Summary
एसटीए डाल विधि आकार और घनत्व के आधार पर spermatogenic कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के अलग होने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
स्तनधारी शुक्राणुजनन वृषण के बीजदार tubules में कई चरणों में होता है कि एक जटिल भेदभाव प्रक्रिया है. वर्तमान में, वहाँ के लिए इन विट्रो में spermatogenic भेदभाव की अनुमति के लिए कोई विश्वसनीय सेल संस्कृति प्रणाली है, और spermatogenic कोशिकाओं की सबसे जैविक पढ़ाई माउस और चूहे की तरह पशु मॉडल से ऊतक फसल की आवश्यकता होती है. गैर spermatogenic (Leydig, Sertoli, माइलॉयड, और उपकला कोशिकाओं) और spermatogenic दोनों (spermatogonia, spermatocytes, गोल spermatids, spermatids और शुक्राणु संघनक) - - वृषण कई प्रकार की कोशिकाओं क्योंकि इसमें शुक्राणुजनन में शामिल जैविक तंत्र के अध्ययन के अलगाव की आवश्यकता और इन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के संवर्धन. इस मामले में, वृषण - से - एक रेखीय बीएसए ढाल के माध्यम से एसटीए डाल विधि कोशिकाओं की एक विषम आबादी के अलग होने के लिए अनुमति देता है. व्यक्तिगत सेल प्रकार CE के अनुसार अलग अवसादन वेग के साथ तलछटएल एल आकार, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए समृद्ध भिन्न एकत्र की है और आगे के विश्लेषण में उपयोग किया जा सकता है. एसटीए डाल विधि निश्चित सेल छँटाई तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता है उदाहरण के रूप में सेल प्रकार की अत्यधिक शुद्ध भिन्न, में परिणाम नहीं करता है, यह प्रत्येक अंश में कुल कोशिकाओं का एक बहुत उच्च उपज प्रदान करता है
(7-8 एक्स 10 8 कोशिकाओं का एक प्रारंभिक आबादी से ~ 1 x 10 8 कोशिकाओं / spermatogenic सेल प्रकार). इस उच्च उपज पद्धति केवल विशेष कांच के बने पदार्थ की आवश्यकता है और यह एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) या elutriator जैसे विशेष उपकरणों के लिए सीमित उपयोग किया है कि प्रयोगशालाओं के लिए एक आदर्श तरीका है, जिससे किसी भी ठंडे कमरे या बड़े फ्रिज में प्रदर्शन किया जा सकता है.
Introduction
स्तनधारी शुक्राणुजनन वृषण 1 के बीजदार tubules में कई चरणों में होता है कि एक जटिल भेदभाव प्रक्रिया है. संक्षेप में, बीजदार छोटी नली विभाजन की उपकला के पास रहते हैं कि spermatogonia तरह स्टेम और फिर meiotic डिवीजनों से गुजरना जो spermatocytes, में अंतर. अर्धसूत्रीविभाजन बाद पूरा हो गया है, जिसके परिणामस्वरूप अगुणित कोशिकाओं, या दौर spermatids, spermiogenesis, cytoplasm और नाभिक के संघनन से बहा शामिल है कि एक भेदभाव प्रक्रिया से गुजरना. Spermatids धीरे - धीरे क्रमशः, एक कशाभिका विकसित और नाभिक के बढ़ाव और संक्षेपण गुजरना, elongating और फिर संघनक spermatids का निर्माण किया. अंत उत्पादों बीजदार छोटी नली और अंततः वे आगे परिपक्व जहां अधिवृषण में की लुमेन में जारी किया जाता है जो शुक्राणु, कर रहे हैं.
शुक्राणुजनन की प्रक्रिया में विशेष हार्मोनल और आणविक स्थितियों पर निर्भर करता है क्योंकिवृषण, शुक्राणुजनन की पूरी प्रक्रिया के लिए एक विश्वसनीय में इन विट्रो संस्कृति प्रणाली अभी तक 2,3 विकसित नहीं किया गया है. संस्कृति तरीकों स्टेम सेल से "मौलिक रोगाणु सेल कोशिकाओं की तरह" और अगुणित, "दौर spermatid कोशिकाओं की तरह" बनाने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इन तरीकों अभी तक इन कोशिकाओं की बड़ी संख्या पैदा करते हैं और बाद में spermatogenic सेल का उत्पादन करने में विफल करने में सक्षम नहीं हैं प्रकार 4,5. सौभाग्य से, spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं के एक तरल ढाल के साथ अलग होने की पूरी वृषण से प्राप्त एक एकल कक्ष निलंबन के लिए अनुमति देता है, जो आकार में काफी मतभेद है. एसटीए डाल विधि, यहाँ का प्रदर्शन, आकार और द्रव्यमान 6-9 पर आधारित spermatogenic कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक रेखीय बीएसए ढाल और सरल अवसादन का उपयोग करता है.
