Summary
इस पत्र में चूहे पिल्ले का स्पर्श उत्तेजना और neuronal आकारिकी के बाद Golgi-कॉक्स धुंधला के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. स्पर्श उत्तेजना एक घर डस्टर से पिल्ले पथपाकर द्वारा प्रसवकालीन अवधि में किया जाता है कि एक सकारात्मक अनुभव है. Golgi-कॉक्स धुंधला पूरे न्यूरॉन्स के दृश्य की अनुमति एक विश्वसनीय प्रक्रिया है.
Abstract
व्यवहार में दीर्घकालीन परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए, अनुभवों neuronal आकारिकी और synaptic संपर्क में स्थिर परिवर्तन का निर्माण किया जाना चाहिए. स्पर्श उत्तेजना mimics चाट और चूहे में संवारने मातृक कि एक सकारात्मक जल्दी अनुभव है. इस सकारात्मक अनुभव को चूहे पिल्ले को उजागर ऐसे एक घर डस्टर के रूप में अत्यधिक सुलभ सामग्री का उपयोग करके आसानी से और लागत प्रभावी ढंग से पूरा किया जा सकता है. एक पार कूड़े डिजाइन का प्रयोग, पिल्ले या तो 15 मिनट, प्रसवकालीन अवधि के दौरान प्रति दिन तीन बार के लिए, stroked या undisturbed छोड़ दिया जाता है. इस सकारात्मक जल्दी अनुभव से संबंधित तंत्रिकाजाल बदलाव को मापने, मस्तिष्क के ऊतकों की Golgi-कॉक्स धुंधला उपयोग किया जाता है. Golgi-कॉक्स संसेचन बल्कि सभी कक्षों की तुलना में न्यूरॉन्स की एक असतत संख्या दाग है कि इस तथ्य के कारण, Golgi-कॉक्स समाधान के साथ कृंतक मस्तिष्क का धुंधला सेल शरीर, dendrites, axons सहित पूरे neuronal तत्वों, के दृश्य परमिट, और वृक्ष के समान spines. धुंधला प्रक्रिया मैंएस कई दिनों से बाहर ले गए और शोधकर्ता विस्तार के लिए करीब ध्यान देना आवश्यक है. धुंधला पूरा हो गया है हालांकि, एक बार पूरे मस्तिष्क गर्भवती कर दिया गया है और चल रहे विश्लेषण के लिए अनिश्चित काल के लिए संरक्षित किया जा सकता है. इसलिए, Golgi-कॉक्स धुंधला अनुभव पर निर्भर plasticity के अध्ययन के लिए एक बहुमूल्य संसाधन है.
Introduction
ऐसे प्रसवकालीन तनाव 1,2, संवेदी अभाव 3, और दवा विषाक्तता के रूप में 4 मस्तिष्क परिपक्वता पर नकारात्मक जल्दी अनुभवों, की परीक्षा के लिए कई सूचना दी और उपयोग तकनीकों हैं हालांकि, में सकारात्मक अनुभवों के प्रभाव की जांच करने के लिए नियोजित बहुत कुछ तरीके होते हैं इस समय अवधि. एक तरफ पर्यावरण संवर्धन से, स्पर्श उत्तेजना का प्रदर्शन प्रभाव 5 के साथ उपचार बढ़ाने के कुछ दिमाग में से एक है. स्पर्श उत्तेजना चाट और संवारने, मातृ चूहे व्यवहार mimics है कि त्वचा के लिए संवेदी उत्तेजना का एक तरीका है. एक सकारात्मक हेरफेर के रूप में अपने सामान्य स्वीकृति स्पर्श उत्तेजना समय से पहले शिशुओं और नवजात चूहों 6 की परिपक्वता सुधार का संकेत है कि पढ़ाई से उत्पन्न होती है. इसके अलावा, Meaney प्रयोगशाला 7 में अनुसंधान मातृ चाट और सौंदर्य के उच्च स्तर संतानों में सकारात्मक परिणाम के लिए जुड़े हुए हैं कि प्रदर्शन किया है. टी के कारणhese सकारात्मक प्रभाव पड़ता है, स्पर्श उत्तेजना तेजी, चिंता 8 को कम करने के लिए मस्तिष्क की चोट 9-11 के साथ जुड़े परिणामों में सुधार लाने, और दवा संवेदीकरण 12 attenuating के उद्देश्य से एक उपचारात्मक रणनीति में विकसित हुआ. जैसे, स्पर्श उत्तेजना नाटकीय रूप से neuronal आकारिकी और विकासशील मस्तिष्क की synaptic कनेक्टिविटी के पुनर्निर्माण के लिए एक साबित करने की क्षमता के साथ सकारात्मक जल्दी अनुभवों को बढ़ावा देने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है.
