Summary
Corsi a tempo per l'attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.
Abstract
Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) accise il mutageno ossidativo lesione del DNA 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) dal DNA. Caratterizzazione cinetica di OGG1 è intrapresa per misurare i tassi di escissione 8-oxoG e rilascio del prodotto. Quando la concentrazione è inferiore OGG1 DNA substrato, andamento nel tempo della formazione del prodotto siano bifasici, una rapida fase esponenziale (cioè burst) di formazione del prodotto è seguita da una fase di stato lineare. Il burst iniziale di formazione del prodotto corrisponde alla concentrazione di enzima agganciati bene sul substrato, e l'ampiezza scoppio dipende dalla concentrazione di enzima. La costante del burst di velocità di primo ordine corrisponde alla frequenza intrinseca di escissione 8-oxoG e il tasso di stato stazionario lento misura il tasso di rilascio del prodotto (prodotto di DNA tasso costante di dissociazione, k off). Qui, descriviamo approcci allo steady-state, pre-steady-state, e single-fatturato di isolare e misurare sppassi ecific durante OGG1 ciclismo catalitico. Un oligonucleotide marcato fluorescente lesione contenente OGG1 purificati e sono utilizzati per facilitare misurazioni cinetiche precise. Poiché le concentrazioni enzimatiche basse sono utilizzate per effettuare misurazioni di stato stazionario, manuale miscelazione dei reagenti e tempra della reazione può essere eseguita per accertare il tasso di stato stazionario (k off). Ulteriormente, estrapolazione del tasso steady state ad un punto in ordinata al tempo zero indica che un burst di formazione del prodotto è verificato durante la prima turnover (cioè intercetta è positivo). La costante della fase di scoppio esponenziale di velocità di primo ordine può essere misurata usando una tecnica di miscelazione e tempra rapida che esamina la quantità di prodotto formato ad intervalli di tempo brevi (<1 sec) prima della fase stazionaria e corrisponde al tasso di 8 -oxoG escissione (cioè chimica). Il passo chimica può anche essere misurata utilizzando un approccio a singolo giro d'affari in cui il ciclismo catalitica èimpedito saturando DNA substrato con l'enzima (E> S). Questi approcci possono misurare le costanti di velocità elementari che influenzano l'efficienza di rimozione di una lesione del DNA.
Introduction
Un ambiente aerobico affretta instabilità genomica. Un grave lesione del DNA promutagena che si realizza derivanti da stress ossidativo è 7,8-diidro-8-oxoguanine (8-oxoG). Ciò è dovuto al potenziale codifica ambiguo di 8-oxoG. Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) è responsabile dell'avvio base di riparazione per escissione di 8-oxoG. L'attività glicosilasi di OGG1 accise della base 8-oxoG conseguente DNA prodotto con un sito apurinico (AP-site). Una debole attività liasi di OGG1 può incidere la AP-site in alcuni casi.
Caratterizzazione cinetica di glycosylases DNA trova generalmente tale da presentare i corsi tempo bifasico. Dopo una fase iniziale di rapida formazione del prodotto (cioè burst), una fase di stato lineare si osserva 1-3. Questo comportamento è indicativo di un passo successivo di chimica (cioè cambiamento conformazionale o rilascio di prodotto) essendo limitante durante la porzione lineare del corso di tempo, mentre la fresast fase, spesso definito come la fase transitoria, corrisponde alla formazione del prodotto presso il sito attivo dell'enzima durante il primo ciclo della reazione. Quando rilascio del prodotto è il tasso di limitare durante la fase a regime, misure di attività forniscono una misura qualitativa del DNA prodotto affinità di legame, ma non forniscono informazioni cinetica relativa eventi presso il sito attivo dell'enzima (cioè chimica). Pertanto, sono necessari metodi per isolare e misurare la fase di pre-scoppio stazionario esponenziale per sondare eventi durante la prima turnover enzimatica a 4 sito attivo dell'enzima.
