एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में टीके के विकास के लिए संयोजक arenavirus की पीढ़ी
Summary
क्लोन cDNAs, के रूप में आनुवंशिकी को उल्टा करने के लिए भेजा, एक दृष्टिकोण से पुनः संयोजक arenaviruses का बचाव शोधकर्ताओं arenavirus के जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं को, विशिष्ट वायरल जीन उत्पादों की भूमिका, साथ ही उनके विभिन्न विशिष्ट डोमेन और अवशेषों के योगदान की जांच करने के लिए अनुमति देता है . इसी तरह, मानव रोगजनक arenaviruses से निपटने के लिए प्रभावी और सुरक्षित टीकों की पीढ़ी के लिए उपन्यास संभावनाएं प्रदान टीके के विकास के लिए एफडीए को मंजूरी दी सेल लाइनों (वेरो) में आनुवांशिकी तकनीक रिवर्स.
Abstract
arenavirus रिवर्स आनुवंशिकी के विकास और कार्यान्वयन arenavirus क्षेत्र 4 में एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करता है. उनके जीनोम में पूर्व निर्धारित परिवर्तन के साथ पुनः संयोजक संक्रामक arenaviruses उत्पन्न करने की क्षमता के साथ एक साथ सेल आधारित arenavirus minigenome सिस्टम के उपयोग arenavirus जीवन चक्र के विभिन्न चरणों को वायरल निर्धारकों के योगदान की जांच, साथ ही वायरस मेजबान की है बातचीत और arenavirus रोगजनन 1, 3, 11 के तंत्र. इसके अलावा, trisegmented arenaviruses का विकास इस प्रकार arenavirus आधारित टीका वेक्टर अनुप्रयोगों 5 की संभावना खोलने के हित के अतिरिक्त विदेशी जीन व्यक्त करने arenavirus जीनोम के उपयोग की अनुमति दी है. इसी तरह, व्यक्त रिपोर्टर जीन में सक्षम एकल चक्र संक्रामक arenaviruses के विकास highl शामिल अनुसंधान की सुरक्षा में सुधार करने के लिए एक नया प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करता हैवाई रोगजनक मानव arenaviruses 16. प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक का उपयोग कर पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी अब तक खाद्य एवं औषधि प्रशासन के विकास (एफडीए) से लाइसेंस टीका या टीका वैक्टर के लिए कुछ बाधाओं बन गया है जो 7,19 कृंतक सेल लाइनों का उपयोग करते हैं, पर भरोसा है. इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में पुनः संयोजक arenaviruses के कुशल पीढ़ी यहाँ का वर्णन.
Introduction
Arenaviruses Arenaviridae परिवार के हैं कि एक bisegmented, नकारात्मक असहाय आरएनए जीनोम 3 के साथ छा वायरस हैं. arenavirus जीनोम दो अलग वायरल खंडों 3 से एक ambisense फैशन में चार प्रोटीन encodes. बड़े (एल) खंड शाही सेना पर निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (एल) और वायरस नवोदित की मुख्य प्रेरणा शक्ति के रूप में कार्य करता है कि छोटे रिंग (वास्तव में दिलचस्प नई जीन) उंगली प्रोटीन (जेड) encodes. छोटी सी (एस) खंड वायरल nucleoprotein (एनपी) और सतह ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) (चित्रा 1) encodes.
Arenaviridae परिवार के कई सदस्यों को मनुष्यों 3 में घातक रक्तस्रावी बुखार (एचएफ) के लिए जिम्मेदार हैं. सिद्धांत चिंताओं के अस्पताल में भर्ती मरीजों 8, 9 में उच्च मृत्यु दर के कारण जाना जाता है जो Lassa वायरस (LASV) और जुनिन वायरस (JUNV), कर रहे हैं. इन वायरस क्रमशः पश्चिम अफ्रीका और ग्रामीण अर्जेंटीना, में पाई जाती हैं, हालांकि,यात्रा वृद्धि 10 के कारण गैर स्थानिक क्षेत्रों को LASV और JUNV के आयात की बढ़ती चिंता कर रहे हैं. सामान्य रूप से मानव में गंभीर बीमारी के साथ जुड़ा नहीं है, हालांकि इसके साथ ही, prototypic arenavirus लिम्फोसाईटिक choriomeningitis वायरस (LCMV) immunocompromised रोगियों 6, 15 में घातक संक्रमण के मामलों की गई है के रूप में एक उपेक्षित रोगज़नक़ माना जाता है और जन्मजात जन्म दोष और सहज गर्भपात के लिए जिम्मेदार है गर्भवती महिलाओं को 2, 13 में. वहाँ वर्तमान में कोई अमेरिका arenaviruses और उपचार के खिलाफ टीके केवल आंशिक रूप से प्रभावी है और अक्सर महत्वपूर्ण पक्ष प्रभाव के साथ जुड़े जो न्यूक्लीओसाइड अनुरूप ribavirin तक सीमित है, एफडीए को मंजूरी दे दी.
प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी 4 और पुनः संयोजक arenaviruses 7, 19 की पीढ़ी की शुरूआत बहुत arenavirus अनुसंधान के क्षेत्र उन्नत है. वर्तमान में, कृंतक कोशिकाओं (जैसे बीएचके-21) के रूप में gener के लिए उपयोग किया जाता हैएस और एल खंडों की प्रारंभिक प्रतिलेखन निर्देशन प्रजाति विशेष murine शाही सेना पोलीमरेज़ मैं (पीओएल-मैं) प्रमोटर के कारण पुनः संयोजक arenaviruses से समझना. बीएचके -21 कोशिकाओं में हालांकि वायरस बचाव संभावित टीका बीज उम्मीदवार के रूप में पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी के लिए एक अनुमोदित विधि नहीं हैं. यहाँ हम prototypic पुरानी दुनिया (ओ) LCMV और नई दुनिया (पश्चिम) वेरो कोशिकाओं में JUNV खरा # 1 तनाव के कुशल बचाव के लिए मानव नीति मैं प्रमोटर के दस्तावेज़ का उपयोग. एक समान पद्धति का उपयोग करना, हम पुनः संयोजक trisegmented LCMV (r3LCMV) और खरा # 1 (r3Candid # 1) दो अलग एस आरएनए क्षेत्रों 5 में इनकोड दो अतिरिक्त विदेशी जीन होते हैं कि arenaviruses उत्पन्न. इस नई प्रणाली एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सरल प्रोटोकॉल के बाद लेकिन तुरंत संभावित टीका या टीका वेक्टर बीज के रूप में पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी में लागू किया जा सकता है न केवल.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक का उपयोग कर पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी arenavirus जीव विज्ञान के कई विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण बन गया है. यहाँ हम arenavirus प्रदर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank past and present members in JCT and LM-S laboratories for the development and improvement of the arenavirus reverse genetics techniques and plasmids. We also thank Snezhana Dimitrova for technical support. The monoclonal antibody directed to JUNV NP (SA02-BG12) was obtained from BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository). BYHC was supported by Grant Number GM068411 from Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R is a Fullbright-Conicyt (BIO 2008) and a Rochester Vaccine Fellowship (2012) recipient. EO-R current support is provided by a postdoctoral Fellowship for Diversity & Academic Excellence from the Office for Faculty Development & Diversity at the University of Rochester. Research in LM-S laboratory is funded by the NIH grants RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, the NIAID Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (HHSN266200700008C), and The University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).
Research at JCT laboratory was supported by grants RO1 AI047140, RO1 AI077719, and RO1 AI079665 from NIH.
Materials
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Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA. |
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