जांच और neuronal आकारिकी में बदलाव यों के लिए, इसे बरकरार न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए आवश्यक है. Golgi-कॉक्स धुंधला प्रक्रिया पूरी न्यूरॉन्स 13 की एक छोटी संख्या के असतत धुंधला प्रदान करता है कि 1800 के अंत में प्रकाशित Camillo Golgi की तकनीक के एक संशोधन है. प्रक्रिया यादृच्छिक और reproducibility सामान्यतः CE सहित प्रमुख दोष, पूरे neuronal तत्व के छोटे संसेचन दर परमिट दृश्य, के रूप में पेश किया जाता है पर न्यूरॉन्स दाग दिखाई देता है हालांकिडालूँगा निकायों, डेन्ड्राइट, वृक्ष के समान spines, और axons. इसी तरह, Golgi समाधान के साथ दिया मस्तिष्क व्याप्त करने के लिए आवश्यक समय भी एक पतन के रूप में उद्धृत किया गया है. हालांकि, धुंधला पूरा ऊतक अनिश्चित काल के लिए संरक्षित किया जा सकता है, और एक खुर्दबीन के साथ न्यूरॉन्स के मस्तिष्क और दृश्य के छिड़काव के बीच समय कम से कम 21 दिनों में पूरा किया जा सकता है एक बार, समय अवधि अनुचित नहीं है कि दिए गए. इसके अलावा, प्रोटोकॉल को मामूली संशोधनों के साथ, Golgi-कॉक्स धुंधला प्रभावी रूप से सभी आयु वर्ग से कृन्तकों के दिमाग व्याप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संरचनात्मक स्तर पर परिवर्तन व्यवहार और मनोवैज्ञानिक कामकाज को लगातार संशोधन करने के लिए जोड़ा गया है के रूप में, Golgi-कॉक्स धुंधला तकनीक neuroplasticity को मापने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है.
Protocol
सभी प्रयोगों पशु की देखभाल के कनाडा परिषद के अनुसार किया जाता है और कैलगरी विश्वविद्यालय, पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. प्रजनन और स्पर्श उत्तेजना
- आम पशु आपूर्तिकर्ताओं से गर्भवती चूहों आदेश या मानक प्रयोगशाला प्रजनन प्रक्रियाओं का उपयोग घर में पिल्ले नस्ल.
- हाउस एक 12:12 घंटा बत्ती पर बनाए रखा तापमान नियंत्रित प्रजनन कक्ष (21 डिग्री सेल्सियस), में सभी जानवरों: अंधेरे चक्र और भोजन और पानी यथेच्छ के लिए उपयोग प्रदान करते हैं.
- व्यक्तिगत रूप से उनके वंश के साथ पिल्ले पैदा होते हैं, घर मादा चूहों.
- जन्म के तुरंत बाद से निपटने से संबंधित अतिरिक्त तनाव से बचने के लिए, पी 3 पर पिल्ले का स्पर्श उत्तेजना शुरू.