Ci sono tre approcci cinetici standard per caratterizzare il comportamento catalitico di OGG1, (1) allo stato stazionario, (2) pre-steady-state, e (3) un solo fatturato. Questi approcci differiscono l'uno dall'altro per la concentrazione di enzima nella miscela di reazione e l'enzima di rapporto substrato utilizzato in ogni approccio. In un tipico approccio di stato stazionario,talvolta indicato come multipli cinetica fatturato, basse concentrazioni di enzima sono usati per seguire formazione del prodotto. La concentrazione del substrato supera notevolmente la concentrazione dell'enzima modo che più fatturati enzimatiche non influenzano significativamente la concentrazione del substrato. In questa situazione, i corsi tempo dovrebbe essere lineare e spesso è difficile discernere se un burst avvenute nella prima turnover causa della bassa concentrazione di enzima usato in questo approccio, si noti che l'ampiezza di scoppio è equivalente alla concentrazione dell'enzima. Questo può essere superato utilizzando una concentrazione dell'enzima superiore ed estrapolando il decorso lineare per tempo zero per rilevare se il primo turnover enzimatico verificato rapidamente. L'intercetta sulle ordinate (asse y) deve essere proporzionale alla concentrazione dell'enzima e fornisce una misura dell'enzima attivamente impegnati con il substrato. Sebbene questo approccio può in linea di principio fornire prova dell'esistenza di una fase di scoppio, una differenti approccio è necessario per misurare la cinetica della fase di scoppio. In molti casi la fase di scoppio è troppo veloce per misurare con tecniche di miscelazione e spegnimento manuali. In questa situazione, cinetico pre-stazionario e single-turnover (cioè cinetica transitoria) avvicina spesso richiedono uno strumento rapida miscelazione e tempra a seguire primi punti di tempo di una reazione 5. In un approccio pre-stazionario alte concentrazioni di enzima vengono utilizzati in modo che una quantità significativa di prodotto si forma durante la prima turnover. Poiché più fatturati vengono seguiti per osservare ciclismo catalitico (cioè la fase lineare che segue il burst), concentrazione del substrato è maggiore della concentrazione dell'enzima ([enzima] <[substrato]). Per isolare eventi al sito attivo dell'enzima senza il ciclo catalitico, le condizioni single turnover sono utilizzati. In questo caso, il substrato è saturo di enzima (E >> S) in modo che tutto il substrato parteciperanno in la 'single fatturato' e in genere mostrano un corso a tempo singolo esponenziale.
Come notato sopra per gli enzimi che esibiscono una fase di scoppio, rilascio del prodotto (k off) spesso limita la velocità della fase di stato del corso tempo. Il tasso di rilascio del prodotto (. / Ora v ss, conc) può essere determinato dalla pendenza della fase di stato lineare. La concentrazione di enzima attivo (E) è necessaria per convertire la velocità di rilascio del prodotto per una costante di velocità intrinseca dove k off = v ss / [E]. È importante sottolineare che la concentrazione di enzima attivo è tipicamente inferiore alla concentrazione misurata proteina causa di impurità, enzima inattivo, enzima non legato a produttivamente substrato, e il metodo utilizzato per determinare la concentrazione di proteina. La concentrazione di enzima attivo può essere determinata dalla ampiezza scoppio quando rilascio del prodotto è lenta. Così, estrapolando un corso a tempo di stato stazionario pertempo zero fornisce una stima di enzima attivo necessari per calcolare k off (rilascio del prodotto) dal tasso di steady-state osservato.
Per misurare la cinetica di scoppio, un approccio pre-stazionario è necessario seguire la formazione del prodotto durante la prima rotazione che avviene prima della fase di stato lineare. La cinetica di burst segue la formazione di enzima prodotto intermedio. Una volta che la reazione è avviata da miscelazione con substrato enzimatico, la quantità di enzima prodotto aumenta rapidamente finché la reazione raggiunge una fase di crociera. Se catalisi è molto più rapida di quella di rilascio del prodotto, l'ampiezza del burst è uguale enzima attivamente impegnati e l'approccio esponenziale osservata all'equilibrio (k obs) corrisponde al tasso di conversione chimica del substrato a prodotto, ipotizzando che il tasso inverso chimica è trascurabile.
