Summary
Эта статья описывает процедуры для тактильной стимуляции крысят и последующего Гольджи-Кокса окрашивания нейронов морфологии. Тактильная стимуляция положительный опыт, который вводят в перинатальном периоде поглаживая щенков с бытовыми тряпкой. Окрашивание Гольджи-Кокса является надежным процедура выдачи разрешений визуализацию целых нейронов.
Abstract
Для создания долгосрочных изменений в поведении, опыт должен быть получения устойчивых изменений в нейронной морфологии и синаптической связи. Тактильная стимуляция является положительным ранний опыт, который имитирует материнской лизать и уход на крысах. Разоблачение крысят в этот положительный опыт может быть завершена легко и экономически эффективно с помощью высоко доступные материалы, такие как домашнее тряпкой. Использование перекрестный дизайн мусора, щенки либо погладил или не трогать, в течение 15 мин, три раза в день в течение всего перинатального периода. Для измерения neuroplastic изменения, связанные с этой позитивной раннего опыта, Гольджи-Кокса окрашивание ткани мозга используется. Благодаря тому, что Гольджи-Кокса пропитка окрашивает дискретный количество нейронов, а не все клетки, окрашивание мозге грызунов с раствором Гольджи-Кокса позволяет визуализировать целых нейронных элементов, включая теле клетки, дендриты, аксоны и дендритных шипиков. Процедура я окрашиваниес осуществляется в течение нескольких дней и требует, чтобы исследователь обратить пристальное внимание к деталям. Однако, как только окрашивание завершена, весь мозг был пропитан и может быть сохранена на неопределенный срок для текущего анализа. Поэтому окрашивание Гольджи-Кокса является ценным ресурсом для изучения опыта зависит от пластичности.
Introduction
Хотя есть много сообщалось и используемые методы для рассмотрения отрицательных раннего опыта на созревание мозга, таких как перинатальный стресс 1,2, сенсорной депривации 3 и наркотиков токсичности 4, существует очень мало методик, применяемых для изучения влияния положительного опыта в период это время. Помимо обогащения среды, тактильная стимуляция является одним из нескольких мозга увеличивая процедуры с продемонстрировали эффекты 5. Тактильная стимуляция является методом сенсорной стимуляции к коже, который имитирует материнское поведение крыс, облизывая и холить. Его общее признание в качестве положительного манипуляции возникает из исследований, указывающих, что тактильная стимуляция улучшилось созревание недоношенных детей и новорожденных крыс 6. Кроме того, исследования в лаборатории Meaney 7 показал, что более высокие уровни материнской лизать и ухода связаны с положительными результатами в потомстве. Благодаря тHESE положительное влияние, тактильная стимуляция быстро превратилась в процессуальной стратегии, направленной на снижение тревожности 8, улучшения результатов, связанных с черепно-мозговой травмой 9-11, и снижение уровня наркотиков раздражение 12. Таким образом, тактильная стимуляция является ценным методом для популяризации позитивных раннего опыта, с проверенной способностью резко реорганизации нейронов морфологию и синаптическую связь развивающегося мозга.
С целью изучения и количественного изменения в нейронной морфологии, необходимо визуализировать неповрежденные нейроны. Процедура окрашивания Гольджи-Кокса является модификацией методики Камилло Гольджи, опубликованной в конце 1800-х, которая обеспечивает дискретную окрашивание небольшого числа полных нейронов 13. Хотя процедура, кажется, пятно нейроны наугад и воспроизводимость обычно приводится в качестве большой недостаток, визуализации разрешений небольшой скорости пропитка всей нейронной элемента, в том числе сеLL органы, дендриты, дендритных шипиков, и аксоны. Аналогичным образом, время, необходимое для пропитки данную мозг раствором Гольджи также приводится в качестве падению. Однако, учитывая, что как только окрашивание завершения ткани могут быть сохранены на неопределенный срок, а время между перфузии головного мозга и визуализации нейронов с помощью микроскопа может быть завершена менее чем за 21 дней, период времени не является необоснованным. Кроме того, с незначительными изменениями в протоколе, окрашивание Гольджи-Кокса может быть эффективно использован для пропитки мозги грызунов из всех возрастных диапазонах. Как изменения на структурном уровне были связаны с стойких изменений в поведенческих и психологического функционирования, техника окрашивания Гольджи-Кокса предоставляет исследователям ценный инструмент для измерения нейропластичность.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Канадским Советом уходу за животными и утверждается университета Летбридж, Комитета по уходу за животными.