- स्पर्श उत्तेजना पी 3-P21 से प्रति दिन तीन बार (09:00, 01:00, और 16:00) बाहर किया जाना चाहिए और पिल्ले P21 पर अपनी मां से weaned किया जाना चाहिए.
- एक क्रॉस कूड़े डिजाइन का उपयोग करते हैं, पिल्ले के आधे frओम प्रत्येक कूड़े अन्य आधा नियंत्रण के रूप में सेवा के साथ स्पर्श उत्तेजना से गुजरना होगा. बेतरतीब ढंग से प्रत्येक समूह के लिए पुरुष और महिला पिल्ले के बराबर संख्या आवंटित. , स्पर्श उत्तेजना और नियंत्रण के दौर से गुजर पिल्ले को अलग अपने पिछले पैरों और पूंछ पर एक स्थायी मार्कर के साथ पिल्ले के एक समूह को चिह्नित करने के लिए. चिह्नित हर दूसरे दिन फिर से लागू हो गया है.
स्पर्श उत्तेजना
- उनके घर के पिंजरे से बांधों निकालें और भोजन और पानी के साथ एक अस्थायी पिंजरे में उन्हें जगह है. प्रजनन / आवास के कमरे में बांध और अस्थायी पिंजरे रखें.
- पूर्व सुबह स्पर्श उत्तेजना सत्र (09:00) करने के लिए एक समूह के रूप में चूहे पिल्ले वजन. प्रत्येक सत्र के लिए, परिवहन चूहे स्पर्श उत्तेजना के लिए एक अलग कमरा परीक्षण करने के लिए उनके घर पिंजरों पिल्ले. 24 डिग्री सेल्सियस पर सेट है कि एक हीटिंग पैड पर घर पिंजरे रखें
- दो हिस्सों में घर पिंजरे विभाजित करने के लिए एक कड़ी बोर्ड का उपयोग करें. अन्य छमाही में स्पर्श उत्तेजना समूह एक आधा और नियंत्रण पिल्ले में चूहे पिल्ले रखें.15 मिनट के लिए एक टाइमर सेट.
- एक नरम पंख की तरह डस्टर का प्रयोग, लगातार 15 मिनट के लिए एक ही समय में स्पर्श उत्तेजना समूह में सभी पिल्ले ब्रश. युवा चूहे पिल्ले (~ पी 3-P12) ususally एक साथ शर्त और यह बहुत आसान है एक बार में सभी पिल्ले को प्रोत्साहित करने के लिए बना एक गहरी नींद चक्र में प्रवेश करने के लिए दिखाई देते हैं. पिल्ले उम्र के रूप में, वे कुछ पिल्ले चल रहा है और सत्र के दौरान की जांच के साथ, और अधिक सक्रिय हो जाते हैं. प्रयोगकर्ता लगातार प्रत्येक पिल्ला बराबर उत्तेजना प्राप्त करता है यह सुनिश्चित करने के लिए समूह में भटक पिल्ले बढ़ना चाहिए.
- 15 मिनट के सत्र के पूरा होने के बाद वापस प्रजनन कमरे में पिल्ले को परिवहन और पिंजरे में मां वापसी.
- स्पर्श उत्तेजना के 19 दिनों के लिए इस प्रक्रिया को दिन में तीन बार दोहराएँ. P21 पर अंतिम स्पर्श उत्तेजना सत्र के बाद, पिल्ले अपनी माँ से weaned किया जाना चाहिए. पिल्ले तो एक ही सेक्स के 5 या 6 अन्य weaned जानवरों के साथ पिंजरों में रखा जाना चाहिए.
- चूहों कोई अतिरिक्त परीक्षण के दौर से गुजर रहे हैं, तो वे संयुक्त राष्ट्र छोड़ दिया जाना चाहिएभोजन और (एक तरफ नियमित पिंजरे की सफाई और हैंडलिंग से) वे उम्र के लगभग 100 दिनों तक पहुंचने तक पानी विज्ञापन libitm के उपयोग के साथ अंधेरे चक्र: सामान्य प्रकाश पर परेशान. अन्य प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के दौर से गुजर, तो जानवरों उन प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार व्यवहार या परीक्षण किया जाना चाहिए.