In alcuni casi cy cataliticoaggrappano interferisce con un'analisi pre-steady-state, ad esempio quando le grandezze delle tariffe per la chimica e la release del prodotto non sono significativamente differenti. In questo caso, impiegando enzima eccesso rispetto al substrato impedisce ciclismo catalitica e limiti substrato legato con enzima per un singolo turnover. Pertanto, la prima fase della reazione chimica può essere isolato e accuratamente determinato come la costante di velocità di primo ordine (k obs). Questa costante tasso dovrebbe essere simile a K obs determinata da un approccio pre-stazionario sopra descritto.
Qui si descrive come questi approcci cinetici possono essere utilizzati per analizzare l'attività glicosilasi di OGG1.
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Protocol
1. Preparazione di enzima e substrato di DNA
- Over-express OGG1 come proteina di fusione GST-in E. coli, utilizzano il GST-tag per la purificazione, e quindi rimuovere il GST-tag per scissione con HRV-3C proteasi (Figura 1) 6.
- Acquistare la sintesi chimica 5'-6-carbossifluoresceina (6-FAM) oligonucleotide marcato contenente un singolo residuo di 8-oxoG e il suo complementare senza etichetta oligonucleotide filamento. Gli oligonucleotidi 34-mer contengono un 8-oxoG alla posizione 17 della 5'-end. Purificare questi oligonucleotidi mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.
- Preparare substrato DNA a doppio filamento contenente 8-oxoG miscelando 5'-6-FAM oligonucleotide marcato con il suo filamento complementare ad un rapporto molare di 1:1.2 ricottura in tampone (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Porre il tubo in un galleggiante in acqua bollente per 5 min. Lasciare il tubo in posizione e poi lasciare che l'acqua fredda lentamente per rTemperatura di oom (questo dura circa 2 ore).
- Eseguire la preparazione del campione e l'esperimento in condizioni di scarsa o minima di luce in modo da minimizzare photobleaching del marcatore fluorescente.
2. Misurazione dello stato stazionario decorso e le attività del sito Titolazione OGG1
2.1. Preparazione dei campioni e naturalmente il tempo di stato stazionario
- Preparare DNA substrato e OGG1 soluzioni separatamente nel tampone di reazione (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA e 0,1% di BSA) in provette da 1,5 ml microcentrifuga in ghiaccio. La concentrazione di DNA è di 400 nM e la concentrazione apparente di OGG1 è 30, 60, 90, o 120 nM come determinata mediante un saggio di proteina Bradford. Posizionare i tubi di reazione in un set di blocco termico a 37 ° C. Enzima pre-incubazione e soluzioni di DNA substrato separatamente a 37 ° C per 1 min.
- Avviare la reazione mescolando volumi uguali di soluzioni substrato OGG1 e DNA da pipettaggio. Dopo aver mescolato queste soluzionizioni 1:1 (v / v), le concentrazioni finali sono 200 DNA nM e 15, 30, 45, o 60 nM OGG1, rispettivamente. Rimuovere aliquote (10 pl) ad intervalli di tempo e spegnere la reazione mescolando con 1 ml di 1 M NaOH. Come controllo per i corsi a tempo, 10 microlitri della miscela di reazione senza enzimatica viene miscelata con 1 ml di 1 M NaOH.
- Posizionare i campioni di reazione in un blocco di calore ° C 90 per 5 min a fendere il prodotto risultante AP-site. Dopo il riscaldamento, aggiungere 1 ml di HCl 1 M per neutralizzare ogni campione.
- Aggiungere un uguale volume (12 ml) di tampone di caricamento del gel (95% formammide, 20 mM EDTA, 0.02% bromofenolo, e 0.02% xilene cyanol) per ogni campione di reazione, e quindi mettere il composto in un blocco di calore impostato a 95 ° C per 2 minuti, quindi inserire la provetta immediatamente in ghiaccio.
