Summary
Tidsförlopp för glykosylaset aktiviteten av 8-oxoguanin DNA glykosylas är bifasisk uppvisar en explosion av produkten bildas och en linjär steady-state fasen. Använda släcka-flöde tekniker, det brast och steady-state priser kan mätas, vilket motsvarar excision av 8-oxoguanin och frisättning av glykosylaset från produkt-DNA, respektive.
Abstract
Humant 8-oxoguanin DNA-glykosylas (OGG1) skär ut den mutagena oxidativa DNA lesion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) från DNA. Kinetisk karakterisering av OGG1 görs för att mäta andelen 8-oxoG excision och produktlansering. När OGG1 koncentrationen är lägre än substrat-DNA, tidsförlopp för produktbildning är bifasisk, en snabb exponentiell fas (dvs. burst) av produktbildning följs av en linjär steady-state fas. Den initiala utbrottet av produktbildning motsvarar koncentrationen av enzym korrekt ingrepp på substratet, och den spruckna amplitud beror på koncentrationen av enzym. Den första ordningens hastighetskonstant av skuren motsvarar den inneboende frekvensen av 8-oxoG excision och den långsammare steady state hastighet mäter omfattningen av den produkt frisättning (produkt-DNA dissociationshastighet konstant koff). Här beskriver vi steady-state, pre-steady-state, och singel-omsättningen metoder för att isolera och mäta specific steg under OGG1 katalytisk cykling. En fluorescerande märkt lesion-innehållande oligonukleotid och renade OGG1 används för att underlätta exakta kinetiska mätningar. Eftersom låga enzymkoncentrationer används för att göra steady-state mätningar, manuell blandning av reagensen och släckning av reaktionen kan utföras för att fastställa den steady-state hastighet (koff). Dessutom indikerar extrapolering av steady-state-hastigheten till en punkt på ordinatan vid tiden noll som en skur av produktbildning skedde under det första omsättning (dvs. y-avskärning är positiva). Den första ordningens hastighetskonstant av den exponentiella brast fasen kan mätas med hjälp av en snabb blandning och härdning teknik som undersöker mängden produkt som bildas vid korta tidsintervall (<1 sek) innan steady-state fasen och motsvarar graden av 8 -oxoG excision (dvs. kemi). Den kemiska steget kan också mätas med hjälp av en enda omsättning strategi där katalytisk cykel ärförhindras genom att mätta substrat-DNA med enzym (E> S). Dessa metoder kan mäta elementära hastighetskonstanter som påverkar effektiviteten av avlägsnande av en DNA-skada.
Introduction
En aerob miljö skyndar genomisk instabilitet. En stor promutagenic DNA som orsakats av oxidativ stress är 7,8-dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG). Detta är beroende på den oklara kodande potentialen hos 8-oxoG. Human 8-oxoguanin DNA glykosylas (OGG1) är ansvarig för att initiera reparation base excision av 8-oxoG. Glykosylaset aktivitet OGG1 klipper ut 8-oxoG bas resulterar i produkt-DNA med en apurinic webbplats (AP-site). En svag lyasaktivitet av OGG1 kan incisionsfilm AP-platsen i vissa fall.
Kinetisk karakterisering av DNA glykosylaser konstaterar generellt att de uppvisar bifasiska tidsförlopp. Efter en inledande snabb fas av produktbildning (dvs. burst) används en linjär steady-state fas observerades 1-3. Detta beteende är indikativt för ett steg som följer kemi (dvs. konformationsändring eller produkt frisättning) är hastighetsbegränsande under den linjära delen av tidsförloppet, medan borrenst fas, ofta kallad övergående fas, motsvarar produktens formation på enzymet aktiva under den första cykeln av reaktionen. När produktlansering är hastighetsbegränsande vid steady-state fas, aktivitet mätningar ger ett kvalitativt mått på produktens DNA-bindande affinitet, men ger inte kinetisk information om händelser på enzymet aktiva (dvs. kemi). Följaktligen är metoder för att isolera och mäta den exponentiella pre-steady-state burst fas behövs för att sondera händelser under första enzymatiska omsättning på enzymets aktiva säte 4.