2. बलिदान और Golgi-कॉक्स धुंधला
- लगभग P100, चूहों को आईपी इंजेक्शन के माध्यम से pentobarbital सोडियम की अधिक मात्रा के लिए प्रशासन और 0.9% खारा के लगभग 100 मिलीलीटर के साथ intracardially छिड़कना.
- छिड़काव पूरा हो गया है जब दिमाग निकालें. बरकरार सेरिबैलम रखने के प्रयास के साथ नीचे ऑप्टिक तंत्रिका में कटौती, खोपड़ी से दिमाग निकालें, शोधकर्ताओं घ्राण बल्ब रखने या हटाने के लिए चुन सकते हैं. Golgi-कॉक्स समाधान 14 से 20 मिलीलीटर के साथ एक अपारदर्शी Nalgene बोतल में निकाला दिमाग रखें.
- 14 दिनों के लिए Golgi-कॉक्स समाधान में दिमाग रखें. 14 दिनों के बाद, Golgi सी की जगहएक 30% sucrose के समाधान के साथ बैल हल. सेक्शनिंग से पहले 2-5 दिनों के लिए sucrose के समाधान में दिमाग रखें.
नोट: दिमाग sucrose के समाधान के लिए स्थानांतरण के 14 दिनों के भीतर sectioned नहीं किया जा सकता है, तो शोधकर्ता 30% sucrose के एक नए स्टॉक के साथ सुक्रोज की जगह की जरूरत है. शोधकर्ता धुंधला पर कोई प्रतिकूल प्रभाव के साथ 4 महीने के लिए सुक्रोज हर दो सप्ताह की जगह ले सकती.
- खंड मस्तिष्क के क्रम में, मस्तिष्क ड्राई मिट जाना चाहिए और cyanocacrylic गोंद के साथ सेक्शनिंग चरण के लिए तय की. फाड़ या असमान सेक्शनिंग रोकने के लिए, शोधकर्ता सतर्क हो और पूरे मस्तिष्क मजबूती चरण के लिए सुरक्षित है, यह सुनिश्चित करना चाहिए.
- vibratome जलाशय सेक्शनिंग ब्लेड को शामिल किया गया है कि एक स्तर तक 6% sucrose के समाधान के साथ भरा होना चाहिए. 5 के लिए एक गति और आयाम, (दोनों तराजू पर मध्य) को vibratome मानकों सेट. 200 माइक्रोन वर्गों में मस्तिष्क टुकड़ा और एक 2% gelatinized सूक्ष्म पर वर्गों रखेंगुंजाइश स्लाइड. सेक्शनिंग के दौरान गीला वर्गों रखना सुनिश्चित करें.
- ब्याज की वर्गों के सभी एकत्र किया गया है, जब सिक्त शराबी कागज के साथ स्लाइड के लिए दबाव लागू करने से स्लाइड्स पर वर्गों दबाएँ. वे दाग होने के लिए तैयार हैं जब तक नमी कक्ष में एक स्लाइड रैक में स्लाइड्स स्टोर. वे 4 दिनों से अधिक समय से कम से कम 12 घंटे के लिए आर्द्रता चैम्बर में बने हुए हैं, लेकिन नहीं किया जाना चाहिए. स्लाइड नम होने की जरूरत है और बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं होना चाहिए.