1. Разведение и тактильная стимуляция
- Заказать беременным крысам из общих поставщиков животных или разводить щенков в доме с использованием стандартных процедур лабораторных размножения.
- Дом все животные в контролируемой температурой размножения комнате (21 ° C), который ведет на 12:12 час свет: темно-цикла и обеспечить доступ к еде и воде.
- Когда щенки рождаются, дом самок крыс индивидуально со своими отпрысками.
- Чтобы избежать дополнительного стресса, связанных с использованием сразу после рождения, начать тактильную стимуляцию щенков в P3.
- Тактильная стимуляция должна осуществляться три раза в день (9:00 утра, 1:00 вечера, и 4:00 вечера) с P3-P21 и щенки следует отлучить от своих матерей в P21.
- При использовании на практике построение мусора, половина из щенков фром каждый помет будет пройти тактильных ощущений с другая половина служит в качестве контроля. Случайно назначить равное число мужчин и женщин детенышей к каждой группе. Чтобы дифференцировать щенков, проходящих тактильную стимуляцию и управления, отметьте одну группу щенков с постоянным маркером на задних лапах и хвосте. Маркировка должна быть повторно применена через день.
Тактильная стимуляция
- Удалить плотин из своей клетки и разместить их во временном клетке с пищей и водой. Держите плотину и временный клетку в разведение / жилищного комнате.
- Взвесьте крысят как группа до утренней тактильной стимуляции сессии (9:00 утра). Для каждой сессии, транспорт крысят свои домашние клетки в отдельную комнату для тестирования тактильной стимуляции. Поместите дома клетку на грелку, который установлен до 24 ° C.
- Используйте жесткую плату разделить домашнюю клетку на две половины. Наведите крысят в тактильной стимуляции группа половиной и контроля щенков в другой половине.Установите таймер на 15 мин.
- Используя мягкую перо-как тряпку, чистить все щенков в тактильной стимуляции группы в то же время в течение 15 последовательных мин. Молодые крысят (~ P3-P12) Ususally ютиться и, кажется, введите глубокий цикл сна делает его очень легко, чтобы стимулировать все щенков сразу. Как возраст щенков, они становятся более активными, при этом некоторые щенки ходить и расследования в ходе сессии. Экспериментатор должен постоянно двигаться блуждающих щенков в группу, чтобы убедиться, что каждый щенок получает равную стимуляции.
- После 15 мин сессия будет завершена, транспортировки щенков обратно в племенной комнату и вернуть мать к клетке.
- Повторите эту процедуру три раза в день в течение 19 дней тактильной стимуляции. После окончательного тактильной сессии стимуляции на P21, щенки следует отлучить от своих матерей. Щенки должны быть размещены в клетках с 5 или 6 других отлученных животных одного пола.
- Если крысы не претерпевают никаких дополнительных испытаний, то они должны быть оставлены безнарушается, на нормальном свете: темно-цикла с доступом к пище и воде libitm (наряду с регулярной очисткой клетки и обработки), пока они не достигнут примерно 100 дней от роду. Если проходит других экспериментальных манипуляций, животные должны быть обработаны или испытания в соответствии с этими лабораторных протоколов.
2. Жертвоприношение и Гольджи-Кокса Окрашивание
- Примерно в P100, управлять передозировки пентобарбитала натрия посредством инъекции IP крысам и заливать внутрисердечно с примерно 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида.
- Выписка мозги, когда перфузии завершена. Удалить мозги из черепа, резка зрительный нерв под с усилия, чтобы сохранить мозжечок неповрежденными; исследователи может сохранить или удалить обонятельные луковицы. Наведите извлеченные мозги в непрозрачном бутылки Nalgene 20 мл Гольджи-Кокса раствора 14.
- Держите мозги в растворе Гольджи-Кокса на 14 дней. Через 14 дней, замените Гольджи-Cбык раствор с 30%-ным раствором сахарозы. Держите мозги в растворе сахарозы в течение 2-5 дней до секционирования.