Det finns tre vanliga kinetiska metoder för att karakterisera den katalytiska beteende OGG1, (1) steady-state, (2) pre-steady-state, och (3) singel-omsättningen. Dessa metoder skiljer sig från varandra med koncentrationen av enzymet i reaktionsblandningen och enzymet till substrat-förhållande användas i varje metod. I en typisk steady-state tillvägagångssätt,ibland kallad flera omsättning kinetik, är låga koncentrationer av enzym som används för att följa produktbildning. Substratet koncentrationen överstiger kraftigt enzymkoncentrationen så att flera enzymatiska omsättningar inte signifikant påverkar substratkoncentration. I denna situation bör tidsförlopp vara linjär och det är ofta svårt att urskilja om en skur skedde under det första omsättning på grund av den låga enzymkoncentrationen som används i denna strategi, observera att brista amplitud är ekvivalent med enzymkoncentrationen. Detta kan lösas genom att använda en högre enzymkoncentration och extrapolera den linjära tidsförloppet till noll tid att upptäcka om den första enzymatiska omsättningen skedde snabbt. Skärningen på ordinatan (y-axel) bör vara proportionell mot enzymets koncentration och tillhandahåller ett mått av enzymet aktivt ingrepp med substratet. Även om detta tillvägagångssätt kan i princip ge bevis för existensen av en skur fas, en annan strategi krävs för att mäta kinetiken för burst fas. I många fall den spruckna fasen är för snabb för att mäta genom manuell blandning och härdning tekniker. I denna situation, närmar pre-steady-state och singel-omsättningen kinetisk (dvs. övergående kinetiska) kräver ofta en snabb-blandning och härdning instrument för att följa tidiga tidpunkter i en reaktion 5. I en pre-steady-state tillvägagångssätt höga koncentrationer av enzym används så att en betydande mängd av produkt bildas under den första omsättningen. Eftersom flera omsättningar följs att observera katalytisk cykling (dvs. den linjära fasen som följer burst), är substrat koncentration större än enzymet koncentrationen ([enzym] <[substrat]). Att isolera händelser vid det aktiva stället för enzymet utan katalytisk cykling, är singel-omsättningen förhållanden utnyttjas. I detta fall är substratet mättad med enzym (E >> S), så att alla av substratet kommer att delta in 'enda omsättning "och uppvisar typiskt en enda exponentiell tid kurs.
Som noterats ovan för enzymer som uppvisar en skur fas, produkt release (koff) ofta begränsar hastigheten av steady-state-fas av tidsförloppet. Hastigheten för produkt frisättning (v ss, konc. / Tid) kan bestämmas från lutningen av den linjära steady state fas. Den aktiva Enzymkoncentrationen (E) behövs för att omvandla hastigheten av produktens övergång till en inneboende hastighetskonstant där k off = v ss / [E]. Huvudsakligen är det aktiva enzymet koncentrationen vanligtvis lägre än den uppmätta protein koncentrationen på grund av föroreningar, inaktivt enzym, enzym icke-produktivt bundet till underlaget, och den metod som används för att bestämma protein koncentration. Den aktiva enzymet koncentrationen kan bestämmas från brast amplituden när produktlansering är långsam. Således extrapolera en steady-state tidsförloppet tilltiden noll ger en uppskattning av aktivt enzym behövs för att beräkna k off (produkt frisättning) från det observerade steady-state hastigheten.
För att mäta kinetiken hos skuren, är en pre-steady state strategi som är nödvändig för att följa produktbildning under första omsättning som inträffar före den linjära steady state fas. Skuren kinetik följer bildandet av enzym-produkt intermediär. När reaktionen initieras genom att blanda enzymet med substratet, ökar mängden av enzymet-produkten snabbt tills reaktionen når ett stabilt tillstånd fas. Om katalys är mycket snabbare än produktlansering, är amplituden av skuren lika aktivt enzym och den observerade exponentiell förhållningssätt till jämvikt (k obs) motsvarar graden av kemisk omvandling av substrat till produkt, förutsatt att den omvända graden av kemi är försumbar.
I vissa instanser katalytisk cyklamra stör en pre-steady-state analys, såsom när storlekarna på priserna för kemi och produktlansering är inte signifikant. I detta fall, med användning av överskott av enzym i förhållande till substrat förhindrar katalytisk cykling och gränser substrat bunden med enzym vid omsättningen. Följaktligen kan den första kemiska steget av reaktionen isoleras och noggrant bestämmas som den första-ordningens hastighetskonstant (k obs). Denna Hastighetskonstanten bör likna k obs bestämdes från pre-steady-state som beskrivs ovan.