- Caricare i campioni (5 mL) su un gel di poliacrilammide denaturante 15% contenente 8 M urea in 89 mM Tris-HCl, pH 8.8, 89 mM di acido borico, e 2 mM EDTA. Il substrato ei prodotti spaccati sono ben separati dopocorrere il gel.
2.2. Imaging del gel
- Scansionare il gel utilizzando un imager che può rilevare il DNA marcato in modo fluorescente e visualizzare il substrato e le bande di prodotto.
- Quantificare le bande dopo l'imaging del gel. Si noti che alcuni sfondo scissione può essere osservato dopo il trattamento del substrato stesso con NaOH (Figura 2A). Sottrarre questo sfondo dalla quantità misurata di ciascun prodotto di reazione.
2.3. Analisi dei dati
- Tracciare la quantità di prodotto formato in ogni tempo di reazione (t) (Figura 2B). Analizzare i dati grezzi utilizzando l'equazione 1 per determinare l'ampiezza del burst (A 0, intercetta y) e la pendenza della fase di stato lineare (V ss).
- Tramal'intercetta rispetto alla concentrazione totale di proteine (cioè concentrazione dell'enzima apparente; Figura 2C), che fornisce una misura della frazione attiva di enzima. Utilizzare un adattamento lineare con intercetta zero per fornire il fattore di correzione per determinare la frazione di enzima attivo.
- Tracciare il tasso di stato stazionario rispetto alla concentrazione dell'enzima attivo (Figura 2D), fornendo il prodotto costante di dissociazione tasso (cioè inclinazione della linea adattata).
3. Misurazione del tempo di pre-steady-state del corso
Come mostrato in figura 2, la formazione del prodotto durante la fase di scoppio è troppo veloce misurare da miscelazione manuale e tempra. Quindi, uno strumento quench-flow rapido può fornire un metodo efficace per misurare reazioni rapide che si verificano sulla scala temporale millisecondo (Figura 3) 5. Lo strumento utilizza un motore controllato da computer per miscelare rapidamente unND placare reazioni dopo tempi di reazione specificate. Ad esempio, utilizzare un Kintek RQF-3 Rapid Strumento Quench-Flow per misurare la fase di scoppio iniziale e la successiva fase di stato di formazione del prodotto catalizzato da OGG1. Rapid Strumenti Quench-Flow sono disponibili da diversi produttori.
3.1. Preparazione del campione
A parte preparare il substrato di DNA e OGG1 soluzioni in provette da 1,5 ml, come descritto in 2-1. Le concentrazioni di DNA e OGG1 attivi sono 400 nM e 80 nM. Ciò determina concentrazioni finali di 200 DNA nM e 40 nM OGG1 attivo dopo miscelazione 1:1 (v / v).
3.2. Preparazione di un rapido strumento di quench-flow
- Collegare un bagno di acqua circolante al rapido Instrument quench-flow per il controllo della temperatura (37 ° C).
- Regolare i parametri dello strumento e selezionare il loop reazione appropriata per il tempo desiderato indica secondo istruzioni del produttorezioni. Le anse di reazione sono di lunghezza variabile per fornire tempi di reazione alternativi.
- Preparare tampone di reazione e di NaOH placare le soluzioni in 10 ml luer lock siringhe monouso e allegare queste siringhe alle porte DRIVE e caricare i serbatoi di azionamento con tampone di reazione (siringhe B) e 142 mM NaOH (siringa Q) (Siringa Valvole di carico in posizione di carico) . Per rimuovere le bolle d'aria dalla siringa, lavorano la soluzione avanti e indietro più volte.
- Abbassare il motore passo-passo fino a quando viene a contatto con la parte superiore delle siringhe (siringhe valvole di carico e valvole di carico di esempio in posizione FIRE).
- Lavare i loop di campioni, il ciclo di reazione, e l'uscita di linea con acqua e metanolo. Asciugare le zone arrossate completamente (valvole in posizione di incasso).