FACS और धावन 10-13: एसटीए डाल विधि spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए अन्य दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल के तरीकों पर कई फायदे हैं. एसटीए डाल तंत्र onl आवश्यकताविशेष कांच के बने पदार्थ के y कई टुकड़े एक ठंडे कमरे या बड़े फ्रिज में इकट्ठे हुए. इस प्रकार, यह एक सेल सॉर्टर या एक elutriator उपयोग करने की तुलना में कम खर्चीला है. प्रत्येक सेल आबादी की पवित्रता FACS 11 के साथ प्राप्त उन लोगों के रूप में अधिक नहीं है, हालांकि एसटीए डाल विधि, सेल प्रकार और एक तुलनीय समय सीमा में FACS द्वारा हल किया जा सकता से वृषण प्रति कोशिकाओं की उच्च मात्रा में पैदावार. सेल (चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई, एमएसीएस) ने हाल ही में सफलतापूर्वक एक मिश्रित वृषण सेल की आबादी से spermatogonia के संवर्धन के लिए नियोजित किया गया है, लेकिन यह 14 मार्करों उपयुक्त सतह के ज्ञान की कमी के कारण spermatocytes या spermatids को अलग करने के लिए वर्तमान में अनुपयुक्त है चुंबकीय मोतियों का उपयोग छँटाई. FACS या एमएसीएस अधिक एसटीए डाल विधि का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि सबसे FACS प्रोटोकॉल के विपरीत, यह किसी भी डीएनए या धुंधला अन्य प्रकार की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि बाद में संस्कृति के लिए उपयुक्त व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता है. एल की आवश्यकता है कि पढ़ाई के लिएspermatogenic कक्षों प्रकार की arge पैदावार ~ 90% शुद्धता पर, एसटीए डाल एक आदर्श तरीका है.
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Protocol
एसटीए डाल प्रोटोकॉल तीन चरणों शामिल है: 1) उपकरण और अभिकर्मकों के सेट करें, पूरी वृषण से सेल निलंबन के 2) तैयार करना, और 3) सेल लोड हो रहा है, अवसादन, और अंश संग्रह. दो शोधकर्ताओं की एक टीम ने प्रदर्शन किया, प्रोटोकॉल औसतन आठ घंटे लगते हैं.
1. एसटीए डाल उपकरण की स्थापना (चित्रा 1)
संग्रह की कि विधि पसंद किया जाता है अगर *** एसटीए डाल तंत्र, एक 4 डिग्री सेल्सियस बड़े रेफ्रिजरेटर या भी एक अंश कलेक्टर को समायोजित कर सकते हैं कि एक ठंडे कमरे में रखा जाना चाहिए.
- पहले (या कम से कम कुछ घंटे पहले) आप विधि प्रदर्शन रात, सभी उपकरणों (विशेष रूप से कांच के बने पदार्थ और ट्यूबिंग) धोने और 70% इथेनॉल के साथ बाँझ. पूरी तरह से चित्र 1 में सचित्र रूप में तंत्र कोडांतरण से पहले उपकरण सूखी हैं.
- दो 2 एल सिलेंडर (आंकड़े 1 बी और सी) और सेल लोड हो रहा है चैम्बर (सुरक्षित
- सेल लोडिंग कक्ष में एक छोटी सी हलचल पट्टी (चित्रा 1 ए) और 2% बीएसए शामिल होंगे कि बाएं सबसे एल 2 सिलेंडर में एक बड़ा हलचल पट्टी (चित्रा 1 बी) रखें.
- मंच (चित्रा -1) पर 2 एल अवसादन चैम्बर रखें. सीधे अवसादन कक्ष (चित्रा -1) के तल में खोलने के शीर्ष पर धातु बाधक (चित्रा 1F) रखें. भ्रमित अंश संग्रह के दौरान सेल ढाल के तरल और विघटन की vortexing से बचाता है, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है. अवसादन चैम्बर के शीर्ष पर ढक्कन रखें.
- तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी (चित्रा 1G) की जमीन कांच संयुक्त करने के लिए वैक्यूम तेल की एक बहुत छोटी राशि लागू करने के बाद, सेवा क्षेत्र की तह तक पानी निकलने की टोंटी दबानाdimentation कक्ष, पानी निकलने की टोंटी और अवसादन चैम्बर की जमीन गिलास जोड़ों को जोड़ने.
- ट्यूबिंग साथ पानी निकलने की टोंटी की सही आउटलेट के लिए सेल लोडिंग कक्ष (चित्रा 1 ए) कनेक्ट. पानी निकलने की टोंटी बंद करें.
- पानी निकलने की टोंटी की बाईं आउटलेट के लिए सेल fractionation ट्यूबिंग देते हैं. विभाजन ट्यूबिंग खुले अंत से जुड़ा एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ ट्यूबिंग का एक टुकड़ा शामिल हैं. छोटे बोर टयूबिंग की एक टुकड़ा ग्लास विंदुक की संकीर्ण अंत से जुड़ा हुआ है. संकीर्ण पिपेट अंश एकत्र करने के दौरान सेल निलंबन का प्रवाह सीमित. बहुत नीचे इस छोटे से ट्यूब बंद करना.
- 2 एल क्रेब्स तैयार (1x) प्रयोग (तालिका 1) के दिन बफर. फिर, 1x क्रेब्स में 550 मिलीलीटर में 2% बीएसए, 1x क्रेब्स में 550 मिलीलीटर 4% बीएसए, और 1x क्रेब्स में 50 मिलीलीटर 0.5% BSA तैयार करते हैं. फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस तक इन समाधान शांत
- सही एल 2 सिलेंडर (चित्रा 1C) में 4% BSA समाधान और 2% बीएसए डालोछोड़ा एल 2 सिलेंडर (चित्रा 1 बी) में समाधान. सुनिश्चित करें कि इन सिलेंडरों को जोड़ता है कि ट्यूबिंग में कोई बड़े बुलबुले हैं.
- इन ढाल को परेशान कर सकता है, के रूप में सेल लोड हो रहा चेंबर में क्रेब्स बफर डालो और सुनिश्चित करें कि कोई बड़े बुलबुले हैं, जिससे अवसादन कक्ष के साथ इस कक्ष को जोड़ने ट्यूबिंग भरें. निचोड़ या ट्यूबिंग flicking धीरे बुलबुले को दूर करने में मदद करता है. क्रेब्स बफर के सभी ट्यूब में और न सेल चैम्बर में है सुनिश्चित करें.
- क्रेब्स बफर की एक छोटी राशि अवसादन चेंबर में प्रवाह और फिर ट्यूब भरने और किसी भी बड़े बुलबुले को दूर करने के क्रम में सेल fractionation ट्यूबिंग में लगभग सभी बफर पलायन करने देते.
- सीधे अवसादन चैम्बर के तहत अंश कलेक्टर रखें. सभी अंश ट्यूबों जगह में हैं और प्रदूषण को रोकने के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ कवर किया है कि सुनिश्चित करें.
2. पूरे वृषण से Spermatogenic कोशिकाओं को अलग
3. सेल लोड हो रहा है और अवसादन
- सुनिश्चित करें कि पानी निकलने की टोंटी बंद हो गया है कि, लेकिन तरल अवसादन कक्ष (चित्रा -1) में सेल कक्ष (चित्रा 1 ए) से प्रवाह करने की अनुमति होगी कि स्थिति में बनाओ.
- एक कम सेटिंग हलचल सलाखों लगातार स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देने के लिए (लगभग 70 आरपीएम) के लिए पर दोनों हलचल बार प्लेटों बारी है, लेकिन धीरे - धीरे.
- सेल कक्ष (चित्रा 1 ए) में सेल निलंबन डालो और कोशिकाओं 10 मिलीग्राम / मिनट (चित्रा -1) की दर से अवसादन चेंबर में धीरे धीरे प्रवाह इतना है कि पानी निकलने की टोंटी खोलते हैं. पानी निकलने की टोंटी बंद करें. प्रवाह दर अवसादन कक्ष पर मात्रा अंतराल अंकन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
- सेल चेंबर में 0.5% BSA समाधान के 5 मिलीलीटर डालो और 10 मिलीग्राम / मिनट की दर से अवसादन चेंबर में नाली. पानी निकलने की टोंटी बंद करें. यह कदम सेल चैंबर के बाहर की कोशिकाओं को धो देगा. 4x दोहराएँ.