Här beskriver vi hur dessa kinetiska metoder kan användas för att analysera glykosylaset aktivitet OGG1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Framställning av Enzym och DNA Substrat
- Över-express OGG1 som ett GST-fusionsprotein i E. coli, utnyttja GST-taggen för rening, och sedan ta bort GST-taggen genom klyvning med HRV-3C-proteas (figur 1) 6.
- Köp den kemiskt syntetiserade 5'-6-karboxifluorescein (6-FAM) märkt oligonukleotid innehållande en enda 8-oxoG rest och dess komplementära omärkta oligonukleotidsträngen. De 34-mer oligonukleotider innehålla en 8-oxoG vid position 17 från 5'-änden. Rena dessa oligonukleotider genom polyakrylamidgelelektrofores.
- Förbered dubbelsträngat DNA-substrat innehållande 8-oxoG genom blandning märkt 5'-6-FAM-oligonukleotiden med dess komplementära sträng vid ett molförhållande av 1:1,2 i pamingsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) i ett 1,5 ml mikrofugrör. Placera röret i ett hopp i kokande vatten under 5 min. Låt röret på plats och sedan låta vattnet svalna långsamt till room temperatur (detta tar ungefär 2 h).
- Utför provberedning och experimentet under låga eller minimala ljusförhållanden för att minimera fotoblekning av fluorescerande märkning.
2. Mätning av Steady-State Tid Kurs och Active Site Titrering av OGG1
2.1. Provberedning och steady-state tidsförloppet
- Förbered DNA-substratet och OGG1 lösningar separat i reaktionsbuffert (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA och 0,1% bovint serumalbumin) i 1,5 ml mikrofugrör på is. Koncentrationen av DNA är 400 Nm och den skenbara koncentrationen av OGG1 är 30, 60, 90, eller 120 Nm som bestäms av en Bradford protein analys. Placera reaktionsrören i ett värmeblock inställd på 37 ° C. Pre-inkubera enzymet och DNA-lösningar substrat separat vid 37 ° C under 1 minut.
- Sätt igång reaktionen genom att blanda lika volymer av de OGG1 och DNA substratlösningar genom pipettering. Efter blandning dessa lösningartioner 01:01 (volym / volym), de slutliga koncentrationerna är 200 nM DNA och 15, 30, 45, eller 60 nM OGG1, respektive. Avlägsna alikvoter (10 | il) vid tidsintervaller och släcka reaktionen genom blandning med ett pl av 1 M NaOH. Som kontroll för tidsförlopp, 10 mikroliter av reaktionsblandningen utan enzym blandas med 1 pl 1 M NaOH.
- Placera reaktionskammaren proven i en 90 ° C värmeblock under 5 min för att klyva den resulterande produkten AP-site. Efter upphettning, tillsätt 1 pl av 1 M HCl för att neutralisera varje prov.
- Tillsätt en motsvarande volym (12 | il) av gelladdningsbuffert (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,02% bromfenol, och 0,02% xylencyanol) till varje reaktionsprov, och placera sedan blandningen i ett värmeblock inställt på 95 ° C i 2 min, sedan omedelbart placera röret på is.
- Ladda prover (5 | il) på en 15% denaturerande polyakrylamidgel innehållande 8 M urea i 89 mM Tris-HCl, pH 8,8, 89 mM borsyra och 2 mM EDTA. Substratet och de klyvda produkterna är väl separerade efterkör gelén.
2.2. Avbildning av gelén
- Skanna gelen med en imager som kan detektera fluorescerande DNA och visualisera underlaget och banden produkt.
- Kvantifiera banden efter avbildning gelén. Observera att en del bakgrund klyvning kan observeras efter behandling av själva substratet med NaOH (Figur 2A). Subtrahera denna bakgrund från den uppmätta mängden av varje reaktionsprodukt.
2.3. Dataanalys
- Plotta mängden av den bildade produkten vid varje reaktion tid (t) (Figur 2B). Analysera rådata med hjälp av ekvation 1 för att bestämma amplituden av skuren (A 0, y-axeln) och lutningen på den linjära steady state fas (V ss).
- Plotmed y-axeln i förhållande till den totala proteinkoncentrationen (dvs. skenbar enzymkoncentration, fig. 2C), vilket ger ett mått på den aktiva fraktionen av enzym. Använd en linjär anpassning med en nolla intercept att tillhandahålla korrigeringsfaktorn för bestämning av fraktionen av aktivt enzym.