3.3. Naturalmente il tempo di pre-stazionario
- Fare un foro nella parte superiore di un tubo da 1,5 ml con tappo usando un ago 16-gauge. Collegare un tubo in uscita di linea per raccogliere la reazione bonificato.
- Impostare la reactio desideraton tempo (in secondi) utilizzando la tastiera. Il motore passo-passo il backup per regolare volume del loop in modo da mantenere il volume costante raffreddamento. Posizione pistoni per siringa B contro la piattaforma di motore passo-passo con l'aggiunta di buffer con le siringhe monouso fissato alle porte dell'unità.
- Riempire 1 ml luer lock siringhe monouso con substrato di DNA e OGG1 soluzioni, rispettivamente (valvole di esempio nella posizione di carico). Fissare siringhe con substrato di DNA e OGG1 soluzioni per ciascuno dei porti di carico del campione, e quindi riempire i loop di campioni con substrato di DNA e OGG1 soluzioni, rispettivamente (campione Valvole di carico in posizione di carico).
- Impostare tutte le valvole di carico siringa e campione Valvole di carico alla posizione di FUOCO. Avviare la reazione con un colpo della tastiera (ad esempio, premendo il tasto "START" "G" o). Substrato di DNA e OGG1 soluzioni (18 ml ciascuna) vengono immediatamente mescolati nel loop di reazione.
- Attendere fino a quando la reazione si spegne automaticamente nel momento in reazione desiderata mescolando 36 ml di rmiscela eaction con 86 ml di NaOH 142 mm. Dopo tempra la reazione, il campione viene scaricata dal Exit Line.
- Regolare le valvole di carico siringa in posizione LOAD e il campione di carico valvole nella posizione di Flush. Lavare i loop di campioni, il ciclo di reazione, e l'uscita di linea con acqua e metanolo e asciugare come descritto in 3.2. Ripetere la procedura per ogni punto di tempo.
- Eseguire un esperimento di controllo senza enzima per determinare una correzione di fondo, che può essere fatto manualmente o con lo strumento rapid-quench. Per eseguire un controllo con lo strumento rapido raffreddamento, riempire il loop di esempio per il DNA con substrato di DNA, ma mantenere il loop del campione per OGG1 vuoto. Impostare il tempo di reazione, eseguire il mix e dissetare come descritto in 3.3.4-3.3.6.
- Lavare i loop di campioni e il ciclo di reazione con NaOH 2 M, 2 M HCl, acqua e metanolo e poi asciugare le linee lavati. Dopo aver impostato il motore passo-passo alla posizione iniziale, cambiare le valvole di carico siringa al positio LOADn e lavare i serbatoi di azionamento con acqua.
- Trattare i campioni bonifica reazione con calore, e poi substrato separato e DNA prodotto da 15% elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide come descritto in 2.1.
- Visualizzare e quantificare le bande sul gel come descritto in 2.2.
3.4. Analisi dei dati
Montare relativi tempi di formazione del prodotto mediante analisi di regressione non lineare ad una equazione con crescenti termini esponenziali e lineare (Equazione 2) forniscono la costante di velocità di primo ordine (k obs), l'ampiezza del burst (A 0), e un tasso lineare (V ss).
4. Tempo singolo fatturato Corso
- Preparare DNA substrato e OGG1 in provette da 1,5 ml separati come descritto in 2-1. La concentrazionezioni di DNA e OGG1 attivi sono 100 nm e 500 nm, rispettivamente; questo produce concentrazioni finali di 50 nm DNA e 250 Nm OGG1 dopo la miscelazione 1:1 (v / v).
- Preparare lo strumento di attenuazione del flusso rapido e la preparazione dei campioni di reazione come descritto in 3.2 e 3.3.
- Trattare i campioni della reazione bloccata con calore e sottoporli al 15% denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide al substrato e prodotti separato come descritto in 2.1.
- Visualizzare e quantificare le bande sul gel come descritto in 2.2.
