Summary
Detta dokument beskriver förfaranden för taktil stimulering av råttungar och efterföljande Golgi-Cox färgning av neuronal morfologi. Taktil stimulering är en positiv upplevelse som administreras under den perinatala perioden genom strök valpar med en hushållsdammtrasa. Golgi-cox färgning är en pålitlig procedur möjliggör visualisering av hela nervceller.
Abstract
För att generera långsiktiga beteendeförändringar, måste erfarenheter att producera stabila förändringar i neuronal morfologi och synaptic anslutningar. Taktil stimulering är ett positivt tidiga erfarenheter som härmar maternal slickar och grooming i råtta. Exponera råttungar till denna positiva erfarenhet kan slutföras enkelt och kostnadseffektivt sätt med hjälp av mycket tillgängliga material såsom en hushållsdammvippa. Med hjälp av en cross-kullen designen är valpar antingen strök eller lämnas orörd, för 15 minuter, tre gånger per dag under hela den perinatala perioden. För att mäta de neuroplastic förändringar i samband med denna positiva tidiga erfarenheter, är Golgi-Cox färgning av hjärnvävnad används. På grund av det faktum att Golgi-Cox impregnering fläckar ett diskret antal neuroner snarare än alla de celler, färgning av gnagare hjärnan med Golgi-Cox lösning medger visualisering av hela neuronala element, inklusive cellkroppen, dendriterna, axoner, och Dendritutskotten. Färgningsförfarandet is genomförts under flera dagar och kräver att forskaren ägna stor uppmärksamhet på detaljer. Men när färgning är klar, hela hjärnan har impregnerats och kan bevaras i oändlighet för löpande analys. Därför är Golgi-Cox färgning en värdefull resurs för att studera erfarenheter beroende plasticitet.
Introduction
Även om det finns många rapporterade och utnyttjade metoder för granskning av negativa tidiga erfarenheter på hjärnans mognad, såsom perinatal stressen 1,2, sensorisk deprivation 3, och läkemedelstoxicitet 4, det finns mycket få metoder som används för att undersöka effekterna av positiva upplevelser i denna tidsperiod. Bortsett från miljöberikning, är taktil stimulering en av ett fåtal hjärna förbättra behandlingar med påvisade effekter 5. Taktil stimulering är en metod för sensorisk stimulering på huden som efterliknar moderns rat beteende, slickar och grooming. Dess allmänna acceptans som en positiv manipulation uppkommer från studier som visar att taktil stimulering förbättrade mognaden av för tidigt födda barn och nyfödda råttor 6. Dessutom har forskning i Meaney laboratoriet 7 visade att högre nivåer av mödraslickande och grooming är kopplade till positiva resultat i avkomman. På grund av tessa positiva influenser, taktil stimulering snabbt utvecklats till en stödstrategi som syftar till att minska ångest 8, förbättra resultat i samband med hjärnskada 9-11, och dämpa drog sensibilisering 12. Som sådan, är taktil stimulering en värdefull teknik för att främja positiva tidiga erfarenheter, med en bevisad förmåga att dramatiskt omorganisera neuronal morfologi och synaptiska uppkoppling av den växande hjärnan.
För att undersöka och kvantifiera förändringar i neuronal morfologi, är det nödvändigt att visualisera intakta nervceller. Golgi-Cox färgningsförfarande är en modifikation av Camillo Golgi teknik som publicerades i slutet av 1800-talet som ger diskret färgning av ett litet antal kompletta nervceller 13. Även om förfarandet förefaller att färga nervceller på måfå och reproducerbarhet brukar framhållas som stor brist, den lilla impregneringshastighet tillåter visualisering av hela neuronala elementet, inklusive cella organ, dendriter, Dendritutskotten och axoner. På samma sätt har den tid som krävs för att impregnera en viss hjärna med Golgi-lösning också nämnts som en undergång. Men med tanke på att när färgningen är klar vävnad kan bevaras på obestämd tid, och tiden mellan perfusion av hjärnan och visualisering av nervceller med ett mikroskop kan genomföras på mindre än 21 dagar, är inte orimligt tidsperioden. Dessutom, med smärre ändringar i protokollet, Golgi-Cox färgning effektivt kan användas för att impregnera hjärnan hos gnagare från alla åldrar. Eftersom förändringar på strukturell nivå har varit kopplade till ihållande ändringar till beteende och psykologisk funktion, ger Golgi-Cox färgningsteknik forskare med ett värdefullt verktyg för att mäta neuroplasticitet.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med den kanadensiska rådet Djurvård och godkänd av universitetet i Lethbridge, Djurvård kommittén.