Примечание: Если мозг не может быть срезы в течение 14 дней передачи в растворе сахарозы, исследователь должен заменить сахарозу с новым запасом 30% сахарозы. Исследователь может заменить сахарозу каждые две недели в течение 4 месяцев без каких-либо побочных эффектов на окрашивание.
- Для того, чтобы разделе мозга, мозг должен быть высушены и крепится к стадии секционирования с cyanocacrylic клея. Для предотвращения образования трещин или неравномерное секционирования, исследователь должен быть осторожным и убедиться, что весь мозг прочно прикреплен к сцене.
- Резервуар Vibratome должны быть заполнены 6% раствора сахарозы до уровня, который покрывает секционирования лезвие. Установите параметры Vibratome к скорости и амплитуды до 5, (середина на обеих шкал). Нарежьте мозг в 200 мкм разделов и разместить разделы на 2% желированного микроСфера слайд. Не забудьте сохранить разделы мокрый ходе секционирования.
- Когда все секции интересов были собраны, нажмите разделы на слайдах, применяя давление к слайдам с увлажненным впитывающий влагу бумаге. Храните слайды в режиме слайд-стойке в камере влажности, пока они не готовы быть окрашены. Они должны оставаться в камере влажности в течение не менее 12 часов, но не более чем за 4 дня. Слайды должны быть влажными и не должно быть разрешено, чтобы иссякнуть.
- Подготовьте окрашивания полк перед началом процесса окрашивание. Этикетка двенадцать окрашивания стекла блюда (10,7 х 8,5 х 6,8 см) и обрабатывать следующим образом:
- Дистиллированная вода - 1 мин
- Гидроксид аммония - 30 мин (в темноте)
- Дистиллированная вода - 1 мин
- Kodak Fix кинообразования - 30 мин (в темноте)
- Дистиллированная вода - 1 мин
- 50% алкоголя - 1 мин
- 70% алкоголя - 1 мин
- 95% алкоголя - 1 мин
- 100% Alcohол - 5 мин
- 100% спирта - 5 мин
- Решение (1/3 хлороформ, 1/3 HemoDe, 1/3 100% спирта) - 15 мин
- HemoDe - 15 мин
* Ксилол может быть использован в замене HemoDe. Для того чтобы обеспечить постоянное качество окрашивания, свежие растворы должны быть использованы для каждого слайда стойки обработаны.
- После последнего 15 мин всплытия в HemoDe, покровное слайды с предметный столик Permount.
- Разрешить слайды высохнуть на воздухе, прежде чем рассматривать под микроскопом.
Representative Results
Когда эта процедура окрашивания последовало надлежащим, последовательным и равномерным окрашивание дендритов и шипы генерируется. См. рисунок 1 для представления окрашивания Гольджи-Кокса нейронов. Эта процедура производит окрашивание, что сопоставимо с недавно разработанной в методах пробирке и может позволить визуализации дендритных полей, бесперебойного следующее ткани вложение. Vibratome основе методика для окрашивания Гольджи-Кокса было установлено, производить более широкое окрашивание терминалов филиалов и пирамидных нейронов, чем окрашивания или целлоидин встраиваемый и нарезали с применением криостата ткань 15. Кроме того, так как этот способ окрашивания пропитывает весь мозг, все секции могут быть проанализированы немедленно или в будущем. Как расположение морфологических изменений это не всегда очевидно при генерации оригинальную гипотезу, этот процесс позволяет для исследования дополнительных областях мозгаг предотвращает удаление ткани, которые могут быть полезны в будущем.
Этот способ окрашивания могут быть использованы для надежного окрашивания любых возрасте мозга крысы (P0-старости). Однако, когда окрашивания молодых мозги (<1 грамм), мозг должен оставаться только в растворе Гольджи-Кокса в течение 6 дней, а не 14 дней, рекомендованных для мозга взрослого человека, а все остальные процедуры остаются неизменными. Основная трудность, с которой можно столкнуться в ходе этого процесса окрашивания Гольджи-Кокса является неспособность производить высококачественный окрашивание центральных областях головного мозга, включая таламус. Как весь мозг пропитан в то же время, центральные области не может получить идеальные концентрации красителя. Несмотря этой находки, техника Гольджи-Кокса производит исключительное окрашивание подкорковых областях, таких как гиппокамп и полосатое тело. Окончательное ограничение процедуры возникает неполного удаления крови из мозга в процессе перфузии. Кровь может производить артефакты в ткани мозгачто затрудняет сфотографировать и проследить нейронов.