- Plotta steady state räntan i förhållande till det aktiva enzymet koncentration (fig 2D), tillhandahåller produkten dissociationshastigheten konstant (dvs. lutning anpassade linjen).
Tre. Mätning av Pre-steady-state Tid Kurs
Såsom visas i figur 2, produktbildning under skuren fasen är för snabb för att mäta genom manuell blandning och härdning. Därför kan en snabb spolning-flöde instrument ger en kraftfull metod för att mäta snabba reaktioner som sker på millisekunder skalan (Figur 3) 5. Instrumentet använder en datorstyrd drivmotor att snabbt blanda ennd släcka reaktioner efter angivna reaktionstider. Använd till exempel en Kintek RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument för att mäta den initiala utbrottet fas och efterföljande steady-state fasen av produktens bildning katalyseras av OGG1. Snabba Quench-Flow Instruments finns från flera tillverkare.
3.1. Beredning av provet
Bered separat DNA-substrat och OGG1 lösningar i 1,5 ml rör enligt beskrivningen i 2-1. Koncentrationerna av DNA och aktiva OGG1 är 400 nM och 80 nM, respektive. Detta resulterar i slutliga koncentrationer av 200 nM-DNA och 40 nM aktiv OGG1 efter blandning 01:01 (volym / volym).
3.2. Framställning av snabbt härdande-flöde instrument
- Anslut en cirkulerande vattenbad till den snabba quench-flow instrumentet för temperaturreglering (37 ° C).
- Justera instrumentparametrarna och välj lämplig reaktion slingan för den önskade tiden pekar enligt tillverkarens instruktionertioner. Reaktionsprodukterna slingor är av variabla längder för att tillhandahålla alternativa reaktionstider.
- Förbered reaktion buffert och NaOH släcka lösningar i 10 ml Luer Lock engångssprutor och fästa dessa sprutor till enheten portar och ladda Drive Behållare med reaktionsbuffert (sprutor B) och 142 mM NaOH (spruta Q) (spruta laddventilerna i lastläget) . För att ta bort luftbubblor från sprutan, fungerar lösningen fram och tillbaka flera gånger.
- Sänk stegmotorn tills det når toppen av sprutorna (spruta laddventilerna och Sample laddventilerna i FIRE läge).
- Spola Sample loopar, den reaktionsslingan och utloppsledningen med vatten och metanol. Torka spolade områden fullständigt (ventiler i infällda läge).
3.3. Pre-steady-state tidsförloppet
- Gör ett hål i toppen av en försluten 1,5 ml rör med användning av en 16-gauge nål. Fäst ett rör på utloppsledningen för att samla in den kylda reaktionen.
- Ställ in önskad reaction tid (i sekunder) med hjälp av knappsatsen. Stegmotorn kommer att backa upp för att justera för slingan för att bibehålla konstant spärr volym. Position kolvar för spruta B mot stegmotorn plattform genom att buffert med engångssprutor ansluten till frekvensomriktaren Portar.
- Fyll 1 ml Luer Lock engångssprutor med DNA-substratet och OGG1 lösningar, respektive (prov ventiler i lastläget). Bifoga sprutor med DNA-substrat och OGG1 lösningar till varje port Sample Load, och sedan fylla Sample Loops med DNA-substrat och OGG1 lösningar, respektive (Sample laddventilerna i lastläget).
- Ställ alla ventiler Spruta belastning och Sample laddventilerna till positionen eld. Igång reaktionen genom en knappsats stroke (t.ex. tryck av "G" eller "START"-knappen). DNA-substrat och OGG1 lösningar (18 pl vardera) blandas omedelbart i Reaction Loop.
- Vänta tills reaktionen har automatiskt släckes vid den önskade reaktionstiden genom att blanda 36 | il av de reaction blandning med 86 pl 142 mM NaOH. Efter att ha dämpat reaktionen provet utmatas från utloppsledningen.
- Ställ ventilerna Spruta Load till lastens läge och provet lastregeleringsventil till flush positionen. Spola Sample loopar, den reaktionsslingan och utloppsledningen med vatten och metanol och torka enligt beskrivningen i 3.2. Upprepa ovanstående procedur för varje tidpunkt.
- Utför en kontroll experiment utan enzym för att bestämma en bakgrund korrigering, vilket kan göras manuellt eller med den snabba släcka instrument. För att utföra en kontroll med den snabba släcka instrument, fylla provslingan för DNA med DNA-substratet men behåll provslingan för OGG1 tom. Ställ reaktionstiden, utföra blandningen och släcka som beskrivs i 3.3.4-3.3.6.