- ढाल तैयार: सेल कक्ष (चित्रा 1 ए) और दो 2 एल सिलेंडर (चित्रा 1 बी और सी) के बीच clamps खोलें, और 40 मिलीग्राम / मिनट की दर (चित्रा -1) पर अवसादन चेंबर में तरल निकास के लिए शुरू तुरंत. यह अवसादन चेंबर में बीएसए ढाल लोड करने के लिए लगभग 20-30 मिनट लगते हैं तो प्रवाह दर को समायोजित करें. के शीर्ष पर झूठ बोल कोशिकाओं की एक पतली, अबाधित परतबीएसए ढाल दिखाई जानी चाहिए. बीएसए के सबसे भरी हुई है, एक बार पानी निकलने की टोंटी बंद और तरल fractionation ट्यूब में अवसादन कक्ष से पलायन करने की अनुमति देगा कि स्थिति को बदल जाते हैं.
- हलचल प्लेटें बंद करें.
- कोशिकाओं को एक घंटे और 45 मिनट के लिए तलछट की अनुमति दें. इस समय के दौरान उपकरण को परेशान मत करो. कोई यांत्रिक आंदोलन ढाल को परेशान कर सकता है.
4. भागों के विभाजन और विश्लेषण
आप निम्न चरणों को पूरा करने के रूप में ***, ढाल परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा. बीएसए ढाल परेशान है, प्रक्रिया काम नहीं करेगा!
- कोशिकाओं sedimented कर लेते हैं, धीरे - धीरे एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अवसादन चैम्बर से 50 मिलीलीटर नाली और रद्द करना. इस अंश आम तौर पर कोशिकाओं और मलबे की अवांछित clumps होता है.
- अंश कलेक्टर को अंश ट्यूब देते हैं. *** यह हाथ से भिन्न इकट्ठा करना भी संभव है अगर एक अंश Collector उपलब्ध नहीं है.
- भिन्न लीजिए: 10 मिलीलीटर (एक संग्रह ट्यूब भरना) हर 45 सेकंड एकत्र किया जाता है, ताकि पानी निकलने की टोंटी के साथ प्रवाह दर को समायोजित करें.
- अंश संग्रह ट्यूब कैप और 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 आरसीएफ में 5 मिनट के लिए स्पिन , धीरे सतह पर तैरनेवाला डालो शेष तरल में कोशिकाओं resuspend, और बर्फ पर कोशिकाओं रहते हैं.
- सभी भिन्न एकत्र कर रहे हैं एक बार, microscopically अलग सेल आबादी के लिए भिन्न विश्लेषण. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं सेल आकार और परमाणु आकारिकी 8,15 के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है. 2 (ए) दैहिक और meiotic कोशिकाओं और spermatogonia के लिए समृद्ध कर रहे हैं कि तीन जमा भागों के लिए "प्रतिनिधि परिणाम", (ख) दौर spermatids, और दिखाता है चित्रा (ग) elongating और spermatids संघनक.
- एक spermatogonia टाइप 12-14μm सीए हैं. व्यास में और chromatin संरचना में समरूप हैं कि गोल नाभिक है.
- ग्रुप बी spermatogonia 8 9μm सीए हैं. व्यास में और ROUN हैपरमाणु परिधि के साथ और अधिक सघन हेट्रोक्रोमैटिन चलता है कि डी नाभिक.
- पूर्व leptotene spermatocytes 7.5-8.2μm सीए हैं. व्यास में, प्रकार बी spermatogonia से कम कोशिका द्रव्य है, और प्रकार बी spermatogonia में उन लोगों के समान लग रही है कि नाभिक है.
- Leptotene प्राथमिक spermatocytes 8-10 माइक्रोन सीए हैं. व्यास में और पूर्व leptotene spermatocytes के समान लग रही है, लेकिन परमाणु झिल्ली में और अधिक सघन chromatin हासिल करने के लिए लग रहे हैं कि नाभिक है.
- Zygotene प्राथमिक spermatocytes 10-12 माइक्रोन सीए हैं. व्यास में और leptotene प्राथमिक spermatocytes के समान लग रही है कि नाभिक है.