- Montare le andamento nel tempo della formazione del prodotto di un singolo esponenziale per determinare la costante di velocità di primo ordine (k OBS) come indicato nella equazione 3.
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Representative Results
Analisi cinetica è costante viene eseguita utilizzando 200 nM DNA substrato e quattro differenti concentrazioni apparenti di OGG1 (15, 30, 45, e 60 nM), come determinato mediante un saggio di proteina Bradford 2. Relativi tempi di formazione del prodotto erano idonei ad una equazione lineare per determinare l'intercetta, che erano 2,2, 11, 15, e 26 nM, rispettivamente, relativi a ciascuna concentrazione di proteina (Figura 2B). L'Y-intercettazioni stati ulteriormente tracciate relativamente tra concentrazione proteica reale (Figura 2C). La frazione di enzima attivo è stata determinata essere 38% dalla pendenza della linea in Figura 2C. Per determinare il tasso di steady-state, v ss determinato dagli accoppiamenti lineari in figura 2B sono stati tracciati relativi alle y-intercetta (Figura 2D). La pendenza della linea in figura 2D era 0,0028 sec -1, che è equivalente alla velocità costante di dissociazioneper il prodotto AP-site e inciso AP-site formata da DNA glicosilasi / attività liasi.
Un corso di tempo pre-steady-state è stata seguita da 200 nm utilizzando DNA substrato e 40 nm attivi OGG1. I corsi momento della formazione del prodotto possono essere adatti ad una equazione con l'aumento dei termini esponenziali e lineare. Come mostrato in Figura 4, k obs e k off sono stati determinati per essere 0,75 sec -1 e 0,0055 sec -1, rispettivamente 2. L'ampiezza per la fase di scoppio (33 nM) è stato leggermente inferiore a quella prevista dalla concentrazione del OGG1 attiva aggiunta (40 nM). Ciò può essere dovuto al legame non specifico di OGG1 a DNA substrato che riduce il numero di molecole di enzima disponibili.
In condizioni di singolo-cifra d'affari, la reazione di escissione 8-oxoG fu terminato entro 6 sec (Figura 5) 2. La durata di formazione del prodotto potrebbe essere idoneo ad un singolo esponenzialeequazione e dato k obs di 0,74 sec -1. In particolare, l'ampiezza di formazione del prodotto era inferiore a 50 nM attesi aggiunti DNA substrato. Ciò potrebbe essere dovuto in parte al fondo clivaggio del DNA mediante NaOH-trattamento (Figura 2A) o la presenza di oligonucleotidi non ricotto substrato nella miscela di reazione.
Figura 1. Purificazione di OGG1 umana da E. coli. OGG1 Il gene umano è stato clonato in pGEX-6P-1 e overexpressed in BL21 (DE3). Corsia 1; cellule uninduced, corsia 2; cellule IPTG indotte, corsia 3; frazione proteica solubile, corsia 4; glutatione sepharose 4B, dopo incubazione con frazione proteica solubile, corsia 5, portata attraverso frazione dopo incubazione di glutatione Sepharose 4B con HRV 3C proteasi, corsia 6; flusso attraverso frazione dopo la rimozione di contaminanti dalla colonna Mono Q. Viene mostrata una fotografia del colore blu gel Coomassie.