- धुंधला प्रक्रिया शुरू होने से पहले धुंधला रेजिमेंट तैयार करें. लेबल बारह गिलास धुंधला व्यंजन निम्नलिखित तरीके से (10.7 x 8.5 x 6.8 सेमी) और प्रक्रिया:
- आसुत जल - 1 मिनट
- अमोनियम हाइड्रॉक्साइड - 30 मिनट (अंधेरे में)
- आसुत जल - 1 मिनट
- (अंधेरे में) 30 मिनट - कोडक फिल्म के लिए फिक्स
- आसुत जल - 1 मिनट
- 50% शराब - 1 मिनट
- 70% शराब - 1 मिनट
- 95% शराब - 1 मिनट
- 100% alcohराजभाषा - 5 मिनट
- 100% शराब - 5 मिनट
- समाधान (1/3 क्लोरोफॉर्म, 1/3 HemoDe, 1/3 100% शराब) - 15 मिनट
- HemoDe - 15 मिनट
* Xylene HemoDe की जगह में इस्तेमाल किया जा सकता है. लगातार धुंधला गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, ताजा समाधान प्रसंस्कृत प्रत्येक स्लाइड रैक के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- HemoDe में पिछले 15 मिनट उत्थान के बाद, Permount साथ स्लाइड coverslip.
- एक खुर्दबीन के साथ जांच करने से पहले शुष्क हवा की स्लाइड की अनुमति दें.
Representative Results
इस धुंधला प्रक्रिया उचित रूप से पालन किया गया है जब, सुसंगत और वर्दी डेन्ड्राइट का धुंधला हो जाना और कांटा उत्पन्न होता है. Golgi-कॉक्स neuronal धुंधला का एक प्रतिनिधित्व के लिए चित्रा 1 देखें. यह प्रक्रिया Uninterruptable निम्नलिखित ऊतक एम्बेड कर रहे हैं कि वृक्ष के समान क्षेत्रों के नव विट्रो तरीकों में विकसित किया है और अनुमति दे सकता है दृश्य करने के लिए तुलनीय है कि धुंधला पैदा करता है. Golgi-कॉक्स धुंधला के लिए vibratome आधारित तकनीक के साथ धुंधला से, टर्मिनल शाखाओं और पिरामिड न्यूरॉन्स के अधिक व्यापक धुंधला उत्पादन पाया गया है या तो celloidin एम्बेडेड और cryostat से sectioned ऊतक, 15. धुंधला की इस पद्धति पूरे मस्तिष्क impregnates क्योंकि इसके अलावा, सभी वर्गों या तो तुरंत या भविष्य में विश्लेषण किया जा सकता है. रूपात्मक बदलाव का स्थान एक मूल परिकल्पना पैदा जब यह हमेशा स्पष्ट नहीं है के रूप में, इस प्रक्रिया में अतिरिक्त मस्तिष्क क्षेत्रों की खोज के लिए अनुमति देता है एकडी भविष्य में उपयोगी हो सकता है कि ऊतक के निपटान से बचाता है.
यह धुंधला विधि किसी भी आयु वर्ग के चूहे के दिमाग (P0-बुढ़ापे) की विश्वसनीय धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. युवा दिमाग (<1 ग्राम) धुंधला हालांकि, जब मस्तिष्क ही नहीं बल्कि वयस्क दिमाग के लिए सिफारिश की 14 दिनों की तुलना में, 6 दिनों के लिए Golgi-कॉक्स समाधान में रहना चाहिए, अन्य सभी प्रक्रियाओं लगातार आयोजित की जाती हैं. इस Golgi-कॉक्स धुंधला प्रक्रिया के दौरान सामना किया जा सकता है कि मुख्य कठिनाई चेतक सहित केंद्रीय मस्तिष्क क्षेत्रों के उच्च गुणवत्ता वाले धुंधला उत्पादन करने में असमर्थता है. पूरे मस्तिष्क में एक ही समय में गर्भवती है के रूप में, मध्य क्षेत्रों दाग की आदर्श सांद्रता प्राप्त नहीं हो सकता. इस खोज के बावजूद, Golgi-कॉक्स तकनीक ऐसे हिप्पोकैम्पस और striatum रूप subcortical क्षेत्रों की असाधारण धुंधला पैदा करता है. प्रक्रिया की एक अंतिम सीमा छिड़काव की प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क से खून की अधूरी हटाने से पैदा होती है. खून मस्तिष्क के ऊतकों में कलाकृतियों का उत्पादन हो सकताकि यह मुश्किल न्यूरॉन्स तस्वीर और पता लगाने के लिए बनाता है.