1. Avel och Taktil Stimulering
- Beställ dräktiga råttor från vanliga djurleverantörer eller föda upp valpar i egen regi med hjälp av vanliga laboratorieavelsförfaranden.
- Hus alla djur i en temperatur kontrollerad avel rum (21 ° C), underhållas på en 12:12 timmars ljus: mörker-cykel och ge tillgång till mat och vatten efter behag.
- När valparna föds, hus honråttor individuellt med sin avkomma.
- För att undvika ytterligare stress i samband med direkt hantering efter födseln, påbörja taktil stimulering av valpar på P3.
- Taktil stimulering bör utföras tre gånger per dag (09:00, 01:00 och 16:00) från P3-P21 och valpar ska avvänjas från sina mödrar vid P21.
- Vid användning av ett kors kull utformning, hälften av valparna frOMs varje kull kommer att genomgå taktil stimulering med den andra halv tjänstgör som kontroller. Slumpmässigt tilldela lika många manliga och kvinnliga valpar till varje grupp. För att skilja valpar genomgår taktil stimulering och kontroller, markera en grupp av valpar med en märkpenna på bakbenen och svansen. Märkning måste åter tillämpas varannan dag.
Taktil Stimulering
- Ta bort dammar från sitt hem bur och placera dem i en tillfällig bur med mat och vatten. Håll dammen och tillfälliga bur i avel / bostadsrummet.
- Väg råttungar som en grupp före morgon taktil stimulering session (9:00). För varje session, valpar transport rat sina hem burar till ett separat test rum för taktil stimulering. Placera buren på en värmedyna som är inställd på 24 ° C.
- Använd en hård board att dela upp buren i två halvor. Placera råttungar i de taktila stimulering grupp en halv-och kontroll ungar i den andra halvan.Ställ in en timer på 15 minuter.
- Med hjälp av en mjuk fjäderliknande dammvippa, borsta alla valpar i taktil stimulering gruppen samtidigt under 15 på varandra följande minuter. De unga råttungar (~ P3-P12) ususally krypa ihop och verkar gå in i en djup sömn cykel vilket gör det mycket enkelt att stimulera alla valpar på en gång. Såsom pups ålder blir de mer aktiva, med några pups promenader och undersöker under sessionen. Försöksledaren ska kontinuerligt flytta vandrande valpar in i gruppen för att se till varje valp får lika stimulans.
- När 15 min sessionen är färdig, transportera valparna tillbaka till avel rummet och återföra moder till buren.
- Upprepa denna process tre gånger om dagen för de 19 dagarna av taktil stimulering. Efter den sista taktil stimulering session på P21, bör valparna avvänjas från sina mödrar. Valpar ska sedan hållas i burar med 5 eller 6 andra avvanda djur av samma kön.
- Om råttor genomgår ingen ytterligare testning, bör de lämnas unstörd, på vanligt ljus: mörker-cykel med tillgång till mat och vatten libitm (bortsett från vanlig bur rengöring och hantering) tills de når cirka 100 dagars ålder. Om genomgå andra experimentella manipulationer, bör djuren behandlas eller testat enligt dessa laboratorieprotokoll.
2. Offra och Golgi-Cox färgning
- Vid ungefär P100, administrera en överdos av natrium pentobarbital via IP-injektion till råttorna och BEGJUTA intracardially med ca 100 ml 0,9% koksaltlösning.
- Extrahera hjärnorna när perfusionen är klar. Ta bort hjärnan från skallen, skära synnerven undertill med försök att hålla den lilla hjärnan intakt, forskare kan välja att behålla eller ta bort lukt glödlampor. Placera extraherade hjärnor i en ogenomskinlig Nalgene flaska med 20 ml Golgi-Cox-lösning 14.
