Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

Summary

Redning av rekombinante arenaviruses fra klonede cDNA'ene, en tilnærming kalt revers genetikk, tillater forskere å undersøke rollen til spesifikke virale genprodukter, samt bidraget av deres forskjellige spesifikke domener og reststoffer, til mange forskjellige aspekter av biologien til arenavirus . Likeledes, revers genetikk teknikker i FDA-godkjente cellelinjer (Vero) for vaksineutvikling gir nye muligheter for generering av effektive og trygge vaksiner for å bekjempe humanpatogene arenaviruses.

Abstract

Utvikling og implementering av arenavirus revers genetikk representerer et betydelig gjennombrudd i arenavirus feltet ^fire. Bruken av cellebaserte arenavirus minigenome systemer sammen med evnen til å generere rekombinante infeksiøse arenaviruses med forutbestemte mutasjoner i deres genomer har muliggjort undersøkelse av bidraget av virale determinantene til de ulike trinn i livssyklusen arenavirus, samt virus og vert interaksjoner og mekanismer arenavirus patogenesen ^{1, 3, 11.} Dessuten har utviklingen av trisegmented arenaviruses mulig også å benytte den arenavirus genomet til å uttrykke flere fremmede gener av interesse, og dermed åpner muligheten for arenavirus-basert vaksine vektor applikasjoner ^5. Likeledes gir utviklingen av single-syklus smittsomme arenaviruses stand til å uttrykke reporter gener en ny eksperimentell verktøy for å forbedre sikkerheten til forskning som involverer highly patogene menneskelige arenaviruses ^16. Generering av rekombinant arenaviruses med plasmid-baserte revers genetikk teknikker har så langt støttet seg på bruk av gnager cellelinjer ^7,19, noe som utgjør noen barrierer for utvikling av Food and Drug Administration (FDA)-lisensiert vaksine eller vaksine vektorer. For å overkomme denne hindringen, beskriver vi her effektiv produksjon av rekombinante arenaviruses i FDA-godkjente Vero celler.

Introduction

Arenaviruses er kappekledde virus med en bisegmented, negativ-stranded RNA genom ^tre som tilhører Arenaviridae familien. Den arenavirus genomet koder fire proteiner i en ambisense mote fra to separate viral segmenter ^tre. Den store (L) segmentet koder RNA-avhengig RNA polymerase (L) og den lille RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z) som fungerer som den viktigste drivkraften for virus spirende. Det lille (S) segment koder for det virale nukleoprotein (NP) og overflaten glykoprotein (GP) (figur 1).

Flere medlemmer av den Arenaviridae familien er ansvarlig for dødelig hemoragisk feber (HF) hos mennesker ^tre. Av prinsippet bekymringer er Lassa virus (LASV) og Junín virus (JUNV), som er kjent for å forårsake høy dødelighet hos innlagte pasienter ^{8, 9.} Selv om disse virusene er endemisk til Vest-Afrika og landlige Argentina, henholdsvisdet er økende bekymring for import av LASV og JUNV til ikke-endemiske områder på grunn av økt reiseaktivitet ^10. I tillegg, selv normalt ikke forbundet med alvorlig sykdom hos mennesker, er prototypic arenavirus lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) regnes som en forsømt patogen som det har vært tilfeller av dødelige infeksjon hos immunsupprimerte pasienter ^{6, 15} og er ansvarlig for medfødte misdannelser og spontan aborter hos gravide kvinner ^{2, 13.} Foreløpig er det ingen amerikanske FDA-godkjente vaksiner mot arenaviruses og behandling er begrenset til nukleosid analog ribavirin, som er bare delvis effektiv og ofte forbundet med betydelige bivirkninger.

Innføring av plasmid-baserte revers genetikk ⁴ og generering av rekombinante arenaviruses ^{7, 19} har sterkt avanserte innen arenavirus forskning. Foreløpig er gnager-celler (slik som BHK-21) benyttet til geneasjon av rekombinante arenaviruses grunn av artsspesifikk murint RNA polymerase I (pol-I) promotor dirigere den innledende transkripsjon av S-og L-segmentene. Men virus redning i BHK-21 cellene ikke er en godkjent metode for generering av rekombinant arenaviruses som potensielle vaksine frø kandidater. Her kan vi dokumentere bruk av den menneskelige pol-I promoter for effektiv redning av prototypic Old World (OW) LCMV og New World (NW) JUNV Candid # 1 belastning i Vero-celler. Ved hjelp av en tilsvarende metodikk, genererte vi rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) og Candid # 1 (r3Candid nr. 1) arenaviruses som inneholder ytterligere to fremmede gener kodet i to forskjellige S RNA segmenter ^fem. Dette nye systemet ikke bare følger en svært reproduserbare og enkel protokoll, men kan umiddelbart implementeres i produksjon av rekombinante arenaviruses som potensiell vaksine eller vaksine vektor frø.

Protocol

En. Arenavirus Rescue Transfection Vår redningssystem var basert på bruk av både polymerase II-proteinet, ekspresjonsplasmider som koder for nukleoprotein (NP) og RNA-avhengig-RNA-polymerase (L), de virale trans-virkende faktorer som kreves for RNA-replikasjon og gen-ekspresjon av det arenavirus genomet 7, 19, og plasmider som er i stand til å dirigere intracellulær syntese, via den cellulære RNA-polymerase I (pol-I), av S-og L-antigenome RNA-arter 7.. I våre studi…

Representative Results

Vellykket redning av en rekombinant villtype arenavirus vil bli bekreftet ved nærværet av virale antigener ved hjelp av IFA (figur 5). I tilfelle av rekombinante trisegmented virus, kan vellykket viral redning skal vurderes ved å observere GFP uttrykk ved fluorescens mikroskopi (figur 6A). Vellykket redning vil bli ytterligere bekreftet ved å vurdere ekspresjon Gluc (figur 6B). Representative resultatene illustrerer den vellykkede redningen av vill-type og trisegmen…

Discussion

Generasjon av rekombinant arenaviruses med plasmid-baserte revers genetikk teknikker har blitt en mye brukt metode for undersøkelse av mange forskjellige fasetter av arenavirus biologi. Her kan vi dokumentere en avgjørende forbedring av dagens system ved å utføre arenavirus redder i Vero-celler, noe som åpner for potensielle generasjon av FDA-godkjente vaksine kandidater mot arenaviruses og vaksine vektorer mot andre smittsomme sykdommer.

De eksperimentelle prosedyrer involvert er gener…

Materials

			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.