Golgi-कॉक्स धुंधला तकनीक neuronal स्तर पर परिवर्तन की जांच करने के लिए डिजाइन अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी है कि वृक्ष के समान आकृति विज्ञान और neuroanatomy का एक विश्वसनीय उपाय प्रदान करते हैं. जल्दी प्रसव के बाद की अवधि में स्पर्श उत्तेजना निम्नलिखित प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में neuronal संरचना की जांच करते हैं, Golgi-कॉक्स धुंधला वृक्ष के समान जटिलता में नाटकीय वृद्धि का पता चला. जल्दी स्पर्श उत्तेजना से संबंधित संरचनात्मक परिवर्तन (चित्रा 1 देखें) स्पर्श उत्तेजना लिया है कि एक चूहे से न्यूरॉन्स पिरामिड के लिए एक नियंत्रण चूहे से पिरामिड न्यूरॉन्स की रीढ़ की हड्डी घनत्व की तुलना द्वारा नेत्रहीन का प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, इस तरह के वृक्ष के समान द्रुमायण, वृक्ष के समान लंबाई, और रीढ़ की हड्डी के घनत्व के रूप में मानकों की गणना की और सांख्यिकीय जानवरों भर में तुलना की जा सकती है कि निरंतर डेटा उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करने, विश्लेषण AM पर बाहर किया जाना चाहिएइलाज समूह प्रति तीन जानवरों और गोलार्द्ध के अनुसार लगभग पांच न्यूरॉन्स की inimum बेतरतीब ढंग से विश्लेषण के तहत प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए चयनित किया जाना चाहिए. चित्रा 2 वृक्ष के समान जटिलता स्पर्श उत्तेजना और नहीं था कि जानवरों कि प्राप्त जानवरों की (डेन्ड्राइट का कांटा / माइक्रोन x माइक्रोन) को दर्शाता है . MPFC (Cg3) से विश्लेषण किया न्यूरॉन्स के दोनों शिखर और आधारी क्षेत्रों में, स्पर्श उत्तेजना neuronal मापदंडों के प्रसार में हुई.
चित्रा 1. एक Golgi-कॉक्स के ए प्रतिनिधि फोटोग्राफ विकास के दौरान स्पर्श उत्तेजना प्राप्त है कि एक चूहे में क्षेत्र Cg3 की परत III से पिरामिड न्यूरॉन दाग. बी प्रतिनिधि Cg3 की आधारी क्षेत्र में टर्मिनल डेन्ड्राइट पर वृक्ष के समान spines के (1000 एक्स) तस्वीर बढ़ाया ; बाईं तरफ हल्का छवि नियंत्रण समूह में एक चूहा और आरआई पर गहरे रंग की छवि के लिए हैght स्पर्श उत्तेजना प्राप्त जो एक चूहे से है.
चित्रा 2. या तो (* <0.01 पी) के विकास के दौरान स्पर्श उत्तेजना या प्राप्त नहीं किया था कि वयस्क चूहों से Cg3 क्षेत्र में न्यूरॉन्स के लिए औसत शिखर और आधारी वृक्ष के समान जटिलता (कांटा / माइक्रोन x माइक्रोन) की व्याख्यात्मक प्रतिनिधित्व.