- Tvätta provet loopar och reaktionen Loop med 2 M NaOH, 2 M HCl, vatten, och metanol och därefter torka de tvättade linjer. Efter inställning stegmotorn till utgångsläget, byta ventilerna Spruta belastning på LOAD position och tvätta Drive reservoarer med vatten.
- Behandla de kylda reaktionsprodukterna prover med värme, och sedan separat substrat och produkt-DNA med 15% denaturerande polyakrylamidgelelektrofores som beskrivs i 2.1.
- Visualisera och kvantifiera banden på gelén såsom beskrivits i 2.2.
3.4. Dataanalys
Montera tidsförloppen för produktbildning genom icke-linjär regressionsanalys till en ekvation med en stigande exponential-och linjära termer (Ekvation 2) som tillhandahåller den första ordningens hastighetskonstant (k obs), amplituden av skuren (A 0), och en linjär hastighet (V ss).
4. Single-omsättningen Tid Kurs
- Förbered DNA-substratet och OGG1 i separata 1,5 ml rör enligt beskrivningen i 2-1. Den koncentrationningar av DNA och aktiva OGG1 är 100 nM och 500 nM, respektive; detta ger slutkoncentrationer av 50 nM DNA och 250 nM OGG1 efter blandning 01:01 (volym / volym).
- Förbered snabbt släcka-flöde instrument och förbereda reaktionen prov som beskrivs i 3.2 och 3.3.
- Behandla de kylda reaktionsprodukterna prover med värme och utsätta dem för 15% denaturerande polyakrylamidgelelektrofores till separat substrat och produkter som beskrivs i 2.1.
- Visualisera och kvantifiera banden på gelén såsom beskrivits i 2.2.
- Montera tidsförloppen för produktbildning till en enda exponentiell att bestämma den första ordningens hastighetskonstant (k obs) som anges i ekvation 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Steady-state kinetisk analys utfördes med användning av 200 nM substrat DNA och fyra olika skenbara koncentrationer av OGG1 (15, 30, 45, och 60 nM) som bestämts med en Bradford proteinanalys 2. De tidsförloppen för produktbildning anpassades till en linjär ekvation för att bestämma y-axeln, som var 2,2, 11, 15, och 26 nM, respektive, i förhållande till varje protein koncentration (Figur 2B). Y-fångar fick ytterligare plottas i förhållande till varje faktisk protein koncentration (figur 2C). Fraktionen av aktivt enzym bestämdes till 38% från lutningen av linjen i figur 2C. För att bestämma den steady-state hastighet, v ss bestämdes från den linjära passar i figur 2B uppritades i förhållande till y-axeln (figur 2D). Lutningen av linjen i figur 2D var 0,0028 sek -1, vilket motsvarar dissociationshastigheten konstantför produkten AP-plats och incised AP-platsen som bildas av DNA glykosylas / aktiviteter lyase.
En pre-steady-state tidsförlopp följdes av att använda 200 substrat nM DNA och 40 nM aktiva OGG1. Tidsförloppen av produkten bildas kan passa till en ekvation med stigande exponentiella och linjära termer. Som visas i figur 4, off k obs och k bestämdes till 0,75 sek -1 och 0,0055 sek -1, respektive 2. Amplituden för burst fasen (33 nM) var något lägre än förutspått från koncentrationen av den aktiva OGG1 tillsattes (40 nM). Detta kan bero på icke-specifik bindning av OGG1 till DNA-substratet som minskar de tillgängliga antalet enzymmolekyler.
Under en enda omsättning förhållanden, var det 8-oxoG excisionsreaktionen klar inom 6 sek (Figur 5) 2. Tidsförloppet för produktbildning kunde passa till en enda exponentiellekvation och gav k obs av 0,74 sek -1. Noterbart var amplituden för produktbildning lägre än de förväntade 50 nM tillsattes DNA-substratet. Detta kan ha berott delvis på bakgrunden klyvning av DNA med NaOH-behandling (Figur 2A) eller förekomsten av oglödgad substrat oligonukleotider i reaktionsblandningen.