Figura 2. Cinetica allo stato stazionario e sito attivo titolazione di purificato OGG1 2 OGG1 (15 Nm, 30 Nm; ○, □, 45 Nm, ◊, o 60 nm, ×). Stato incubato con 200 Nm substrato di DNA (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', dove X è 8-oxoG coppia con C) a 37 ° C per 1-30 min come indicato. Queste concentrazioni enzimatiche rappresentano concentrazioni di proteine apparenti basato su un saggio di proteina Bradford, quantificato da una curva standard di BSA. A, gel di poliacrilammide denaturante mostrano substrati separati (S) e prodotti (P). OGG1 (30 Nm) e 200 Nm D NA substrato è stato utilizzato per la reazione. B, andamento nel tempo della formazione del prodotto. I dati erano idonei ad una equazione lineare per determinare l'ampiezza della fase di scoppio (intercetta y) e un tasso apparente di rilascio del prodotto (pendenza). C, Terreno delle intercettazioni determinati dalle convulsioni lineari in pannello B rispetto a quello determinato mediante il saggio Bradford. La pendenza della linea corrisponde alla frazione di enzima attivo. La barra di errore indica l'errore di ampiezza dedotto da convulsioni lineari per la formazione del prodotto in pannello B. D, Terreno di piste determinati dalle convulsioni lineari nel pannello B rispetto alla concentrazione dell'enzima attivo. La barra di errore indica l'errore nella pendenza dedotto da accoppiamenti lineari per la formazione del prodotto in pannello B. La pendenza della linea corrisponde al tasso di stato stazionario (k off), 0.0028 sec -1.
Figura 3. Panoramica di Rapid Strumento Quench-Flow.
Figura 4. Cinetica pre-steady-state di escissione 8-oxoG da OGG1 2. OGG1 (40 Nm enzima attivo) è stato incubato con 200 Nm substrato di DNA (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', dove X è 8-oxoG coppia con C) a 37 ° C per 0-100 sec. La linea tratteggiata indica una estrapolazione della fase di stato. I dati erano idonei per l'equazione scoppio con ampiezza pari a 33 ± 0.89 nM, k obs pari a 0,75 ± 0,083sec-1, v s s pari a 0,18 ± 0,018 nM sec-1 e k off pari a 0,0055 ± 0,020 sec -1.
Figura 5. Cinetica fatturato singole di escissione 8-oxoG da OGG1 2. OGG1 (250 Nm enzima attivo) è stato incubato con 50 Nm substrato di DNA (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', dove X è 8-oxoG coppia con C) a 37 ° C per 0-60 sec. I dati sono stati adatti alla singola equazione esponenziale con k oss pari a 0,74 ± 0,015 sec -1. La linea tratteggiata indica l'ampiezza estrapolata (cioè prodotto a tempo infinito).
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Discussion
Gli approcci cinetici descritti qui delineare i metodi per definire le costanti cinetiche elementari. Se un corso di tempo di formazione del prodotto è bifasica con il primo turnover enzimatico verificano rapidamente, poi un passo dopo chimica è limitante durante le successive rotazioni catalitici. Nel caso del OGG1, primo turnover può essere misurata usando concentrazioni elevate di enzimi sia con limitatore (S <E) o alto (S> E) concentrazioni di DNA. Nel primo caso, la reazione è limitata ad un 'singolo turnover' e fornisce una misura del tasso catalitico al sito attivo dell'enzima. In quest'ultimo caso, molteplici fatturati enzimatiche sono valutati. Il burst di formazione del prodotto che si verificano durante il primo turnover fornisce una misura della manifestazione chimica al sito attivo dell'enzima, mentre fatturati successivi forniscono una misura del passo che limita ciclismo catalitico. Inoltre, l'ampiezza del burst di formazione del prodotto fornisce una misura di enzima attivamente impegnati. Questo deve essere noto al fine di calcolare il prodotto di dissociazione tasso costante dalla velocità di regime (k off = v ss / E). Per OGG1, il rilascio di DNA prodotto (costante cioè prodotto DNA dissociazione rate) limita ciclismo catalitico e il suo tasso a regime 7,8. Come mostrato in Figura 4, il prodotto DNA tasso costante di dissociazione (k off = 0.0055 sec -1) per OGG1 è di due ordini di grandezza inferiore al tasso catalitico osservato (k obs = 0,75 sec -1). Si tratta di una caratteristica cinetica comune di glycosylases DNA che le basi del DNA danneggiato accise per legare i loro prodotti (DNA con un sito abasic) saldamente in modo che il rilascio del prodotto è il tasso di limitare durante le misure allo stato stazionario 1,8-10. È importante sottolineare che misure di attività di steady-state in tal modo forniscono un modo semplice e diretto per determinare il DNA prodotto affinità di legame; minore attività suggerisce stretta prodotto binding.