Discussion
विकासशील मस्तिष्क के प्रकट plasticity के कारण, यह जल्दी अनुभवों को शामिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को अच्छी तरह से समीक्षा कर रहे हैं और प्रयास सभी हस्तक्षेप चर के लिए नियंत्रित करने के लिए किए गए हैं जो महत्वपूर्ण है. इस कारण से, एक क्रॉस कूड़े डिजाइन पिल्ले विकास के सभी अन्य डोमेन में इसी तरह के अनुभव प्राप्त कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए स्पर्श उत्तेजना प्रक्रिया के दौरान कार्यरत है. इसके अलावा, यह कई litters से कई पिल्ले प्रभाव एक भी पिल्ला या कूड़े में एक पूर्वाग्रह से होने वाली संभावना से बचने के विश्लेषण के लिए चयन कर रहे हैं कि यह भी महत्वपूर्ण है.
स्पर्श उत्तेजना चाट और संतानों के विकास के लिए फायदेमंद माना जाता है, जो सौंदर्य, स्वाभाविक रूप से होने वाली मातृ व्यवहार की नकल करने के लिए माना जाता है. पूर्व अनुसंधान जीवन के पहले सप्ताह (P0-P7) 16 चाट और संवारने के लिए एक महत्वपूर्ण अवधि के होने की बात पर जोर दिया गया है, परिवर्तन की सरासर परिमाण प्रादेशिक सेना के 18 दिनों के बाद पहचानctile उत्तेजना संवेदनशील बार मौजूद हैं, अब जोखिम बेहतर है कि संकेत हो सकता है. यह इस प्रयोगात्मक प्रतिमान में स्पर्श उत्तेजना प्राप्त पिल्ले भी इसलिए स्पर्श उत्तेजना मां द्वारा प्रशासित सामान्य उत्तेजना के अतिरिक्त है, उनकी माताओं द्वारा चाट और सौंदर्य का अनुभव भी ध्यान दें कि महत्वपूर्ण है. अंत में, एक भी क्षेत्र पर निर्भर परिवर्तन का जानकार होना चाहिए. विकास के दौरान स्पर्श उत्तेजना प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में वृक्ष के समान जटिलता में वृद्धि हुई है, यह इस प्रकार की संरचनात्मक परिवर्तनों सभी मस्तिष्क क्षेत्रों में स्पष्ट हो जाएगा कि गारंटी नहीं है. यह ऐसी पार्श्विका प्रांतस्था के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में neuronal आकारिकी, उसी अनुभव को एक strikingly अलग ढंग से प्रतिक्रिया देंगे कि संभव है. स्पर्श उत्तेजना प्रक्रिया आसानी से प्रशासित और वंश या बांधों के लिए कोई खतरा बन गया है क्योंकि हालांकि, यह विकास में सुधार लाने के उद्देश्य से कई शोध अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम करने की क्षमता हैअल परिणामों.
इस प्रकार के रूप में मस्तिष्क के ऊतकों की Golgi-कॉक्स धुंधला करने के लिए सम्मान के साथ, neuronal कोशिकाओं के सफल दृश्य के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) नमकीन घोल के साथ मस्तिष्क की पर्याप्त छिड़काव होना चाहिए. भी दाग न्यूरॉन्स तस्वीर करने के लिए क्षमता उलझी जबकि यह मुश्किल है, वास्तव में रक्त वाहिकाओं की भूलभुलैया के माध्यम से neuronal कोशिकाओं कल्पना करने के लिए बना है कि रक्त वाहिनियों की कलाकृतियों में मस्तिष्क के ऊतकों के परिणाम की अनुचित या अपर्याप्त छिड़काव. 2) perfused दिमाग Golgi-कॉक्स समाधान और अंधेरे में sucrose के समाधान में संग्रहित किया जाना चाहिए. अंधेरे में मस्तिष्क के ऊतकों के संचय फिर सफलतापूर्वक गुणवत्ता neuronal कोशिकाओं visualizing के अवसर बढ़ाने, ऊतक की पृष्ठभूमि धुंधला कम कर देता है. 3) मस्तिष्क ऊतक Golgi-कॉक्स समाधान में 14 दिन का भंडारण निम्नलिखित sucrose के समाधान में संग्रहीत किया जाता है. ऊतक 2-5 दिनों के लिए 30% sucrose के समाधान में डूब जाता है, तो दिमाग बिखरता और वर्गों की फाड़ रोकता है जो अधिक लचीला कर रहे हैं जबकाटने. यह (sucrose के समाधान के लिए लगातार ताजा समाधान के साथ बदल जाता है जब तक) सुक्रोज में लंबे समय तक भंडारण धुंधला गुणवत्ता को कम कर देता है क्योंकि वृद्धि की समय अवधि के लिए sucrose के समाधान में शेष से मस्तिष्क के ऊतकों को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. स्लाइड दाग दिया गया है और कवर फिसल एक बार 4) अंत में, वे एक खुर्दबीन के साथ दृश्य से पहले सूखे की पर्याप्त समय दिया जाना चाहिए. स्लाइड पर्याप्त रूप से शुष्क हवा करने की अनुमति नहीं कर रहे हैं, ऊतक cortical न्यूरॉन्स के सफल दृश्य को कम करने, काला कर सकता है.