Figur 1. Rening av humant OGG1 från E. coli. Den humana OGG1 genen klonades in i pGEX-6P-1 och överuttrycks i BL21 (DE3)-celler. Bana 1, oinducerade celler, spår 2, IPTG-inducerade celler, bana 3, lösligt protein fraktion, spår 4, glutation Sepharose 4B efter inkubation med lösligt protein fraktion, spår 5, flöde genom fraktion efter inkubation av glutation Sepharose 4B med HRV 3C proteas, bana 6, flödet genom fraktion efter avlägsnande av föroreningar från Mono Q-kolonn. Ett fotografi av Coomassie Blue färgade gelen visas.
Figur 2. Steady-state kinetik och aktivt ställe titrering av renat OGG1 2 OGG1 (15 nM, ○, 30 Nm, □, 45 nm, ◊, eller 60 Nm, ×). Inkuberades med 200 nM DNA-substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', där X är 8-oxoG paras med C) vid 37 ° C under 1 till 30 min såsom anges. Dessa enzymkoncentrationer representerar uppenbara proteinkoncentrationer baserat på en Bradford-proteinanalys, kvantifieras från en BSA-standardkurva. A, Denaturering polyakrylamidgeler visar separerade substrat (S) och produkter (P). OGG1 (30 nM) och 200 nM D NA substrat användes för reaktionen., B tidsförlopp för produktbildning. Datan passar till en linjär ekvation för att bestämma amplituden av skuren fasen (y-axeln) och en skenbar hastighet av produktlansering (lutning). Relativt bestämt att C, Rita av fångar bestämdes från den linjära passar i panel B med Bradford-analysen. Lutningen på linjen motsvarar den fraktion av aktivt enzym. Felet bar betecknar felet i amplitud härledas från linjära passar till produkten bildas i panel B. D, Rita av backarna bestämdes från den linjära passar i panel B i förhållande till det aktiva enzymet koncentrationen. Felet bar betecknar felet i sluttningen härledas från linjära passar till produkten bildas i panel B. Lutningen på linjen motsvarar steady-state hastighet (koff), 0,0028 sek -1.
Figur 3. Översikt över Rapid Quench-Flow Instrument.
Figur 4. Pre-steady-state kinetiken för 8-oxoG excision från OGG1 2. OGG1 (40 nM aktivt enzym) inkuberades med 200 nM DNA-substratet (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', där X är 8-oxoG paras med C) vid 37 ° C under 0-100 sek. Den streckade linjen visar en extrapolering av steady-state-fas. Datan passar till burst ekvationen med en amplitud som är lika med 33 ± 0,89 nM, k obs lika med 0,75 ± 0,083sek -1, v s s lika med 0,18 ± 0,018 nM sek -1 och k off lika med 0,0055 ± 0,020 sek -1.
Figur 5. Enstaka omsättning kinetiken för 8-oxoG excision från OGG1 2. OGG1 (250 nM aktivt enzym) inkuberades med 50 nM DNA-substratet (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', där X är 8-oxoG paras med C) vid 37 ° C under 0-60 sek. Datan passar till den gemensamma exponentiell ekvation med k obs lika med 0,74 ± 0,015 sek -1. Den streckade linjen visar den extrapolerade amplitud (dvs. produkt vid oändlig tid).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kinetiska metoder som beskrivs här beskriva metoder för att definiera elementära kinetiska konstanter. Om ett tidsförlopp för produktbildning är bifasisk och den första enzymatiska omsättning inträffar snabbt, då ett steg efter kemi är hastighetsbegränsande under efterföljande katalytiska omsättningar. I fallet med OGG1 kan den första omsättningen mätas med användning av höga enzymkoncentrationer med antingen begränsande (S <E) eller hög (S> E) DNA-koncentrationer. I det första fallet, reaktionen begränsad till en "single-omsättning" och ger ett mått på den katalytiska hastigheten vid det aktiva stället av enzymet. I det senare fallet, finns flera enzymatiska omsättningar bedömas. Den explosion av produkten formation inträffar under den första omsättningen ger ett mått på den kemiska händelsen vid enzymets aktiva säte, medan efterföljande omsättning ger ett mått på det steg som begränsar katalytisk cykling. Dessutom ger amplituden för explosion av produkten bildas ett mått av aktivt enzym. Detta måste vara känd för att beräkna produkten dissociationshastigheten konstant från steady-state hastighet (koff = v ss / E). För OGG1, begränsar utsläpp av produkt-DNA (dvs. produkten DNA dissociationshastighet konstant) katalytisk cykling och dess steady-state ränta 7,8. Såsom visas i figur 4, är den DNA-produkten dissociation hastighetskonstant (koff = 0,0055 sek -1) för OGG1 två storleksordningar lägre än den observerade katalytiska hastigheten (k obs = 0,75 sek -1). Det är en vanlig kinetisk inslag i DNA glykosylaser att punktskattepliktiga skadade DNA-baser för att binda sina produkter (DNA med en abasisk plats) tätt så att produkten utgåvan är hastighetsbegränsande vid steady-state mätningar 1,8-10. Viktigt steady-state aktivitet mätningar ger därmed ett enkelt och okomplicerat sätt att avgöra produktens DNA-bindande affinitet, lägre aktivitet föreslår tätare produkt BINDANDE.
