O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade.
Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos. Atualmente, não existe um sistema de cultura de células confiável permitindo a diferenciação da espermatogênese in vitro, ea maioria dos estudos biológicos das células espermatogênicas requerem colheita de tecidos a partir de modelos animais, como ratos e ratinhos. Porque o testículo contém numerosos tipos de células – tanto não-espermatogênico (Leydig, Sertoli, mielóides e células epiteliais) e espermatogênicas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides redondas, condensando espermátides e espermatozóides) – estudos dos mecanismos biológicos envolvidos na espermatogênese requer o isolamento e o enriquecimento destes tipos de células diferentes. O método STA-PUT permite a separação de uma população heterogénea de células – neste caso, a partir de testículos – por meio de um gradiente linear de BSA. Tipos de células individuais sedimentar com velocidade de sedimentação de acordo com a diferente cetamanho ll, e fracções enriquecidas com diferentes tipos de células pode ser recolhido e utilizado em análises posteriores. Enquanto o método de STA-PUT não resulta em fracções de elevada pureza de tipos de células, por exemplo, como pode ser obtido com determinados métodos de classificação celular, que faz prever um rendimento muito maior do total de células em cada fracção
(~ 1 x 10 8 células / tipo de célula espermatogênico de uma população inicial de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimento exige apenas vidraria especializada e pode ser realizada em qualquer sala fria ou geladeira grande, tornando-se um método ideal para laboratórios que têm acesso limitado aos equipamentos especializados como uma fluorescência ativada classificador de células (FACS) ou elutriator.
Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos 1. Resumidamente, células-tronco como espermatogônias que residem perto do epitélio da divisão dos túbulos seminíferos e se diferenciam em espermatócitos, que, em seguida, passam por divisões meióticas. Após a meiose é completa, as células haplóides resultantes, ou espermátides arredondadas, são submetidos a espermiogênese, um processo de diferenciação que envolve o derramamento de citoplasma e compactação do núcleo. Espermátides gradualmente desenvolver um flagelo e submetidos a alongamento e condensação do núcleo, produzindo alongamento e, em seguida, condensando espermatídeos, respectivamente. Os produtos finais são os espermatozóides, que são liberados no lúmen do túbulo seminífero e, finalmente, para o epidídimo, onde eles amadurecem mais.
Como o processo de espermatogênese depende de condições hormonais e moleculares especiais emos testículos, um sistema in vitro de cultura de confiança para todo o processo de espermatogénese ainda não foi desenvolvido 2,3. Métodos de cultura têm sido desenvolvidos para a criação de "células-como células germinativas primordiais" e, "espermátides-como a volta" haplóides a partir de células-tronco, mas estes métodos ainda não são capazes de gerar um grande número dessas células e não conseguem produzir células espermatogênico mais tarde tipos 4,5. Felizmente, os tipos de células espermatogénicas diferem significativamente de tamanho, que permite a uma suspensão de uma única célula obtidos a partir de testículos inteiras sejam separadas com um gradiente de líquido. O método STA-PUT, demonstrado aqui, usa um gradiente linear BSA e sedimentação simples para separar células espermatogênicas com base no tamanho e massa 6-9.
O método STA-PUT tem várias vantagens sobre os outros dois métodos mais amplamente utilizados para separar os tipos de células espermatogénicas: FACS e elutriação 10-13. O aparelho STA-PUT requer only vários pedaços de vidro especializada montado em uma sala fria ou geladeira grande. Assim, é menos dispendioso do que o uso de um separador de células ou um elutriator. O método STA-PUT produz quantidades elevadas de células, por tipo de célula e os testículos do que pode ser classificada por FACS num período de tempo comparável, embora a pureza de cada população de células não é tão elevada quanto as obtidas com FACS 11. Células de triagem utilizando esferas magnéticas (triagem magnético ativado celular, MACS), recentemente tem sido empregada com sucesso para o enriquecimento das espermatogônias a partir de uma população de células dos testículos mista, mas de momento inadequado para separar espermatócitos ou espermátides, devido à falta de conhecimento da superfície apropriada marcadores 14. Uma vantagem adicional do método de STA-PUT sobre FACS ou MACS é a capacidade para isolar células viáveis adequados para a cultura subsequente, porque, em contraste com a maioria dos protocolos de FACS, que não requer qualquer ADN ou outros tipos de coloração. Para os estudos que requerem lrendimentos ARGE, de espermatogênicas tipos de células em ~ 90% de pureza, o STA-PUT é um método ideal.
Aqueles que estudam a espermatogênese confiar em modelos animais para amostras de células de espermatogénese, como um sistema de cultura de células confiável ainda não existe para gerar todos os tipos celulares espermatogênicas 3. Embora as células espermatogênicas são facilmente coletadas de testículos inteiros, apenas uma população mista resulta. Isto coloca um problema para aqueles que desejam estudar subtipos específicos dessas células, como as células meióticas, espermátides redondas e …
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concede GM055360 para SLB e U54HD068157 a RGM. JMB foi apoiado pelo Training Grant T32 Genética da Universidade da Pensilvânia (GM008216).
BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate can be used. |
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions | Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively). | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
KREBS (10x) | 3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20 | Autoclave/filter and store at 4 °C for several months. | |
KREBS (1x) | Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20. | To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize. | |
Collagenase | Sigma | C9891-1G | |
DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
Trypsin | Sigma | T9201-1G | |
DAPI | Preference of researcher | ||
Triton-X100 | Preference of researcher | ||
Formaldehyde (~37%) | Preference of researcher | ||
TABLE 2: EQUIPMENT | |||
Equipment | Company | Catalog # | Comments |
Complete STA-PUT apparatus | ProScience Glass Shop | STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500) | Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers. |
10 μm mesh filter | Fisherbrand | 22363549 | |
Mouse dissection tools | Preference of researcher | ||
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps | Preference of researcher | ||
Need approximately 100 tubes | |||
Fraction collector | GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40 | Alternate can be used. |
Microscope slides, cover glass | Preference of researcher | ||
Light/Fluorescent Microscope | Preference of researcher |