 세포 분리, 세포 응집의 결과가 될 수 있습니다. 하나 때문에 정자 형성 CEL의 작은 숫자를 생성 신생아 마우스 또는 유전자형의 사용이 STA-PUT 프로토콜에 대한 세포의 적절한 수를 얻을 수없는 경우LS, 그것은 STA-PUT 당 더 많은 동물을 사용하거나 (ProScience에서 구입 가능) 작은 볼륨과 세포 수에 최적화 된 STA-PUT 유리 키트 18를 주문해야 할 수도 있습니다. 세포의 최적의 번호 (700-800000000)을 얻으려면, 이상적으로 적어도 8~9주 된 생식 연령의 최소한 11 수컷 마우스를 사용합니다. 그러나, 더 이상 8 억 이상 세포는 하나의 STA-PUT에로드해야합니다. 세포를 트립신 처리 후 단세포 현탁액으로 해리되지 않은 경우, DNase의 농도는 1 ㎍ / ㎖의 용액을 5 개까지 증가 될 수있다. DNase의 동결 / 해동과마다 단일 세포 현탁액으로 세뇨관의 더 효과적인 분산을 초래할 것이다 신선한 DNA 분해 효소를 사용하여 사이클을 반복하게 민감하다. 하나는 메쉬를 통해 필터링하기 전에 세포 덩어리를 분열하는 데 도움이 넓은 구멍 피펫을 사용할 수 있습니다.
최적화를 필요 STA-PUT 방법의 한 측면은 세포 BSA 구배 통해 침강 허용되는 시간의 양이다. 한 시간45 분은 일반적으로 잘 작동하지만, 이번에는 실험실에 실험실과 다를 수 있습니다. 통상적으로, 세포의 다른 층은 BSA 구배에 걸쳐 시각적으로 볼 수있다. 몇 수집 제 20 분획의 세포 분획을 80 + 세포의 풍부가되는 경우, 침강 시간은 연장 될 필요가있다. 너무 많은 세포 채집 제 20 분획에 존재하고 세포 유형의 분리가 불충분 한 경우, 침강 시간은 감소 될 필요가있다.
STA-PUT 절차를 취득한 세포는 실험의 다양한 종류를 위해 사용될 수있다. 대규모 생화학 실험은 여러 가지 STA-PUT 실행 자료를 조합이 필요할 수 있지만, STA-PUT은 서양 얼룩 분석, 면역 및 RNA 분석을위한 충분한 자료를 제공합니다. 다른 종류의 세포에서 분리 할 때, 반수체 정자보다 쉽게 할 수 있습니다까지 사흘 동안 배양 및 생체 분자 조작을 실시 할 수있다
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 설명하는이 프로토콜은 실험실 생쥐의 사용을 포함하고 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 이 프로토콜에 사용되는 동물은 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC 프로토콜 # 804284)의지도와 승인 아래에 유지됩니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 SLB에 GM055360와 RGM에 U54HD068157에 의해 지원되었다. JMB는 펜실베니아 대학 (GM008216)에서 T32 유전학 교육 그랜트에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).
- Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis. Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146, 519-532 (2011).
- Easley, C. A., et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2, 440-446 (2012).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Miller, R. G., Phillips, R. A. Separation of cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602- (2011).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting. Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).
- Bellve, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).
- Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations. Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).
- Manku, G., Mazer, M., Culty, M. Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis. Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).
- Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation. Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).