Методы Гольджи-Кокса окрашивания обеспечить надежную меру дендритных морфологии и нейроанатомии, которая будет полезна для широкого спектра исследований, направленных на изучения изменения в нейронной уровне. При рассмотрении нейронов структуру в префронтальной коре следующей тактильной стимуляции в начале-послеродовой период, окрашивание Гольджи-Кокса показал резкое увеличение дендритов сложности. Анатомические изменения, связанные с ранней тактильной стимуляции можно продемонстрировать визуально путем сравнения позвоночника плотность пирамидальных нейронов от управления крысы пирамидальных нейронов от крыс, которые прошли тактильную стимуляцию (см. рисунок 1). Кроме того, такие параметры, как дендритов, дендритные длины и плотности позвоночника могут быть рассчитаны и статистический анализ для обеспечения постоянного данные, которые можно сравнить через животных. Для создания надежных результатов, анализ следует проводить на утраinimum из трех животных в группе лечения и примерно пяти нейронов в полушарии следует случайным образом выбирается для каждого участка мозга под анализа. 2 демонстрирует дендритных сложность (шипы / мкм х мкм дендритов) из животных, которые получали тактильную стимуляцию и животных, которые не . В обоих апикальных и базальных областях нейронов проанализированных от MPFC (CG3), тактильная стимуляция привела к распространению нейронных параметров.
Рисунок 1. А. Представитель фотографию Гольджи-Кокса окрашенных пирамидальную нейрон из слоя III зональной CG3 в крысу, которая получила тактильных ощущений в процессе разработки. Б. представитель увеличивалось (1000 X) фотография дендритных шипиков на терминале дендритов в базилярной области CG3 ; зажигалку Изображение слева для крысы в контрольной группе и темного изображения на ринравом от крысы, которые получали тактильных ощущений.
Рисунок 2. Иллюстративный представление среднего апикальной и базальной дендритов сложности (шипы / мкм х мкм) для нейронов в области CG3 от взрослых крыс, получавших либо тактильных ощущений в процессе разработки или не (* р <0,01).
Discussion
В связи с явной пластичности развивающегося мозга, важно, что экспериментальные процедуры, связанные ранние переживания тщательно рассмотрены и делаются попытки контролировать для всех промежуточных переменных. По этой причине конструкции с поперечными помет используется в течение тактильной стимуляции процедуры для того, чтобы щенки получают аналогичный опыт во всех других областях развития. Кроме того, важно также, что несколько щенков из нескольких пометов выбираются для анализа, чтобы избежать возможности того, что эффекты возникнуть в результате уклоном в одном щенка или подстилки.
Тактильная стимуляция, как полагают, чтобы имитировать естественные материнское поведение, облизывая и холить, которые, как полагают, быть полезным для развития потомства. Хотя предыдущие исследования подчеркнул первую неделю жизни (P0-P7), чтобы быть критическим периодом для облизывая и уход 16, сами масштабы изменения выявлены следующие 18 дней таctile стимуляция может означать, что, хотя существуют чувствительные раз, больше воздействие превосходит. Важно также отметить, что щенки, получающие тактильных ощущений в этой экспериментальной парадигмы также испытывают лизать и холить их матерями, следовательно, тактильная стимуляция в дополнение к обычной стимуляции ведении матери. Наконец, нужно также иметь представление о регионе зависит от изменений. Хотя тактильная стимуляция во время разработки увеличились дендритных сложность в префронтальной коре, это не гарантирует, что структурные изменения такого характера будет видно во всех областях мозга. Вполне возможно, что морфология нейронов в других областях мозга, таких как теменной коре, будет реагировать в поразительно различным образом в том же опыте. Однако, поскольку тактильные процедура стимуляции легко управляется и не представляет риска для потомства или плотин, у него есть потенциал, чтобы служить в качестве ценного инструмента для многих научных исследований, направленных на улучшение развитияаль результатов.