- Pachytene spermatocytes कहीं भी 12-18 माइक्रोन सीए से कर रहे हैं. व्यास में और एक बड़े नाभिक आसपास कोशिका द्रव्य की एक पतली रिम से मिलकर. घने chromatin की अधिक गुच्छों के नाभिक में देखा जा सकता है.
- गोल spermatids 10 माइक्रोन सीए हैं. व्यास में और बीच में एक घनी धुंधला chromocenter साथ एक दौर नाभिक है.
- अवशिष्टशव व्यास में 6.5 माइक्रोन, गोल कर रहे हैं, और एक नाभिक कमी ~ हैं.
- Elongating और संघनक spermatids spermatids गोल करने के आकार में समान हैं, लेकिन एक अद्वितीय, दरांती आकार नाभिक है.
- अंश 15 से शुरू करें और 85 अप करने के लिए हर पांच अंशों का विश्लेषण. आमतौर पर, 15 से नीचे भिन्न भी मिश्रित और clumpy हो जाएगा, और 85 से ऊपर भिन्न कोई उपयोगी कोशिकाओं को कुछ शामिल होंगे.
- अंश संग्रह ट्यूब (कोशिकाओं Centrifugation के बाद resuspended किया गया है एक बार) से तरल के 5ul ले और क्रेब्स बफर में 8% formaldehyde के 5ul को जोड़ने के लिए, एक अंश का विश्लेषण करने के लिए. तय कोशिकाओं पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति.
- तय कोशिकाओं को 0.1% ट्राइटन और DAPI (5 μ / एमएल क्रेब्स बफर) के 5ul जोड़ें. कोशिकाओं 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति.
- एक स्लाइड पर जिसके परिणामस्वरूप समाधान के 10 μl जगह एक कवर पर्ची के साथ कवर, और प्रत्येक अंश की शुद्धता निर्धारित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ विश्लेषण.
- Meiotic और दैहिक द्विगुणित कोशिकाओं, गोल spermatids, और elongating / संघनक spermatids: आकार और परमाणु आकारिकी में समान हैं कोशिकाओं के निम्न आबादी बनाने के लिए ("प्रतिनिधि परिणाम" देखें) कि भिन्न जुडा है.
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Representative Results
एसटीए डाल प्रक्रिया से आदर्श परिणाम सेल आकार और घनत्व के आधार पर testes से कोशिकाओं के एक काफी ध्यान देने योग्य जुदाई है. वृषण से अलग कक्षों बीएसए ढाल के माध्यम से sedimenting कर रहे हैं, कोशिकाओं के कई अलग बैंड मनाया जा सकता है. कक्षों की कोई clumps ढाल के नीचे सिंक करने के लिए और अन्य अंशों को दूषित नहीं होगा करते हैं. एक छोटे से आगे ढाल ऊपर बड़े दैहिक और meiotic कोशिकाओं हो जाएगा. आगे ढाल ऊपर अभी भी छोटे दौर spermatids हो जाएगा. ढाल के शीर्ष spermatids, शुक्राणु, और लाल रक्त कोशिकाओं contaminating गाढ़ा हो जाएगा (ये एक नाभिक के बिना छोटे गोल कोशिकाओं होना दिखाई देते हैं).
Fractions प्रकाश और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन (चित्रा 2) 15 का उपयोग करते हुए जल्दी से विश्लेषण किया जा सकता है. Meiotic, spermatogonial, और दैहिक द्विगुणित कोशिकाओं वृषण में पाया सबसे बड़े कोशिकाओं रहे हैं और बड़े नाभिक कि दाग relati में शामिल होंगेvely एक ही ढंग से DAPI के साथ. गोल spermatids आम तौर पर एक चमकते धुंधला chromocenter साथ, छोटे दौर नाभिक के साथ छोटे कोशिकाओं रहे हैं. Elongating / संघनितजल spermatids एक छोटी पूंछ बनाने है मानो अक्सर, आयताकार देखो कि छोटे कोशिकाओं रहे हैं. इन कोशिकाओं को DAPI के साथ चमकीले दाग और एक दरांती तरह आकार रहे हैं कि छोटे, कॉम्पैक्ट नाभिक है. कक्ष भिन्न संयुक्त कर रहे हैं एक बार, पवित्रता आगे सेल lysates के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 3) के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Meiotic कोशिकाओं के सामान्य मार्कर synaptonemal जटिल 1 प्रोटीन Scp1 और Sycp2 16 हैं. Spermatids संघनक की आम मार्करों संक्रमण प्रोटीन (जैसे टीपी 1) या protamines 17 हैं.