- Håll hjärnan i Golgi-Cox-lösning i 14 dagar. Efter 14 dagar, byt Golgi-Cox-lösning med en 30% sackaroslösning. Håll hjärnorna i sackaroslösning under 2-5 dagar före snittning.
OBS: Om hjärnor inte kan sektioneras inom 14 dagar efter överföring till sackaroslösningen behöver forskaren att ersätta sackaros med ett nytt lager på 30% sackaros. Forskaren kan ersätta sackaros varannan vecka i 4 månader utan några negativa effekter på färgning.
- För att avsnittet hjärnan bör hjärnan vara läskades torra och fixerad vid snittningssteg med cyanocacrylic lim. För att förhindra bristningar eller ojämn sektionering, måste forskaren vara försiktig och se till att hela hjärnan är ordentligt fastsatt i scenen.
- Vibratome behållaren måste fyllas med 6% sackaros lösning på en nivå som täcker snittbladet. Ställ vibratome parametrarna till en hastighet och amplitud till 5, (mittpunkten på båda skalorna). Skiva hjärnan i 200 ìm sektioner och placera sektionerna på en 2% gelatinmikroomfattning slide. Se till att hålla sektionerna våt under snittning.
- När alla delar av intresse har samlats in, tryck avsnitten på bilderna genom att sätta press på de diabilder med fuktat läskpapper. Förvara glasen i en bild rack i fuktkammare tills de är redo att färgas. De bör finnas kvar i fuktkammare i minst 12 timmar, men inte längre än 4 dagar. Bilderna måste vara fuktig och bör inte tillåtas att torka ut.
- Förbered färgning regemente innan du börjar färgningsprocessen. Etikett tolv glasfärgningsskålar (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) och process på följande sätt:
- Destillerat vatten - 1 min
- Ammoniumhydroxid - 30 min (i mörker)
- Destillerat vatten - 1 min
- Kodak Fix för film - 30 min (i mörker)
- Destillerat vatten - 1 min
- 50% Alkohol - 1 min
- 70% Alkohol - 1 min
- 95% Alkohol - 1 min
- 100% Alcohol - 5 min
- 100% alkohol - 5 min
- Lösning (1/3 kloroform, 1/3 HemoDe, 1/3 100% alkohol) - 15 min
- HemoDe - 15 min
* Xylen kan användas ersätta av HemoDe. För att säkerställa en konsekvent färgning kvalitet bör nya lösningar användas för varje bild rack behandlas.
- Efter den sista 15 min emersion i HemoDe, täckglas bilderna med Permount.
- Låt objektglasen lufttorka innan du undersöker med ett mikroskop.
Representative Results
När denna färgningsprocedur har följts på rätt sätt, är konsekvent och enhetlig färgning av dendriter och ryggar som genereras. Se figur 1 för en representation av Golgi-Cox neuronal färgning. Detta förfarande ger fläckar som är jämförbar med den nyutvecklade in vitro-metoder och kan medge visualisering av dendritiska fält som är avbrottsfri följande vävnad inbäddning. Vibratome baserad teknik för Golgi-Cox färgning har visat sig producera mer utbredd färgning av terminal grenar och pyramidala nervceller, än färgning med antingen celloidin inbäddade och kryostat snittad vävnad, 15. Vidare, eftersom denna metod för färgning impregnerar hela hjärnan, alla sektioner kan analyseras antingen omedelbart eller i framtiden. Eftersom platsen för morfologisk förändring är det inte alltid självklart när du skapar en original hypotes, gör denna process för utforskning av ytterligare områden i hjärnan end förhindrar destruktion av vävnad som kan vara användbart i framtiden.
Denna färgningsmetod kan användas för tillförlitlig färgning av några åldrade råtthjärnor (P0-ålderdom). När emellertid färgning unga hjärnor (<1 gram), hjärnan bör endast förbli i Golgi-Cox-lösning för 6 dagar, snarare än de 14 dagar som rekommenderas för vuxna hjärnor; alla andra procedurer som hålls konstanta. Den största svårigheten som kan uppstå under denna Golgi-Cox färgningsprocessen är oförmågan att producera högkvalitativa färgning av centrala områden i hjärnan, inklusive thalamus. Eftersom hela hjärnan impregneras på samma gång, kan centrala regioner inte erhålla ideala koncentrationer av fläcken. Trots detta konstaterande, producerar Golgi-Cox tekniken exceptionell färgning av subkortikala regioner såsom hippocampus och striatum. En slutlig begränsning av förfarandet uppstår ofullständigt avlägsnande av blod från hjärnan under perfusionen processen. Blod kan producera artefakter i hjärnvävnadensom gör det svårt att fotografera och spår nervceller.