Come descritto nella Figura 2 e Rappresentante dei risultati, la frazione attiva di enzima è determinata a essere il 38%. La frazione attiva è inferiore a quello determinato dalla concentrazione proteica, anche se l'enzima preparato è> 95% omogenea (Figura 1). Questo può essere dovuto al legame non specifico dell'enzima al substrato e / o il metodo di determinazione proteina che non può valutare con precisione la concentrazione di proteina vera (es. dosaggio delle proteine Bradford utilizza tipicamente siero albumina bovina come standard che non può essere una buona mimica per l'enzima di interesse). Alternativamente, concentrazione proteica può essere determinata da altri metodi o stimata  calcolato coefficienti di estinzione molare a 280 nm, come quella sviluppata da Gill e von Hippel 11.
Come mostrato nelle figure 4 e 5, la grandezza di k obs determinato from il corso di tempo pre-stato stazionario deve essere coerente con quello determinato da un esperimento unico fatturato. Il valore di k off dovrebbe essere anche sperimentalmente coerente tra metodi alternativi cinetici. Se, tuttavia, queste costanti di velocità sono diverse (ad esempio k off è diversa tra le condizioni di stato stazionario e pre-stazionario), diversi passaggi possono essere misurati da ciascun metodo e un nuovo modello dovrebbe essere considerato. Alternativamente, inibizione da prodotto o substrato deplezione possono influenzare la velocità di stato stazionario apparente in un corso di tempo pre-stazionario che contamina la porzione lineare.
Nella situazione in cui lo scoppio e le fasi di steady-state non sono ben separati (cioè k obs ~ k off), l'ampiezza del burst e le costanti di velocità osservati sono composti di costanti di velocità elementari per più passaggi 12. Inoltre, in caso di rilascio del prodotto è rapida (cioè k off> k OBS), l'andamento nel tempo della formazione del prodotto non è bifasico (prima fatturato e palle perse successive sono limitati dallo stesso passo, chimica). In questo caso, un esperimento singolo turnover può fornire una misura della catalisi.
Se un singolo approccio turnover è intrapreso per determinare un tasso catalitica intrinseca, enzima sufficiente deve essere utilizzato per assicurare che il legame non sia parzialmente tasso limitante. Analogamente, legame del substrato deve essere anche veloce in modo che il tasso di scoppio non è limitato da legame del substrato. Per verificare che legame enzima non è limitante durante un esperimento singolo turnover, il decorso temporale viene ripetuto con una concentrazione di enzima differente per confermare che il decorso temporale esponenziale non è alterato. Inoltre, poiché l'ampiezza del corso temporale raffica o singolo turnover è direttamente proporzionale enzima o concentrazioni di substrato, rispettivamente, le concentrazioni devono essere scelti so Loro possono essere misurati attendibilmente. Infine, occorre notare che quando il burst e stato stazionario tassi non sono ben separati, l'ampiezza scoppio sottostima la concentrazione reale enzima attivo 12.
La cinetica approcci sopra descritti fornire un metodo affidabile per isolare passaggi chiave durante i cicli di glycosylases DNA catalitica. Con queste costanti cinetiche di riferimento, l'influenza di alterata sequenza / struttura 1,13-18 DNA, residui attivi portale 19,20, ione metallico 21, o proteina accessoria cellulare su catalisi enzimatica o bicicletta può essere ora valutata 22-24.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Julie K. Horton per la lettura critica del manoscritto e il Dr. Rajendra Prasad per utili suggerimenti e discussioni. Porzioni di questa ricerca sono stati originariamente pubblicati nel Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "sequenza di DNA effetti di contesto sulla attività Glycosylase di Human Glycosylase DNA 8-oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Questo lavoro è stato sostenuto, in tutto o in parte, dal National Institutes of Health Research Project di Grant Z01-ES050158 nel programma di ricerca intramurale, NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
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