अनुभवों के जवाब में होते हैं कि मनोवैज्ञानिक कार्य और व्यवहार प्रतिक्रियाओं में स्थिर परिवर्तन neuronal आकारिकी और synaptic कनेक्टिविटी 17 के पुनर्गठन से मदद की जा करने के लिए माना जाता है. इन संरचनात्मक परिवर्तनों के अनुभव पर निर्भर plasticity के लिए एक औसत दर्जे का संसाधन उपलब्ध कराने के रूप में, एक विश्वसनीय धुंधला प्रक्रिया का उपयोग महत्वपूर्ण है. इस vibratome आधारित Golgi-कॉक्स धुंधला प्रक्रिया विश्वसनीय दाग प्रदान करता हैऐसे celloidin-embedding के रूप में अन्य प्रोटोकॉल के साथ स्पष्ट नहीं हो सकता है कि ठीक शाखाओं और वृक्ष के समान spines के आईएनजी. Golgi-कॉक्स प्रक्रिया की विशिष्टता केवल लंबी दूरी के लिए एकल न्यूरॉन्स की ट्रेसिंग जो परमिट neuronal तत्वों (1-10%), का एक छोटा सा अंश दाग अपनी क्षमता से उपजा है. न्यूरॉन्स का केवल एक छोटा सा अंश दाग के साथ गर्भवती हैं कि इस तथ्य के बावजूद, दिखाई प्रदान कर रहे हैं कि कोशिकाओं, सेल शरीर, डेन्ड्राइट, वृक्ष के समान spines और axons सहित सभी सुविधाओं को बनाए रखने. अन्य cortical संरचनाओं बेदाग और पारदर्शी रहना क्योंकि इसके अलावा, धुंधला प्रक्रिया सही ढंग से किया जाता है, जब दाग कोशिकाओं एक पारदर्शी पृष्ठभूमि के खिलाफ स्पष्ट रूप से और स्पष्ट रूप से बाहर खड़े हो जाओ. जावक कामकाज में लगातार परिवर्तन तंत्रिका तंत्र के plasticity से संबंधित होना चाहिए कि प्राप्ति के कारण, उनकी संरचना और कनेक्टिविटी को संशोधित करने के न्यूरॉन्स की क्षमता यानी, Golgi-कॉक्स धुंधला प्रक्रिया के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है एकइस plasticity कल्पना और यों को विश्वसनीय तकनीक.
Disclosures
लेखकों हम कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम बीके और आरजी को NSERC अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों को भी उनके Golgi-कॉक्स धुंधला विशेषज्ञता के लिए Kehe झी और रसेल Hosain धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
| Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
| Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
| Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
| EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
| Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
| HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
| Permount | Fisher | Sp15 | |
| Slides | VWR | 160004-365 | |
| Coverslips | VWR | 062011-9 |
References
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