Golgi-Cox färgningsteknik ger ett tillförlitligt mått på dendritiska morfologi och neuroanatomi som är användbart för ett omfattande utbud av studier för att undersöka förändringar på neuronal nivå. Vid granskningen av neuronal struktur i prefrontala cortex efter taktil stimulering i tidig postnatal period, avslöjade Golgi-Cox färgning dramatiska ökningar av dendritiska komplexitet. Anatomiska förändringar relaterade till tidig taktil stimulering kan påvisas visuellt genom jämförelse av ryggraden densitet av pyramidala nervceller från en kontrollråtta till pyramidala nervceller från en råtta som undergick taktil stimulering (se figur 1). Dessutom kan parametrar såsom dendritiska arborization, dendritisk längd och ryggraden densitet beräknas och analyseras statistiskt för att generera kontinuerliga data som kan jämföras över djuren. För att generera tillförlitliga resultat, bör analys utföras på amMinimipris av tre djur per behandlingsgrupp och cirka fem neuroner per halvklotet ut slumpvis för varje hjärna region som analyseras. Figur 2 visar den dendritiska komplexitet (ryggar / ìm x ìm av dendrit) av djur som fick taktil stimulering och djur som inte . I båda de apikala och basala områden av de nervceller som analyserats från mPFC (CG3), taktil stimulering resulterade i en ökning av neuronala parametrar.
Figur 1. A. representant fotografi av en Golgi-Cox färgade pyramidala neuron från skikt III i området CG3 i en råtta som fick taktil stimulering under utveckling. B. representant förstoras (1.000 X) fotografi av Dendritutskotten på terminal dendriter på basilar området CG3 , den ljusare bilden till vänster är för en råtta i kontrollgruppen och den mörkare på riGHT är från en råtta som fick taktil stimulering.
Figur 2. Belysande representation av den genomsnittliga apikala och basilar dendritiska komplexitet (ryggar / ìm x mikrometer) för nervceller i CG3 området från vuxna råttor som antingen erhållit taktil stimulering under utveckling eller inte gjorde det (* p <0,01).
Discussion
På grund av det öppna plasticitet i den växande hjärnan, är det viktigt att experimentella förfaranden med tidiga erfarenheter är grundligt och försök görs för att kontrollera för alla mellanliggande variabler. Därför är ett kors kull konstruktion anställd under taktil stimulering förfarande för att se till att valparna får liknande erfarenheter i alla andra områden av utveckling. Dessutom är det också viktigt att multipla pups från flera kullar väljs för analys för att undvika möjligheten att effekter resulterar från en förspänning i en enda pup eller kull.
Taktil stimulering tros efterlikna naturligt förekommande moderns beteende, slickar och grooming, som är tänkt att vara till nytta för avkomma utveckling. Även tidigare forskning har betonat den första levnadsveckan (P0-P7) för att vara en kritisk period för att slicka och grooming 16, den stora omfattningen av förändring identifierades efter 18 dagar av TActile stimulering kan innebära att även känsliga tider finns, är längre exponering överlägsen. Det är också viktigt att notera att valpar som får taktil stimulering i denna experimentella paradigm upplever också slicka och grooming av sina mödrar, därav taktil stimulering är utöver normal stimulering administreras av mamman. Slutligen måste man också vara medveten om regionberoende förändringar. Även om taktil stimulering under utveckling ökade dendritiska komplexiteten i prefrontala cortex, innebär detta inte garantera att strukturella förändringar av detta slag kommer att vara tydlig i alla områden i hjärnan. Det är möjligt att neuronal morfologi i andra områden i hjärnan, såsom den parietala cortex, skulle reagera på ett påfallande annorlunda sätt att samma upplevelse. Men eftersom det taktil stimulering förfarandet är lätt att administrera och inte utgör någon risk för avkomman eller dammar, har den potential att fungera som ett värdefullt verktyg för många forskningsstudier för att förbättra utvecklingenal-resultat.
