Corsi a tempo per l'attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.
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Articolo metodologico
Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity
In questo articolo
Sommario
Abstract
Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) accise il mutageno ossidativo lesione del DNA 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) dal DNA. Caratterizzazione cinetica di OGG1 è intrapresa per misurare i tassi di escissione 8-oxoG e rilascio del prodotto. Quando la concentrazione è inferiore OGG1 DNA substrato, andamento nel tempo della formazione del prodotto siano bifasici, una rapida fase esponenziale (cioè burst) di formazione del prodotto è seguita da una fase di stato lineare. Il burst iniziale di formazione del prodotto corrisponde alla concentrazione di enzima agganciati bene sul substrato, e l'ampiezza scoppio dipende dalla concentrazione di enzima. La costante del burst di velocità di primo ordine corrisponde alla frequenza intrinseca di escissione 8-oxoG e il tasso di stato stazionario lento misura il tasso di rilascio del prodotto (prodotto di DNA tasso costante di dissociazione, k off). Qui, descriviamo approcci allo steady-state, pre-steady-state, e single-fatturato di isolare e misurare sppassi ecific durante OGG1 ciclismo catalitico. Un oligonucleotide marcato fluorescente lesione contenente OGG1 purificati e sono utilizzati per facilitare misurazioni cinetiche precise. Poiché le concentrazioni enzimatiche basse sono utilizzate per effettuare misurazioni di stato stazionario, manuale miscelazione dei reagenti e tempra della reazione può essere eseguita per accertare il tasso di stato stazionario (k off). Ulteriormente, estrapolazione del tasso steady state ad un punto in ordinata al tempo zero indica che un burst di formazione del prodotto è verificato durante la prima turnover (cioè intercetta è positivo). La costante della fase di scoppio esponenziale di velocità di primo ordine può essere misurata usando una tecnica di miscelazione e tempra rapida che esamina la quantità di prodotto formato ad intervalli di tempo brevi (<1 sec) prima della fase stazionaria e corrisponde al tasso di 8 -oxoG escissione (cioè chimica). Il passo chimica può anche essere misurata utilizzando un approccio a singolo giro d'affari in cui il ciclismo catalitica èimpedito saturando DNA substrato con l'enzima (E> S). Questi approcci possono misurare le costanti di velocità elementari che influenzano l'efficienza di rimozione di una lesione del DNA.
Introduzione
Un ambiente aerobico affretta instabilità genomica. Un grave lesione del DNA promutagena che si realizza derivanti da stress ossidativo è 7,8-diidro-8-oxoguanine (8-oxoG). Ciò è dovuto al potenziale codifica ambiguo di 8-oxoG. Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) è responsabile dell'avvio base di riparazione per escissione di 8-oxoG. L'attività glicosilasi di OGG1 accise della base 8-oxoG conseguente DNA prodotto con un sito apurinico (AP-site). Una debole attività liasi di OGG1 può incidere la AP-site in alcuni casi.
Caratterizzazione cinetica di glycosylases DNA trova generalmente tale da presentare i corsi tempo bifasico. ....
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Protocollo
1. Preparazione di enzima e substrato di DNA
- Over-express OGG1 come proteina di fusione GST-in E. coli, utilizzano il GST-tag per la purificazione, e quindi rimuovere il GST-tag per scissione con HRV-3C proteasi (Figura 1) 6.
- Acquistare la sintesi chimica 5'-6-carbossifluoresceina (6-FAM) oligonucleotide marcato contenente un singolo residuo di 8-oxoG e il suo complementare senza etichetta oligonucleotide filamento. Gli oligonucleotidi 34-mer contengono un 8-oxoG alla posizione 17 della 5'-end. Purificare questi oligonucleotidi mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.
- Preparare subst....
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Risultati
Analisi cinetica è costante viene eseguita utilizzando 200 nM DNA substrato e quattro differenti concentrazioni apparenti di OGG1 (15, 30, 45, e 60 nM), come determinato mediante un saggio di proteina Bradford 2. Relativi tempi di formazione del prodotto erano idonei ad una equazione lineare per determinare l'intercetta, che erano 2,2, 11, 15, e 26 nM, rispettivamente, relativi a ciascuna concentrazione di proteina (Figura 2B). L'Y-intercettazioni stati ulteriormente tracciate relativ.......
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Discussione
Gli approcci cinetici descritti qui delineare i metodi per definire le costanti cinetiche elementari. Se un corso di tempo di formazione del prodotto è bifasica con il primo turnover enzimatico verificano rapidamente, poi un passo dopo chimica è limitante durante le successive rotazioni catalitici. Nel caso del OGG1, primo turnover può essere misurata usando concentrazioni elevate di enzimi sia con limitatore (S E) concentrazioni di DNA. Nel primo caso, la reazione è limitata ad un 'singolo turn.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Julie K. Horton per la lettura critica del manoscritto e il Dr. Rajendra Prasad per utili suggerimenti e discussioni. Porzioni di questa ricerca sono stati originariamente pubblicati nel Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "sequenza di DNA effetti di contesto sulla attività Glycosylase di Human Glycosylase DNA 8-oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Questo lavoro è stato sostenuto, in tutto o in parte, dal National Institutes of Health Research Project di Grant Z01-ES050158 nel programma di ricerca intramurale, NIEHS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| 5'-6-FAM possono essere utilizzati anche oligonucleotidi marcati contenenti un singolo | Eurofins MWG Operon | 5'-P32. Si consiglia il grado di purificazione del gel di poliacrilammide. | |
| oligonucleotidi non marcati (filamento complementare) | consiglia la purificazione di gel di poliacrilammide | Eurofins MWG Operon | |
| Siringa monouso BD Luer Lock da 1 ml | possibile utilizzare anche la siringa monouso BD Medical 309628 Lue Lock di altri fornitori. | ||
| Siringa monouso BD Luer Lock da 10 ml | È | possibile utilizzare anche la siringa monouso BE Medical 309604 Luer Lock di altri fornitori. | |
| Equipment | |||
| Bagno d'acqua circolante | Qualsiasi venditore | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | essere utilizzato anche da altri fornitori. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager di altri fornitori. | |
| sinergia | KaleidaGraph |
Riferimenti
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H.
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Ristampe e permessi
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