प्रत्येक एसटीए डाल रन अलग हो सकता है, आमतौर पर meiotic कोशिकाओं, spermatogonia और दैहिक द्विगुणित कोशिकाओं भागों में दौर spermatids ca. 55-65,. भिन्न सीए में 25-40 पाया जाएगा, और भिन्न सीए में spermatids elongating / संघनक.दैहिक / meiotic कोशिकाओं और दौर spermatids के बीच आकार में एक छोटे अंतर के कारण 65-75, भिन्न. 45-50 अक्सर दैहिक / meiotic कोशिकाओं और दौर spermatids का एक भी प्रतिशत है ca. DAPI के साथ धुंधला कोशिकाओं के इन दो आबादी भेद करने में मदद मिलेगी. कम दौर spermatid के ओवरलैप और कारण कोशिकाओं के इन दो आबादी के बीच आकार में बड़ा फर्क को spermatid भिन्न elongating / संघनक है. आमतौर पर, 15 से नीचे भिन्न 85 से ऊपर की कोशिकाओं और भिन्न के कई बड़े clumps में शामिल होंगे कुछ कोशिकाओं और कई अवशिष्ट निकायों, या spermatids द्वारा बहाया है कि झिल्ली ही सीमित कोशिका द्रव्य में शामिल होंगे.
~ 22 testes से कोशिकाओं एसटीए डाल प्रक्रिया के साथ fractionated हैं जब आम तौर पर, यह सीए पैदावार. / Spermatogenic सेल प्रकार (meiotic / दैहिक द्विगुणित कोशिकाओं, गोल spermatids, और elongating / संघनक spermatids) 10 8 कोशिकाओं. कोशिकाओं की अंतिम आबादी बनाने के लिए संयुक्त रहे हैं कि अंशों कम से कम होना चाहिएसवाल में सेल के प्रकार के लिए शुद्ध 80%. आप पवित्रता या अधिक की इस डिग्री नहीं देखते हैं, सेल जुदाई या बीएसए ढाल के साथ एक समस्या हो सकती है. इसके अलावा, कुछ पहले 20 भागों में कोशिकाओं और भागों में कोशिकाओं का एक बहुतायत अगर वहाँ 80 +, या वहाँ कोशिकाओं का एक बहुतायत पहले 20 भागों में है और शायद ही कोई भागों में 70 +, अवसादन समय आगे होने की जरूरत है अगर अनुकूलित. कैसे मुसीबत शूट करने के लिए पर सुझाव के लिए चर्चा देखें.
चित्रा 1. एसटीए डाल तंत्र के एक योजनाबद्ध और वास्तविक छवि दिखाई जाती हैं: एसटीए डाल तंत्र की स्थापना. सभी कांच के बने पदार्थ अंश कलेक्टर को तंत्र से जोड़ता है कि ट्यूब सहित प्लास्टिक टयूबिंग, से जुड़ा हुआ है. तीर clamps के स्थान का संकेत मिलता है. ए) सेल लोडिंग कक्ष, एक हलचल बार शामिल हैं, बी) 2 एल सिलेंडर 2% बीएसए के लिए, एक हलचल बार होता है, 4% बीएसए के लिए सी) एल 2 सिलेंडर, डी) अवसादन कक्ष, ई) हलचल प्लेटें, एफ) चकरा देना;. जी) पानी निकलने की टोंटी बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. एसटीए डाल से प्राप्त सेल आबादी: meiotic और दैहिक कोशिकाओं, गोल spermatids, और spermatids संघनक और elongating: भिन्न तीन कक्षों की अलग आबादियों में संयुक्त थे. प्रत्येक जनसंख्या परमाणु आकार और आकृति विज्ञान में मतभेदों को दिखाने के लिए DAPI के साथ दाग है. चरण विपरीत इमेजिंग सेल आकार और आकार में अंतर बता देते हैं. सफेद पट्टी के 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. एसटीए डाल से प्राप्त अलग सेल आबादी के मार्कर: पूरे सेल अर्क चित्र 1 में दिखाया प्रत्येक सेल की आबादी से किए गए थे और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रत्येक आबादी के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति मतभेद दिखाने के लिए प्रदर्शन किया था.. Synaptonemal जटिल प्रोटीन 1 (Scp1) एक प्रोटीन अर्धसूत्रीविभाजन दौरान विशेष रूप से व्यक्त की है और संघनक spermatid अंश संक्रमण प्रोटीन 1 (टीपी 1) के लिए समृद्ध है, जबकि meiotic भागों में समृद्ध पाया जाता है, देर spermiogenesis में व्यक्त एक प्रोटीन. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें छवि .