När det gäller Golgi-Cox färgning av hjärnvävnad, de kritiska stegen för lyckad visualisering av neuronala celler är följande: 1) Det måste finnas tillräcklig perfusion av hjärnan med koksaltlösning. Felaktig eller otillräcklig perfusion av hjärnvävnad leder till blodkärls artefakter som gör det svårt att faktiskt visualisera neuronala celler genom en labyrint av blodkärl, samtidigt som komplicerar möjligheten att fotografera färgade nervceller. 2) perfuserade hjärnor bör förvaras i Golgi-Cox-lösning och sackaros lösning i mörker. Förvaring av hjärnvävnad i mörker minskar bakgrundsfärgning av vävnaden, vilket återigen ökar chansen till framgångsrikt visualisera kvalitets neuronala celler. 3) Hjärnvävnad lagras i sackaros lösning efter 14 dagars lagring i Golgi-Cox-lösning. När vävnaden är nedsänkt i 30% sackaros lösning för 2-5 dagar, hjärnor är mer följsamma som förhindrar splittring och riva av delarna närskärning. Det är viktigt att förhindra hjärnvävnad från står i sackaroslösning för ökade tidsperioder (såvida sackaroslösningen kontinuerligt ersätts med färsk lösning) eftersom det vid långvarig lagring i sukros minskar färgningskvalitet. 4) Slutligen, när slides har målat och omslaget halkade, de bör ges tillräcklig tid att torka innan visualisering med ett mikroskop. Om glider inte tillåts att adekvat lufttorka, kan vävnaden mörkna, minska lyckad visualisering av kortikala neuroner.
Stabila förändringar i psykisk funktion och beteendemässiga reaktioner som uppstår till följd av upplevelser tros underlättas genom omorganisation av neuronal morfologi och synaptic anslutningar 17. Eftersom dessa strukturella förändringar ger en mätbar resurs för erfarenhet beroende plasticitet, är viktigt att använda en tillförlitlig färgningsförfarande. Denna vibratome baserade Golgi-Cox färgningsprocedur ger tillförlitlig fläckning av fina grenar och Dendritutskotten som kanske inte är uppenbara med andra protokoll såsom celloidin-inbäddning. Särskiljningsförmåga Golgi-Cox proceduren härrör från dess förmåga att bara färga en liten del av neuronala element (1-10%), vilket medger spårning av enstaka nervceller för långa avstånd. Trots att endast en liten del av nervceller är impregnerade med fläcken, celler som återges synligt, behålla alla funktioner, inklusive cellkroppen, dendriter, Dendritutskotten och axoner. Dessutom, när färgningsproceduren utförs korrekt, de färgade cellerna framträda klart och tydligt mot en transparent bakgrund eftersom andra kortikala strukturer förblir ofärgade och genomskinliga. På grund av insikten att ihållande förändringar i yttre funktion måste relateras till plasticitet i nervsystemet, det vill säga förmågan att nervceller att ändra sin struktur och anslutningsmöjligheter, ger Golgi-Cox färgningsförfarande forskare med entillförlitlig teknik för att visualisera och kvantifiera denna plasticitet.
Disclosures
Författarna förklarar att vi inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av NSERC bidrag till BK och RG. Författarna vill också tacka Kehe Xie och Russell Hosain för deras Golgi-Cox färgning expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
| Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
| Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
| Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
| EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
| Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
| HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
| Permount | Fisher | Sp15 | |
| Slides | VWR | 160004-365 | |
| Coverslips | VWR | 062011-9 |
References
- Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats. Neuroscience. 180, 105-110 (2011).
- Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex. Neuroscience. 216, 103-109 (2012).
- Wiesel, T., Hubel, D. Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).
- Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. The dynamic effects of nicotine on the developing brain. Pharmacology & Therapeutics. 122, 125-139 (2009).
- Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats. Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).
- Schanberg, S., Field, T. Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate. Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).
- Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).
- Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats. Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).
- Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats. Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).
- Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Brain Research. 1002, 94-99 (2004).
- Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex. Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).
- Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner. Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello. Gaz Med Lomb. 33, 244-246 Forthcoming.
- Glaser, E. M., van der Loos, H. Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).
- Meaney, M. Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations. Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