Såsom beskrivs i figur 2 och Representativa resultat, är den aktiva fraktionen av enzym bestämdes till 38%. Den aktiva fraktionen är lägre än den som bestämdes från proteinkoncentrationen, även om den framställda enzymet är> 95% homogent (figur 1). Detta kan bero på den icke-specifika bindning av enzymet till substratet och / eller metoden för proteinbestämning som kanske inte exakt bedöma den sanna proteinkoncentrationen (t.ex. Bradford proteinanalys använder normalt bovint serumalbumin som en standard som inte kan vara en bra härma för enzymet av intresse). Alternativt kan protein koncentrationen bestämmas med andra metoder eller uppskattas från ett beräknat molära extinktionskoefficienterna vid 280 nm såsom den utvecklats av Gill och von Hippel 11.
Som visas i figurerna 4 och 5, storleken på k obs bestäms from pre-steady-state tidsförloppet bör överensstämma med det som bestämts från en enda omsättning experiment. Värdet för koff bör också vara experimentellt konsekvent mellan alternativa kinetiska metoder. Om emellertid, är dessa hastighetskonstanter är olika (t.ex. koff är olika mellan steady-state och pre-steady-state förhållanden), kan olika steg mätas genom varje metod och en ny modell bör övervägas. Alternativt kan produktinhibering eller substrat utarmning påverka uppenbar stabilitet graden i en pre-steady-state tidsförloppet som förorenar den linjära delen.
I en situation där det brast och steady-state faser inte är väl separerade (dvs. k obs ~ k off), amplituden av skuren och de observerade hastighetskonstanterna är kompositer av elementära hastighetskonstanter för flera steg 12. Dessutom, är om produktlansering snabbt (dvs k off> k obs), den tid under produktens formation är inte bifasisk (första omsättning och efterföljande omsättning begränsas av samma steg, kemi). I detta fall kan en enda omsättning experiment ger ett mått på katalys.
Om en enda omsättning tillvägagångssätt genomföras för att fastställa en inneboende katalytisk hastighet, måste tillräckligt med enzym användas för att säkerställa att bindningen inte är delvis hastighetsbegränsande. Likaså måste substratbindning vara också snabb så att skurhastighet inte begränsas av substratbindning. För att kontrollera att enzymet bindningen är inte hastighetsbegränsande under en enda omsättning experiment, är tidsförloppet upprepas med ett annat enzym koncentration för att bekräfta att den exponentiella tidsförloppet inte ändras. Dessutom, eftersom amplituden av skuren eller enkelsidig omsättning tidsförloppet är direkt proportionell mot enzym eller substratkoncentrationer, respektive bör dessa koncentrationer väljas so de kan mätas tillförlitligt. Slutligen bör det noteras att när de spricker och steady-state priserna inte är väl separerade, underskattar brast amplituden den sanna aktiva enzymet koncentrationen 12.
Kinetiken tillvägagångssätt som beskrivs ovan ger en tillförlitlig metod för att isolera viktiga steg under den katalytiska cykling av DNA glykosylaser. Med dessa referensvärden kinetiska konstanter,, påverkan av förändrad DNA-sekvens / struktur 1,13-18 kan aktivt ställe resterna 19,20, metalljon 21, eller cellulära tillbehör protein på katalys eller enzym cykling nu utvärderas 22-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Julie K. Horton för kritisk läsning av manuskriptet och Dr Rajendra Prasad för användbara förslag och diskussioner. Delar av denna forskning publicerades ursprungligen i The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "DNA-sekvens Context Effekter på glykosylas aktiviteten hos humana 8-oxoguanin DNA-glykosylas." J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Detta arbete stöddes, helt eller delvis, av National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 i Interna forskningsprogram, NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A.
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