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Discussion
एक विश्वसनीय सेल संस्कृति प्रणाली अभी तक सभी spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं 3 पैदा करने के लिए मौजूद नहीं है के रूप में शुक्राणुजनन अध्ययन जो लोग spermatogenic सेल के नमूने के लिए पशु मॉडल पर भरोसा करते हैं. Spermatogenic कोशिकाओं को आसानी से पूरे वृषण से एकत्र कर रहे हैं, केवल एक मिश्रित आबादी परिणाम है. इस तरह के meiotic कोशिकाओं, गोल spermatids, और संघनक spermatids के रूप में इन कोशिकाओं के विशिष्ट उपप्रकार, अध्ययन करना चाहते हैं के लिए एक समस्या बन गया है. तीन अलग अलग तरीकों वर्तमान spermatogenic कोशिकाओं के इन उपप्रकार अलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं: एसटीए रखो, FACS, और धावन 6-13. क्रमशः, एक सेल सॉर्टर और एक elutriator: बाद के दो तरीकों उपकरणों की महंगी टुकड़े के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है. FACS विधि अलग spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं के अत्यधिक शुद्ध आबादी पैदावार हालांकि, प्रक्रिया छह घंटे लगते हैं और दो से तीन वृषण 11 प्रति सेल प्रकार प्रति केवल 0.5-2.0 x 10 6 कोशिकाओं पैदावार. एसटीए डाल meth तरह धावन,आयुध डिपो, आकार और घनत्व के आधार पर कोशिकाओं को अलग करता है, लेकिन एसटीए डाल तंत्र की तुलना में महंगा है, जो एक elutriator, के लिए उपयोग की आवश्यकता है.
एसटीए डाल प्रक्रिया (~ 22 वृषण प्रति ~ 10 8 कोशिकाओं / जनसंख्या) एक काफी उच्च उपज के साथ विभिन्न आकार के spermatogenic कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल बीएसए ढाल का उपयोग करता है. FACS तरीकों के सापेक्ष, एसटीए डाल प्रक्रिया को और अधिक कोशिकाओं / वृषण पैदावार और प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए बहुत कम समय लगता है. FACS और धावन की तुलना में, एसटीए डाल प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल और सस्ती है. एसटीए डाल यह एक सेल सॉर्टर या elutriator लिए उपयोग किए बिना प्रयोगशालाओं के लिए एक आदर्श तरीका है, जिससे केवल एक ठंडे कमरे या बड़े रेफ्रिजरेटर और विशेष कांच के बने पदार्थ के एक सेट की आवश्यकता है. जब ठीक से प्रदर्शन, एसटीए डाल दौर spermatids या संघनित spermatids का लगभग 90% शुद्ध जनसंख्या प्रदान कर सकते हैं.
एसटीए डाल विधि बहुत उपयोगी है, लेकिन कई अलग अलग चरणों में अनुकूलन, विशेष रूप से एस की आवश्यकताedimentation. सेल प्रकार के उप इष्टतम जुदाई कई विभिन्न मुद्दों, सबसे बीएसए ढाल से संबंधित की वजह से हो सकता है. एक उचित ढाल बनाने के लिए, सेल लोडिंग कक्ष में हलचल सलाखों और आपको ढाल बना रहे हैं, जबकि 2% बीएसए पकड़े एल 2 सिलेंडर पर बारी. इसके अलावा बुलबुले के सभी ट्यूबिंग स्पष्ट और कोशिकाओं लोड करने से पहले अवसादन चैम्बर में जगह में बाधक डाल दिया. में या अवसादन चैंबर के बाहर बीएसए के प्रवाह की दर को कम करने में मदद कर सकते हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, एसटीए डाल तंत्र ढाल, अवसादन, या अंश संग्रह के निर्माण के दौरान परेशान नहीं किया जाना चाहिए.