В отношении Гольджи-Кокса окрашивания ткани головного мозга, критические шаги для успешного визуализации нервных клеток являются: 1) должно быть достаточно перфузии головного мозга с физиологическим раствором. Неправильное или недостаточное кровоснабжение результатов ткани головного мозга в артефактов кровеносных сосудов, которые делают его трудно на самом деле визуализировать нервных клеток через лабиринт кровеносных сосудов, в то же время усложняет возможность сфотографировать окрашенных нейронов. 2) перфузии мозг следует хранить в растворе Гольджи-Кокса и раствора сахарозы в темноте. Хранение ткани мозга в темноте снижает фоновый окрашивание ткани, снова увеличивая шанс успешно визуализации нервных клеток качества. 3) Мозговая ткань сохраняется в растворе сахарозы после 14-дневного хранения в растворе Гольджи-Кокса. Когда ткань погружают в 30% раствор сахарозы в течение 2-5 дней, мозг более податливыми, который предотвращает разрыв и разрушая секций когдарезка. Важно, чтобы предотвратить мозговую ткань из оставшихся в растворе сахарозы для увеличенных периодов времени (если раствор сахарозы не непрерывно заменен свежим раствором), потому что длительное хранение в сахарозы снижает качество окрашивания. 4) Наконец, когда слайды были запятнанным и крышка поскользнулся, им должно быть предоставлено достаточно времени, чтобы высохнуть, прежде чем визуализации с помощью микроскопа. Если слайды не разрешается адекватно высохнуть на воздухе, ткань может темнеть, уменьшая успешной визуализации корковых нейронов.
Стабильные изменения в психической деятельности и поведенческих реакций, которые происходят в ответ на опыте, как считается, способствует реорганизации нейронной морфологии и синаптической связи 17. Поскольку эти структурные изменения обеспечить измеримую ресурс для опыта в зависимости от пластичности, использование надежной процедуры окрашивания имеет важное значение. Это Vibratome основе Гольджи-Кокса процедура окрашивания обеспечивает надежную пятноIng мелких ветвей и дендритных шипиков, которые могут не видно с другими протоколами, такими как целлоидин-вложения. Своеобразие процедуры Гольджи-Кокса проистекает из его способности только окрашивать малую часть нейронных элементов (1-10%), что позволяет отслеживание отдельных нейронов на большие расстояния. Несмотря на то, что только небольшая часть нейронов, пропитанной пятно, клетки, которые сделаны различимыми, а поддерживать все функции, включая тела клетки, дендритов, дендритных шипиков и аксонов. Более того, когда процедура окрашивания проводится правильно, окрашенные клетки выделяются ясно и отчетливо на прозрачном фоне, потому что другие корковые структуры остаются запятнаны и прозрачным. Вследствие реализации, что стойкие изменения в внешней функционирования должны быть связаны с пластичности нервной системы, то есть способности нейронов, чтобы изменить их структуру и связи, процедура окрашивания Гольджи-Кокса предоставляет исследователямнадежная техника для визуализации и количественной оценки этого пластичность.
Disclosures
Авторы заявляют, что у нас нет никаких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансируется NSERC грантов BK и RG. Авторы также хотели бы поблагодарить Kehe Се и Рассел Hosain за их опыт окрашивания Гольджи-Кокса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
| Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
| Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
| Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
| EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
| Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
| HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
| Permount | Fisher | Sp15 | |
| Slides | VWR | 160004-365 | |
| Coverslips | VWR | 062011-9 |
References
- Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats. Neuroscience. 180, 105-110 (2011).
- Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex. Neuroscience. 216, 103-109 (2012).
- Wiesel, T., Hubel, D. Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).
- Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. The dynamic effects of nicotine on the developing brain. Pharmacology & Therapeutics. 122, 125-139 (2009).
- Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats. Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).
- Schanberg, S., Field, T. Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate. Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).
- Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).
- Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats. Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).
- Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats. Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).
- Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Brain Research. 1002, 94-99 (2004).
- Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex. Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).
- Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner. Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello. Gaz Med Lomb. 33, 244-246 Forthcoming.
- Glaser, E. M., van der Loos, H. Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).
- Meaney, M. Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations. Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