उप इष्टतम सेल पैदावार वृषण की अपर्याप्त संख्या / आकार, collagenase / trypsin उपचार के दौरान अपर्याप्त सेल जुदाई, और सेल clumping का नतीजा हो सकता है. एक कारण spermatogenic सीईएल की कम संख्या का उत्पादन है कि नवजात चूहों या जीनोटाइप का उपयोग करने के लिए इस एसटीए डाल प्रोटोकॉल के लिए कक्षों की उपयुक्त संख्या प्राप्त करने में असमर्थ हैलोकसभा, यह जाँच डाल प्रति अधिक पशुओं का उपयोग करने के लिए या (ProScience से उपलब्ध है) छोटे संस्करणों और सेल नंबर के लिए अनुकूलित एक स्टेशन रखो कांच के बने पदार्थ किट 18 ऑर्डर करने के लिए आवश्यक हो सकता है. कक्षों की एक इष्टतम संख्या (700-800000000) प्राप्त करने के लिए, आदर्श कम से कम 8-9 सप्ताह पुराने प्रजनन की उम्र के कम से कम 11 नर चूहों का उपयोग करें. हालांकि, कोई अधिक 800 करोड़ से कोशिकाओं को एक एसटीए डाल में लोड किया जाना चाहिए. कोशिकाओं के इलाज trypsin के बाद एक एकल कक्ष निलंबन में अलग नहीं किया है, DNase एकाग्रता 1 ग्राम / 5 एमएल समाधान तक बढ़ाया जा सकता है. DNase फ्रीज / पिघलना, और हर बार एक एकल कक्ष निलंबन में नलिकाओं की एक अधिक प्रभावी फैलाव का परिणाम देगा ताजा DNase का उपयोग करने के चक्र को दोहराने के प्रति संवेदनशील है. एक जाल के माध्यम से फिल्टर से पहले सेल clumps अलग तोड़ने में मदद करने के लिए एक विस्तृत बोर पिपेट का उपयोग कर सकते हैं.
अनुकूलन की आवश्यकता होगी कि एसटीए डाल विधि का एक पहलू कोशिकाओं बीएसए ढाल के माध्यम से तलछट की अनुमति दी जाती है समय की राशि है. एक घंटेऔर 45 मिनट आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन इस बार प्रयोगशाला में प्रयोगशाला से अलग हो सकता. आमतौर पर, कोशिकाओं के विभिन्न परतों बीएसए ढाल भर नेत्रहीन देखा जा सकता है. कुछ एकत्र पहले 20 भागों में कोशिकाओं और भिन्न 80 + में कोशिकाओं की बहुतायत हैं, अवसादन समय लागू किए जाने की आवश्यकता हो सकती है. बहुत अधिक सेल एकत्र पहले 20 भागों में कर रहे हैं और सेल प्रकार की अपर्याप्त जुदाई है, तो अवसादन समय कम होने की जरूरत हो सकती है.
एसटीए डाल प्रक्रिया के साथ प्राप्त कोशिकाओं प्रयोगों के कई अलग अलग प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बड़े पैमाने पर जैव रसायन प्रयोगों कई अलग एसटीए डाल रन से सामग्री के संयोजन की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि एसटीए रखो, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, immunofluorescence, और शाही सेना के विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध कराता है. अन्य प्रकार की कोशिकाओं से अलग, अगुणित spermatids की तुलना में आसान हो सकता है जो ऊपर से तीन दिनों के लिए सभ्य और इन विट्रो आणविक हेरफेर के अधीन किया जा सकता है
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित. प्रदर्शन किया जा रहा यह प्रोटोकॉल प्रयोगशाला चूहों का इस्तेमाल शामिल है और सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में मार डाला गया था. इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त जानवर पेंसिल्वेनिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय (IACUC प्रोटोकॉल # 804284) के मार्गदर्शन और अनुमोदन के तहत रखा जाता है.
Acknowledgments
इस शोध एनआईएच अनुदान SLB को GM055360 और RGM को U54HD068157 द्वारा समर्थित किया गया. JMB पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय (GM008216) में T32 जेनेटिक्स प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
| 0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
| KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
| Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI | Preference of researcher | ||
| Triton-X100 | Preference of researcher | ||
| Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
| TABLE 2: EQUIPMENT | |||
| Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
| 10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
| Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
| 14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
| Need approximately 100 tubes | |||
| Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
| Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
| Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |
References
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